Summary
Her beskriver vi en enkel protokol for hurtigt producere hundredvis af ødelægge vækst medier agar, 96-og kultur plader med et konsistent antal Caenorhhabditis elegans pr. brønd. Disse kulturer er nyttige for fænotypisk screening af hele organismer. Her fokuserer vi på ved hjælp af disse kulturer til skærmen kemikalier til Pro levetiden effekter.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en nyttig organisme til test kemiske virkninger på fysiologi. Hele organismen lille molekyle skærme giver betydelige fordele for at identificere biologisk aktive kemiske strukturer, der kan ændre komplekse fænotyper som levetid. Beskrevet her er en enkel protokol for at producere hundredvis af 96-og kultur plader med et nogenlunde ensartet antal C. elegans i hver brønd. Næste, vi angivet hvordan man bruger disse kulturer til skærmen tusindvis af kemikalier til effekter på levetiden for fyrretræsnematoden C. elegans. Denne protokol gør brug af temperatur følsom sterile stammer, agar plade betingelser og simple dyr håndtering for at lette hurtig og høj overførselshastighed produktion af synkroniserede animalske kulturer for screening.
Introduction
Her beskrives en protokol udviklet til high throughput screening af kemiske stoffer for effekter på Caenorhabditis elegans levetid. Selve protokollen er let at tilpasse til andre fænotypiske skærme, herunder undersøgelser udnytte reporter C. elegans stammer. Denne protokol blev med succes udnyttet til at identificere en roman biologisk aktive stof, NP1 (nitrophenylfosfat-piperazin 1), der kraftigt forlænger levetiden for C. elegans gennem en kosten restriktioner mekanisme. NP1 og en karakterisering af dens virkning på levetid, herunder en beskrivelse af den genetiske veje på spil, var tidligere beskrevet andetsteds1. Denne rapport indeholder også en beskrivelse af resultaterne af en omfattende gennemførelse af skærmen. Her beskrive vi meget mere detaljeret metodologi og opsætning af skærmen selv, som er skalerbar til både små og store applikationer.
De mål, der førte til oprettelsen af protokollen beskrevet her var at udvikle en C. elegans kultur platform, der er tilladt for den hurtige screening af store kemiske biblioteker for romanen biologisk aktive forbindelser. Mens kemiske skærme er foretaget forud for udviklingen af denne protokol, disse blev primært små og/eller kandidat type tilgange2,3. Faktisk, de fleste af skærmene udføres i laboratoriet på snesevis af forbindelser udnyttet stress modstand assays, med hits bliver screenet for levetiden effekter4. Denne undersøgelse søgte i stedet at direkte skærm for levetid effekter. Bemærkelsesværdigt, var der få beskrivelser i den videnskabelige litteratur på tidspunktet for udfører store kemiske skærme med C. elegans. Faktisk, i forhold til andre typer af skærme5,6,7, omfattende kemisk screening ved hjælp af C. elegans syntes at være under-ansat.
Der var to beskrivelser af stor skala kemiske skærme i C. elegans , som blev brugt som grundlag til at udvikle denne tilgang. Først af disse var en elegant undersøgelse fra Peter Roy laboratorium ved hjælp af kemiske skærme til at identificere stoffer, der kunne forurolige udviklingen af dyr. Undersøgelsen derefter følges op med en fremad mutagenese skærmen for at identificere de genetiske mål af disse kemikalier8. Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse anvendes 24-godt pates, som var simpelthen umuligt for denne undersøgelse specifikke behov (begrænsede mængder af kemikaliet i biblioteket og begrænset rådighed inkubator plads). Anden undersøgelsen var Michael Petrascheck ambitiøse og innovative små-molekyle skærm for levetid udvide kemikalier9,10. Denne undersøgelse bruges 384-godt plader og flydende kulturer. Den andre vigtigste funktion af denne skærm var brugen af FUDR (5-fluorodeoxyuridine) til kemisk hæmme afkom produktion. Efter store overvejelser af den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse, blev både kemiske sterilisation og flydende kulturer af C. elegans undgået.
Selvom FUDR er meget udbredt i C. elegans levetid eksperimenter, var der bekymring at FUDR kan forårsage uventede lægemiddelinteraktioner, eller at FUDR, selv kan have en vis virkning på levetid. For nylig er denne sidstnævnte bekymring blevet valideret, i det mindste på nogle koncentrationer og navnlig på 25 ° C11. For at omgå problemet med afkom forurening, C. elegans stamme TJ1060 blev brugt, som havne to uafhængige temperatur følsom mutationer (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) at afskaffe sperm produktion og har vist sig for at være nyttige for masse kulturer af synkron populationer12. Denne stamme var helt sterile ved 25 ° C, men vil producere afkom når kulturperler på 15-20 ° C. Denne undersøgelse anvendes konventionel dyrkningsbetingelser, med orm kravler på overfladen af agaren, som opnåede resultater med flydende kulturer ikke er altid reproducerbare med konventionelle agar plader. Mens dette fænomen ikke er helt forstået, er det blevet påvist, at orme kulturperler i flydende reagere på DR (kosten restriktioner) på en anden måde end orme kulturperler på standard medier13,14. Derfor er det plausibelt, at flydende medier kunne maskere nogle DR mimetics, der ellers ville blive identificeret med skærmen.
At have afgjort på agar dyrkningsbetingelser, blev anset for forskellige muligheder for scoring udførelsen af brønde i denne analyse. Mens forskellige automatiseret eller tænkelig baseret assays blev tilgængelig, nødvendiggjort de anskaffelse og implementering af teknisk udfordrende enheder, hvoraf de fleste var uoverkommeligt dyre. Samtidig overvejer disse muligheder, var det nødvendigt at henvise til tidligere levetid skærme af alle typer. I sidste ende, denne undersøgelse anvendes en scoring metode tilpasset fra Siu Sylvia Lee Labs samlede genom RNAi skærmen for levetid fænotyper15. Specifikt, alle levetid plader blev sat på samme måde, men kun de negative kontroller blev overvåget. Når negative kontrol pladerne blev bekræftet for at have nær komplet dødelighed, blev testplader scoret i hånden. I denne store skærm, blev positiver bekræftet af re-test med frisklavede kemikalier, ved hjælp af tre eksemplarer gentages i de primære positiver.
Protocol
1. forberedelse buffere
-
LB bouillon
- Bruge færdigblandede granulat (Se Materialer tabel) og følg producentens protokol for forberedelse.
-
Ødelægge vækst medier (NGM) Agar
- Bland 23 g agar, 3 g NaCl, 2,5 g af bacto pepton, og deioniseret vand til 0.972 L. autoklave og lad afkøle til 60 ° C, derefter tilsættes 25 mL 1 M kalium fosfat (KPO4) buffer (pH 6.0), 1 mL 1 M magnesium sulfat (MgSO4) , 1 mL 1 M calciumchlorid (CaCl2) og 1 mL af 5 mg/mL kolesterol (i ethanol).
-
Hypokloritiske løsning
- Bland 5 mL 5 M KOH, 4 mL af natriumhypochlorit løsning (6%), og deioniseret vand H2O til en samlet maengde paa 50 mL.
-
S basal
- Bland 5 g NaCl, 1 g K2HPO,4, 6 g KH2PO4og afioniseret vand til 1 L, derefter autoklave.
2. fremstilling af koncentreret E. coli (OP50)
Bemærk: Dette trin koncentrerer 1 L mættede E. coli løsning til 25 mL S basal buffer.
- Podes 5 mL autoklaveres LB bouillon (trin 1.1) med en enkelt koloni af E. coli (stamme OP50), og der inkuberes i 4-6 timer ved 37 ° C under omrystning (250 rpm). Bruge 0,1 mL af denne opløsning til podes 1 L af LB i en 2 L erlenmeyerkolben. Inkubér 1 L kolberne natten over (12-16 h) ved 37 ° C under omrystning (250 rpm).
- Der centrifugeres 1 L overnight kulturer i 500 mL centrifugeres flasker i 5 min på 10.000 x g og 4 ° C til pellet bakterier og dekanteres lager resterende medier. Resuspend pellet i 25 mL S Basal (trin 1.4). Opbevares ved 4 ° C.
3. forberedelse af NGM kultur plader
- Massekulturen plader anvendes til at producere store mængder af orme, dispensere 30 mL af smeltet (60 ° C) NGM agar (trin 1.2) i en laminar flow kabinet på 10 cm kultur plader med en automatiseret væske udlevering apparater eller en serologisk pipette. Lad tørre natten over.
- Afpipetteres 2 mL koncentreret OP50 på hver 10 cm tallerken, spredt helt dækker agar overfladen af vippe og roterende plade, lad derefter plader til tørre. Gemme plader ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Høj overførselshastighed assay kultur plader anvendes til screening, udnytte en automatiseret 8 kanal dispenser for at give afkald på 0,15 mL af smeltet NGM agar i hver brønd med en 96 godt plade i en laminar flow kabinet. Brug pleje at gøre sikker på, at brønde er blottet for bobler, som disse vil gøre det muligt gravende af orme, der vil gå på kompromis assay i så godt. Lad tørre natten over. Gemme plader ved 4 ° C i op til 2 uger.
4. forberedelse af temperatur følsom (ts) Sterile C. Elegans masse kulturer
- For at starte kulturer, ved hjælp af en 'orm pick' (et glas pipette med en vedhæftet platin tråd eller en fremstillede orm pluk) under et dissekere mikroskop, overføre 20 æg (stamme TJ1060: spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) på massekulturen skilte forberedt i trin 3.1. Derefter inkuberes plader ved 20 ° C i 6 dage (giver mulighed for mere end én generation af vækst, som du målretter for samling af afkommet af 20 æggene flyttes).
- Visuelt bekræfte tilstedeværelsen af fælderne voksne (æg i livmoderen) med et dissekere mikroskop. Indsamle de fælderne voksne ved dispensering S basal på pladen ved hjælp af et glas pipette 2-3 mL. Swirl væske omkring pladen i hånden og derefter indsamle væsken ind i en 15 mL rør ved hjælp af et glas pipette.
- Spin ned tube (1.000 x g for 1,5 min. ved 20 ° C) til pellet orme, så Aspirér off supernatanten. Tilføje 10 mL hypokloritiske løsning (trin 1.3) til orm pellet og hurtigt ryste røret ved håndkraft i retningen top til bund for 5 s. Incubate i 5 min, ryster hver 2,5 min.
- Igen spin ned tube (1.000 x g for 1,5 min); pellet bør gullig-brun. Opsug off supernatanten. Tilsæt 10 mL hypokloritiske løsning til æg pellet og ryst glasset. Inkubér 1-3 min, med lejlighedsvise ryster, og mens overvågningen udseende med dissekere mikroskop. Visuelt Bekræft kun æg er tilbage, og gå videre til næste trin.
- Spin ned tube (1.000 x g for 1,5 min) og Opsug off supernatanten. Pellet skal være hvid med ingen brun farve.
Bemærk: Efter fjernelse af den hypokloritiske løsning, er det kritisk at bruge steril teknik og buffere, eftersom forurening (bakterie- og svampeinfektioner, navnlig) kan ødelægge eksperiment, spilde værdifuld tid og reagenser. Denne undersøgelse anvendes et filtreret laminar flow kabinet og flyttede væsker benytter kun sterile pipetter og tips. - Åbne rør i en steril plads. Vask pellet 3 gange med S basal, spinning ned (1.000 x g for 1,5 min) og sugning væk supernatanten hver gang. Genopslæmmes æg pellet i 2-3 mL S basal. Disse æg kan nu anvendes til en overnight hatch i buffer til at indsamle L1 larver (trin 5).
5. rugeæg C. Elegans i bufferen til at få synkron kulturer (forberede L1 larver C. Elegans )
- Dekanteres æg pellet og buffer ind i et sterilt glas petriskål med et cover. Skyl de resterende æg fra røret i en skål ved hjælp af en serologisk pipette med 2-3 mL S basal. Der tilsættes 5 mL af S basal at lette fortrængning, som dette kan tilskynde rugeæg, som vil lyse ryster (20 rpm med en mavedanser orbitalryster). Der inkuberes natten over ved 20 ° C, for at give æggene tid til lugen (16-24 h). Alle hatchlings vil anholde på den 1st larve stadie (L1) på grund af manglende mad.
Bemærk: Anekdotiske beviser viser, at friske L1 præparater (16-36 timer efter ægudtagningen) generere de mest synkrone populationer af voksne orme. - Saml L1s i en 15 mL rør med en serologisk pipette. Spin ned L1s i en centrifuge (1.000 x g for 1,5 min), Aspirér væk supernatanten, og Gentag, indtil alle L1s er blevet indsamlet fra rugeæg plader, mens 10 mL S basal til næste trin.
- Fra røret indeholdende L1s, mikropipette ud 0,01 mL (umiddelbart efter blanding) og dispensere det på en unseeded (ingen E. coli) NGM plade. Tæl antallet af L1s på pladen. Gentage 10 gange og opnå et gennemsnit for antallet af L1s i hver delprøve. Generelt Forvent mellem 1-3 L1s pr. µL (når du starter med 1 massekulturen plade der indeholder 20 æg).
- Afgøre med en serologisk pipette S basal holder L1s mængde. Derefter ekstrapolere med den beslutsomme gennemsnitlige antal orme pr. 0,01 mL, opnået i det forrige trin til at anslå det samlede antal L1s. Generelt Forvent mellem 10.000-30.000 L1s (pr. massekulturen plade der indeholder 20 æg).
- Hvis du vil bruge denne kultur i 96-brønd assay, fortyndes L1 suspension til 1 L1 pr. µL i en steril runde media flaske, så fortsæt til trin 7. Hvis denne kultur er skal bruges til at generere yderligere C. elegans masse kulturer, derefter fortsætte til trin 6.
6. stor skala synkron kultur forberedelse
Bemærk: L1 løsninger kan bruges til hurtigt at øge orm populationer.
- For at generere store orm numre med en L1 løsning, dispensere op til 5.000 L1s på hver af de ønskede antal massekulturen plader. Indsamle fælderne voksne 2,5 dage senere (20 ° C), som beskrevet i trin 4.1-2, og Fortsæt til trin 4.3 at indsamle æggene.
- Som man har konstateret anekdotisk, der gentages hypokloritiske samling kan understrege den underkuede befolkningen, split populationer af æg picking til formering før underkaste den resterende befolkning til hypokloritiske behandlinger, så at flere generationer af befolkningen er ikke gentagne gange udsat for hypokloritiske løsning behandling.
7. opsætning af 96-brønd Assay plader
- Tillad assay plader (udarbejdet i trin 3.3) for at nå stuetemperatur. Derefter, i en laminar flow kabinet, tilsæt 5 µL af koncentreret OP50 (udarbejdet i trin 2.2) til hver brønd. Som før, bruge en automatiseret 8 kanal dispenser.
- Tilsæt 10 µL af L1 suspension til hver brønd ved hjælp af en automatiseret 8 kanal dispenser. Dette vil give på gennemsnitlig 10 orme pr. brønd, da de er til stede i suspension ved 1 L1 pr. µL. For at fremme ligelig fordeling af L1s fra gylle, dispensere L1s fra en runde media flaske aktivt blandet med en moderat langsomt drejning røre bar.
- Dække plade med låg, boks partier af plader, og der inkuberes ved 25 ° C i 2 dage.
8. behandling af 1 st dag voksen C. elegans med kemikalier
- Fjern kemiske bibliotek plader fra fryseren, og lad plader at nå stuetemperatur før du fortsætter.
Bemærk: Kemiske bibliotek plader som beskrevet her er 96 godt plader der indeholder diskrete forbindelser i hver brønd, som alle er i den samme koncentration og opløst i DMSO. Disse biblioteker udnytter ikke de udvendige kolonner, og så hver plade har et maksimum af 80 forskellige kemikalier. I protokollen beskrevet her, er bibliotek koncentration 10 mM. Det er vigtigt at overveje opløsningsmiddel effekter på fænotyper. Mens denne undersøgelse skærme i DMSO koncentration på 0,5%, blev denne plan aldrig overskrides i disse levetid assays og lav dataoverførselshastighed assays, hvor det er mere tilbøjelige til at vælge en sammensatte Stamopløsningens koncentration. Denne protokol overstiger ikke 0,25%, som er et niveau, hvor levetid ændringer ikke forekommer16, i det mindste i N2 stamme. - Ryst forsigtigt plade på 60 rpm på en mikrotiterplade shaker i 1 min. umiddelbart før anvendelsen.
- Ved hjælp af en automatiseret 96-brønd handleren, overførsel 0,75 µL af sammensatte (eller flydende DMSO) fra biblioteket plade til assay pladen. Dybden af pipette under flydende levering til assay plade styres omhyggeligt, således at pipette tips af flydende handleren leverer 0,75 µL volumen til ~ 15 µL af væsken på overfladen af agar (med orme og koncentreret OP50 fra trin 7.1 -2) og ikke punkteres agar overfladen i brønden. Brug ikke manual 8 eller 12 multi-kanal pipetter undtagen i meget små skærme (< 10 plader), da de kan øge fejl og ofte resultere i punktering af agar overfladen, som kompromiser analysen.
- Forberede kemiske bibliotek negativ kontrol plader med DMSO (dimethylsulfoxid), forudsat at bruger biblioteket bliver testet DMSO som opløsningsmiddel. Gøre 1 negativ kontrol plade for hver 5 test plader op til 10 negativ kontrol plader. Om muligt også gøre en positiv kontrol plade (NP11 på 20 mM, for en afsluttende assay koncentration på 0,1 mM, er effektivt til dette formål; Se repræsentant resultater afsnittet). Tilføj ikke kemikalier (test eller kontrol) til de 2 udvendige kolonner af pladerne, som de er særligt modtagelige for udtørring.
9. tørring kulturer
- For at fjerne væske fra overfladen af agaren, tørre plader i laminar flow kabinet for 4-8 h. Det er afgørende, at disse plader er tørret helt, men ikke blive udtørret. Som nogle plader vil tage længere tid at tørre end andre, nøje overvåge alle plader og fjerne så snart de er tørre. Bekræfte tørring ved omhyggelig besigtigelse af de individuelle brønde på pladen.
Bemærk: Afhængigt af faktorer, der omfatter udstødning hastigheden af kabinettet, den tid, det tager empirisk bestemmes. Trinnet tørring kan tage omkring 4-8 timer for en fuld fryser. - Forsegle plader med gennemsigtig film, og derefter sætte på pladen låg.
- Spin 96-brønd assay plader til 45 s på 1.000 x g.
- Store plader inverteret ved 25 ° C.
10. scoring C. Elegans kulturer for lang levetid
- Overvåge negativ kontrol plader indtil > 95% dødelighed er observeret. Kontrollere plader ugen i de første to uger og dagligt derefter. Caenorhabditis kohorter af samme stamme og arter kan vise væsentligt anderledes levetid ved retssag17.
Bemærk: For levetid analysen beskrives her, med TJ1060 dyr kulturperler ved 25 ° C, 95% dødelighed i disse populationer er opstået fra voksen dag 16-20. - Hvornår negative kontrolhullerne anses at have nået den > 95% mark, spin ned alle 96-brønd assay plader til 45 s på en bordplade centrifuge med en mikrotiterplade tilpasset rotoren (250 x g for 45 s ved 20 ° C).
- Score alle brønde i kontrol plader. Dette gøres ved at tælle og registrere antal levende og døde dyr i hver brønd. Døde orme kan differentieres fra levende orme af deres fuldstændige mangel på bevægelse. Provokere bevægelse i levende orme ved at droppe 96 godt pladen fra ca 7 cm dissekere overfladen, mikroskop mens du kigger gennem okularet for enhver evoked response. Døde orme ikke vil svare, og nærliggende lab kammerater kan ikke sætte pris på den gentagne støj.
- Testplader, tælle og registrere kun brønde der indeholder levende orme. Når en levende orm er observeret, tælle alle levende og døde dyr i at nå, godt holdning og plade.
Bemærk: Det er ofte nyttigt at re score plader efter > 99% af negativ kontrol orme er døde. I stor skala skærme, kan dette være den bedste punkt at gøre den første scoring. I begge tilfælde, score/re-score som beskrevet ovenfor
11. re-test forbindelser
- Når du tester kun et lille antal kandidat forbindelser (< 320 forbindelser), som med en ny test eller en kandidat skærm (Se repræsentative resultater), begrænse analysen til 32 centrale brøndene i et forsøg på at minimere mulige plade effekter. Dette efterlader 2 brøndene tættest på kanten af pladen ubehandlet men stadig indeholdende agar, mad og orme.
Representative Results
Vi begynder ved at undersøge repræsentative resultater fra at ansætte denne protokol til 96-brønd levetid assays. I det første eksempel metoden blev brugt til at screene gennem 30.000 kemikalier til med held identificere kemikalier, at forlænge levetiden for C. elegans, og omfatter også resultater fra de opfølgende re-test skærm for de bedste resultater kemikalier ved hjælp af den samme protokol. Disse resultater var tidligere beskrevet1. Det andet eksempel bruger samme protokol i en mindre målestok skærm af kandidat forbindelser.
Store skærm og teste igen: Den store skærm test 30.000 forbindelser blev udført på en enkelt dosis i to eksemplarer. Hvert kemikalie blev derfor testet i to brønde med en forventede samlede animalske population af 20. For at opnå dette, blev tre diskret sæt af 10.000 forbindelser (i duplikat) screenet over en periode på ~ 3 måneder til at dække de hele 30.000 forbindelser. Dette blev gjort en del for at sikre et overkommeligt beløb af manuelle scoring i slutningen af analysen og krævede i alt 260 af 96-brønd assay plader i hver af sæt. I biblioteket stock plader, kun 80 brønde indeholdt sammensatte; én replikat af 10.000 forbindelser gør 125 assay plader. Denne undersøgelse anvendes 2 replikater med 10 negativ kontrol plader i hvert sæt. For at øge gennemløb, blev plader scoret når negativ kontrol befolkninger blev vurderet at have oplevet ~ 99% dødelighed. Alle test wells blev derefter undersøgt for levende orme.
Kemikalier i brønde med en levende orm blev kaldt hits. Kemikalier i brønde, der indeholder mere end 1 orm i live var også kaldet hits, og desuden alle orme i disse brønde (levende og døde) blev talt for at generere en simpel score (procent i live score, antallet af levende orme divideret med antallet af døde orme). Hvert kemikalie i biblioteket kunne derfor kaldes et hit to gange og disse hits kunne, men kunne ikke, har scores forbundet med dem. 512 forskellige kemikalier blev kaldt hits (mindst en gang) fra skærmen på 30.000 forbindelser. Skærmen blev udført med henblik på at identificere potent og/eller robust (reproducerbare) Pro levetiden effekter. Disse to forskellige egenskaber kan have forskellige virkninger. Potente kemikalier kan dramatisk øge levetiden, i hvilket tilfælde vi forventer en høj procent af orme til at være i live i dette kemikalie godt. For robuste kemikalier, ville begge replikater forventes at have levende orme. Hitlisten blev rangeret baseret på disse kriterier. 179 af kemikalierne, der gav høj procent i Live scores, eller blev ramt i både replikater og blev derfor valgt til re-test. De fleste af de resterende kemikalier, der blev kaldt hits, men ikke markeret til re-test, havde kun indeholdt en enkelt orm i live i en af de Repliker brønde.
Re-test af hits var udført, svarende til den primære skærm undtagen med 3 flergangsbestemmelser (forventede samlede animalske population af 30) og omhyggelig kvantificering af levetid af dyr i ubehandlet kontrol plader. Disse ændringer blev føjet til støtte i sammenligning test og kontrol brøndene. 179 af de kemiske hits var igen bestilt, fortyndet til 10 mM, og flyttede ind i 96 godt plader. Kun de inderste 24 wells blev brugt til re-test analysen (aktuelle versioner af denne protokol ville have brugt de indre 32 brønde som beskrevet i afsnittet protokol for re-test skærme) og forbindelser blev igen testet i tre eksemplarer med seks negativ kontrol assay plader behandlet med DMSO opløsningsmiddel. En negativ kontrol plade blev scoret med jævne mellemrum for total overlevelse (fig. 1A). Når ca. 95% af kontroldyr var død, alle plader helt blev scoret (alle behandlet live og døde orme blev talt).
For at kalde hits fra ny test resultaterne, foregik en cut-off på den gennemsnitlige procentvise i live score af negativ kontrol + 2 standardafvigelser (SD). For test wells, i gennemsnit procent alive (på tidspunktet at score) noder blev beregnet ved at tage gennemsnittet procent i live score fra tre flergangsbestemmelser for hver brønd. For denne særlige assay, blev negativ kontrol wells' gennemsnitlig procent i Live scores beregnet som et gennemsnit af tre flergangsbestemmelser for 48 wells (2 sæt af tredobbelt negativ kontrol plader). SD plejede at kalde hits fra re-test kemiske sættet var SD på tværs af de 48 negativ kontrol gennemsnit procent i Live scores. Bruger denne strategi, denne undersøgelse fundet 57 hits fra biblioteket re-test 179 forbindelser, viser, at 32% af re-test kemikalierne i alt testet positiv (figur 1B). Udsmidningen af de gennemsnit procentvise i Live scores for de negative kontrol og test brønde er angivet at test wells udkonkurreret kontrolhullerne (figur 1C).
Kandidat skærm: Små skærme kan udføres på en måde svarende til retest beskrevet ovenfor. Her, beskriver vi resultaterne fra en kandidat skærm med 139 forbindelser. Disse kandidater blev samlet som strukturer vil kunne fremme lang levetid. For dette skærmbillede udførte vi 5 replikater af testplader på to forskellige doser (50 µM og 100 µM). Derudover brugte vi 8 negativ kontrol plader, med en enkelt positiv kontrol (NP1) plade der indeholder to forskellige doser; 50 µM og 100 µM.
Negativ kontrol plader blev overvåget indtil ~ 90% af dyrene var døde. På tidspunktet, blev wells scoret ved at tælle levende og døde orme i alle kontrolhullerne og fra test brønde, der indeholdt levende orme. Procent i live på tidspunktet at score blev brugt til at beregne gennemsnit procent i Live scores til hver brønd. For de negative kontroller havde 32 wells procent i Live scores fra 8 replikater. For den positive kontrol var der 4 godt scorer et gennemsnit på tværs af 4 flergangsbestemmelser for hver dosis. Hits blev kaldt til brønde med en gennemsnit procent i live score, der var større end den gennemsnit negativ kontrol procent i live score + 2 SD. Denne cutoff forlod 14 hits fra skærmbilledet kandidat og udelukket alle negative kontrolhullerne. Denne cutoff også medtaget alle af den positive kontrol wells behandlet på 100 µM og 50% af de positive kontroller behandlet på 50 µM. Disse resultater præsenteres her som arkiveret lodret i gennemsnit procent i Live scores for både de 50 µM (fig. 2A) og 100 µM (figur 2B) test skærme.
Endelig, alle plader var igen scorede på et sent tidspunkt, hvilket svarede til en tid, da mere end 99% af den negative kontrol behandlet dyr var død. Disse resultater angivet at positive kontrolhullerne langt ud udføres de negative kontrol og test brønde (figur 2C). Mens test wells var lidt bedre end de negative kontroller. Denne sidstnævnte resultat er partisk ved angivelse at mange af test brøndene syntes at udstille toksicitet i forhold til kontrol behandling (tabel 1), hvorved forstyrrende denne enkle fortolkning. Dette var forventeligt, da kandidat bibliotek var en sand skærm af kemikalier med ukendt biologisk aktivitet i C. elegans, mens skærmbilledet re-test var hovedsagelig pre screenet for forbindelser, der ikke var giftige. Da denne primære skærm var for forbindelser, der forlænget levetid, bør betydeligt giftige kemikalier ikke har været i re-test fastsat.
Figur 1 : Repræsentant resultat af en høj overførselshastighed skærmen og re-test
(A) efterladte kurven fra en repræsentativ negativ kontrol plade anvendes i re-test analysen. Denne kurve blev bygget fra scoring alle levende og døde orme i 24 brøndene anvendes i dette assay 4 gange i løbet af 18 dage af analysen. På dag 18 i voksenalderen, kontrol blev vurderet til at have ~ 5% overlevelse og alle kontrol test og plader blev derefter også scoret. (B) tabel sammenfatter resultaterne af skærmen og teste igen. (C) Binning af brønde i gennemsnit procent i Live scores for både kontrol og test betingelser fra skærmbilledet re-test. For kontrol, scores fra 48 brønde hver bestående af gennemsnittet af 3 replikater. Testresultater fra 179 brønde hver bestående af den gennemsnit score fra tre replikater. Figur 1 er gengivet fra en tidligere udgivelse1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant resultat af en kandidat skærm
(A) Binning af resultater fra skærmbilledet 50 µM kandidat. 139 test-og resultaterne repræsenterer den gennemsnit procentvise i live score fra 5 replikater. 32 negativ kontrolresultaterne består af gennemsnit procent i Live scores fra 8 replikater. 4 positiv kontrolresultaterne består af gennemsnit procent i Live scores fra 4 flergangsbestemmelser (16 i alt brønde indeholdende NP1 på 50 µM). (B) Binning af resultater fra skærmbilledet 100 µM kandidat. Alle er de samme som i (A), bortset fra at test brønde og positive kontroller blev behandlet på 100 µM koncentrationer. De samme negative kontrol plader er vist i både (A og B). (C) repræsentative resultater fra re scoring pladerne for en relativt ekstrem sent tidspunkt. Positive kontroller udkonkurreret dramatisk alle andre, hvis bare tegner sig for procent af brønde med levende orm på dette tidspunkt, som er forudindtaget mod test wells, som beskrevet i hovedteksten og tabel 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Udsmidningen af gennemsnit procent i live Scores | ||||||
| Grupperede Scores | Alle døde (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| Re-test | ||||||
| # af (-) kontrol | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| # af Test brønde (50µM) | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| Kandidat skærm | ||||||
| # af (-) kontrol | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| # af (+) styrer (50µM) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| # af (+) kontrol (100µM) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| # af Test brønde (50µM) | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| # af Test Wells (100µM) | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
Tabel 1: Repræsentant resultat af binning forskellige skærme
Her vil vi præsentere udsmidningen af de gennemsnit procentvise i Live scores fra de to skærme (re-test og kandidat). I skærmbilledet re-test peak er magen til den negative kontrol med re-test udkonkurrerer den negative kontrol dramatisk på højre (langlivede) side af bordet. Dette indikerer tilstedeværelsen af flere Pro levetiden forbindelser til stede i ny test sæt. I skærmbilledet kandidat ser vi, at peak er i kategorien alle døde mens der er også et tydeligt signal fra højre side af tabellen. Dette indikerer tilstedeværelsen af Pro levetiden forbindelser i kandidat-sæt, men angiver også tilstedeværelsen af betydelige toksicitet blandt kandidat sæt forbindelser.
Discussion
Her har vi beskrevet en simpel metode til dyrkning af C. elegans i 96-brønd plader. Vi beskriver disse kulturer til brug i kemisk screening og levetid assays, men de kan bruges til mange typer af assays. Mens multi godt kultur betingelserne for kemisk screening er tidligere blevet rapporteret8, herunder for levetid analyse10, analysen beskrives her adskiller sig på flere måder. Levetid analysen beskrives her udnytter 96-brønd plader, afhængig af sterile mutanter (i stedet for kemiske sterilisation), bruger agar dyrkningsbetingelser, bruger simpel flydende håndtering for at flytte orme og er manuelt scorede på slutpunktet. De forskellige metoder, der anvendes i dette assay kan være til hjælp for forskere søger screeningsmetoder, der omfatter disse betingelser.
Afgørende elementer i denne protokol center hovedsagelig på kvaliteten af pladerne fremstilles for analysen. Først, når du foretager plader er det bydende nødvendigt, at agar overfladen er fri af bobler og andre mangler. Disse variationer i agar overfladen føre næsten altid til gravende og tab af brønden. For det andet bygger denne protokol på goldning væsker deponeret gennemførelsesstadier setup og medicinering. Det er afgørende, at disse væsker er helt fjernet, men agaren ikke blive tørret ud. Anekdotisk, det ser ud til at orme i brønde, ikke der er helt tørret (svømning i væske) lever længere end ordentligt tørret wells, mens over tørring af pladerne fører til udtørring og revner i agar, hvilket fører til orm gravende og tab. Et andet afgørende element i denne protokol er at bevare sterile forhold. Som med enhver levetid assay, der er en masse arbejde involveret med opsætningen af pladen, og der findes mange muligheder og tid for assay ødelægger forurening for at bosætte sig og vokse på pladerne.
Mens levetiden analysen beskrevet her er nyttig for screening af forbindelser i C. elegans, er det begrænset til særlige genetiske baggrunde, som den bygger på en temperatur følsom (ts) sterile stamme; Vi brugte TJ1060, som har høj sterilitet penetrans. Dette begrænser de stammer, der er tilgængelige for screening med denne metode. Alternative metoder, herunder krydser ts sterile mutationer i ønskede baggrunden eller ved hjælp af kemiske sterilisation. Vi har ikke prøvet kemiske sterilisering med denne analyse, men det bør være muligt. Potentielle hurdler omfatter markedsføring af sterilizer ormene på det rigtige tidspunkt og i den rette dosis. Protokollen beskrevet bruger her en flydende dispenser, der er fast, men synes ikke at uddele voksne effektivt. Så disse orme udvikle på pladerne og derfor skal behandles med sterilisation kemiske på pladerne. Fastlæggelse af den optimale dosis og timing ville være vigtigt for succes. Alternative strategier omfatter brug af en udlevering metode, der kan flytte voksne. I fortiden, har vi konstateret, at maskiner kunne identificere og sortere voksne er generelt meget langsommere end de simple flydende handlere, som kan undvære homogen gylle af suspenderede larve.
Generelt bruger vi denne metode til hurtigt skærmen kemikalier og behandlinger for store positive virkninger på levetid. Metoden er særdeles effektiv, når det bruges med flere doser, høj kopiere numre, og nøje overvågning af negative kontroller, der er altid vedligeholdt og afbrudt blandt testplader. Positive kontroller er også nyttig, når designe og implementere de skærme, der er beskrevet i dette håndskrift. Men for at være en effektiv positiv, kontrol ønsker skal være temmelig potent og/eller meget robust. Når skærmen blev oprindeligt indsat, kunne en passende potent og robust stof ikke identificeres. I øjeblikket, er der mange rapporter i 'aldring' litteratur af sandsynlige kandidater til positive kontroller nyttige i de skærme, der er beskrevet her. Som beskrevet i afsnittet kandidat skærmen i afsnittet forventede resultater af dette manuskript, og i figur 2 og tabel 1, er den sammensatte NP1 en effektiv positiv kontrol for denne skærm. Vi bekræfter generelt positive hits fra disse skærme med standard levetid assays på 3 mm kultur plader.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at ingen finansiering enhed støtte dette arbejde havde nogen input på indsamling af data, analyse af resultater eller beslutningen om at offentliggøre.
Acknowledgments
Vi takker Dipa Bhaumik, Aaron Miller og Bob Hughes for teknisk bistand. Stammer blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi er taknemmelige for Georgien Woods og medlemmer af Lithgow, Kapahi og Melov Labs for nyttige diskussioner. M.L. blev støttet af National Institutes of Health (NIH) uddannelse Grant T32 AG000266 og en Ellison medicinsk Foundation/amerikanske Føderation for Aging Research Post-Doctoral Fellowship. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra BioAge Labs, giver Larry L. Hillblom Foundation tilskud samt National Institutes of Health, som UL1024917, støtte tværfaglig forskning konsortiet på Geroscience, og 1R01AG029631-01A1 til G.J.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
