Summary
التحقيق المتعددة، التعديلات بوستترانسلاشونال الذاتية لبروتين هدف يمكن أن تكون صعبة للغاية. الأساليب الموصوفة هنا الاستفادة من نظام المخزن المؤقت وتصفية تحلل أمثل وضعها مع محددة تستهدف PTM، تقارب مصفوفات للكشف عن أسيتيليشن، أوبيكويتينيشن، سومويليشن 2/3، والتيروزين الفسفرة التعديلات لهدف البروتين باستخدام نظام وحيد ومبسطة.
Abstract
الآن يحظى بتقدير جيد أن التعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) يلعب دوراً أساسيا في تنظيم هيكل ووظيفة، والتي قد تكون ضرورية لدور بروتين معين لكل من الناحية الفسيولوجية ومرضية للبروتين. وكثيراً ما ضروري إثراء بتمس عند التحقيق في حالة PTM البروتين المستهدف، لأن بتمس غالباً ما تكون عابرة ومنخفضة نسبيا في وفرة. هي واجه عثرات كثيرة عند إثراء ل PTM البروتين المستهدفة، مثل عدم التوافق في المخزن المؤقت، أضداد البروتين المستهدف غير المتوافقة مع الملكية الفكرية، وفقدان إشارة PTM وغيرها. درجة الصعوبة تتعاظم عند التحقيق بتمس متعددة مثل أسيتيليشن، أوبيكويتينيشن، سومويليشن 2/3، والتيروزين الفسفرة لبروتين هدف معين. دراسة تركيبة من هذه بتمس قد يكون ضروريا، كما الحديث المتبادل بين بتمس انتشارا وحاسمة بالنسبة للائحة البروتين. وغالباً ما يتم دراسة هذه بتمس في تحلل مختلف المخازن المؤقتة ومع تركيبة فريدة من نوعها المانع. لتبسيط هذه العملية، فريدة من نوعها يشوه تحلل وضع نظام أن فعالية يعزل ويحفظ هذه بتمس الأربعة؛ وبالتالي، تمكين التحقيق من الحديث المتبادل المحتملة في نظام تحلل واحدة. تم تصميم نظام تصفية فريدة من نوعها لإزالة تلويث الحمض النووي من، وهو منتج ثانوي إشكالية من يشوه المخازن المؤقتة. مصفوفات تقارب قوية تستهدف كل من بتمس أربعة وضعت بالتنسيق مع نظام المخزن المؤقت لتخصيب اليورانيوم والكشف عن الدول الذاتية في هذه بتمس الأربع إلى أقصى حد. أدوات الكشف عن PTM شاملة هذا يبسط عملية الحصول على معلومات هامة حول ما إذا كان تم تعديل بروتين بواحد أو أكثر من هذه بتمس.
Introduction
تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) هي تعديلات عالية التنظيم لبروتين، خلالها التعديل إضافة أو إزالتها بطريقة محددة. وغالباً ما بتمس التغييرات الديناميكية، عابرة أن يغير كثيرا من هيكل البروتين، والتفاعلات مع الشريك والبروتينات، والتعريب المكانية، وتمكن في نهاية المطاف البروتين لأداء مهام متميزة1،2 , 3 , 4-بتمس وفيرة حتى أنهم زيادة عدد أشكال البروتين فريدة من نوعها (أو بروتيوفورمس) من حوالي 30,000 الجينات المنتجات إلى ما يزيد على 1 مليون بروتيوفورمس5،6. تحديد بتمس وأثرها على بروتين المستهدف حاسم نحو فهم البروتين الوظائف الفسيولوجية والمرضية7،،من89،10، 11،12،،من1314. العمل على تحديد البروتينات مثل tubulin، p53، ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) توضيح أدوار تنظيمية بتمس15،،من1617. وكشفت هذه الدراسات أن تنظيم هذه البروتينات يحدث قبل بتمس متعددة، وفي كثير من الحالات هذه التعديلات العمل يدا واحدة لتعزيز وظيفة محددة. وقد أظهرت الدراسات الجديدة أن الحديث المتبادل PTM التعاونية وسلبية على السواء يمكن أن تحدث في عدة البروتينات المختلفة18،،من1920،،من2122، 2324،،25. ومع ذلك، ملامح PTM الأغلبية من البروتينات مبنية من العديد من الدراسات التي استخدمت نماذج مختلفة وظروف فريدة من نوعها. وجود نظام محسن للتحقيق بتمس متعددة في نظام واحد سيكون مفيداً للغاية للحصول على نظرة ثاقبة الحديث المتبادل PTM المحتملة لبروتين هدف.
واحد التحديات مع التحقيق بتمس في نظام واحد هو أن بتمس محددة يتم التحقيق في استخدام المخازن المؤقتة لتحلل متميزة. على سبيل المثال، قد يكون استخدام المخازن المؤقتة مثل المعهد الملكي أو NP-40 التي تستخدم عادة للتحقيقات الفسفرة أو أوبيكويتينيشن غير كافية لدراسة PTM مجا مثل يليشن الصغيرة مثل ubiquitin المعدل (سومو)26. بالإضافة إلى ذلك، غير يشوه المخازن المؤقتة غير كافية للنأي بتفاعلات البروتين، ويمكن أن يؤدي إلى تحديد هوية PTM إيجابية زائفة27. التحقيق بتمس في المخزن مؤقت الذي يشوه تحلل قد يكون من المفضل، كما هو أفضل بكثير في عزل البروتينات من جميع مقصورات الهاتف الخلوي28، سوف ننأى بمعظم تفاعلات البروتين، وسوف تحول دون البروتياز أن تغير الدول PTM، مثل ديسومويلاسيس 26؛ ومع ذلك، يشوه المخازن المؤقتة قد خرق سلامة الكواشف تقارب محددة مثل ubiquitin ملزمة الأدوات المستندة إلى المجال27. تطوير نظام يشوه الشبيهة بتحلل الدراسة بتمس متعددة من البروتين في نظام متوافق مع كاشف تقارب سيكون مفيداً للغاية للتحقيقات PTM الحديث المتبادل.
على الرغم من أن يشوه المخازن المؤقتة المزايا الرئيسية أكثر من المخازن المؤقتة غير يشوه للتحقيق بتمس، أنها تستخدم أقل شيوعاً بسبب سلبياتها كبيرة، مثل عدم التوافق مع فحوصات البروتين التقليدية، كبير الجينوم تلوث الحمض الخلوي الصبغي (DNA)، وتعطل الكواشف إيمونوبريسيبيتيشن (IP)29. يمكن أن يؤدي هذه العيوب في وقت إعداد الموسع والأضرار المحتملة للبروتينات المستهدفة عند قص الحمض النووي. وتشمل اثنين من الأساليب المستخدمة عادة لقص الحمض النووي حقنه تحلل و sonication29. كلا الأسلوبين تتطلب التحسين واسعة النطاق، وكثيراً ما تفتقر إلى إمكانية تكرار نتائج دقيقة. وتشمل أساليب بديلة لإزالة الحمض النووي إضافة دناسيس؛ ومع ذلك، قد يتطلب هذا التحسين الإضافية والتغييرات في تكوين المخزن المؤقت. وفي نهاية المطاف، طريقة بسيطة واستنساخه لإزالة التلوث الدنا الجينومي سيكون مفيداً عند العمل مع يشوه تحلل المخازن المؤقتة للتحقيقات PTM.
والهدف من هذا الأسلوب وضع نظام لعزل والتحقيق أوبيكويتينيشن (Ub)، التيروزين الفسفرة (pY)، سومويليشن 2/3 (سومو 2/3)، وبتمس acetylation (Ac) في نظام واحد للتحقيق أفضل PTM الحديث المتبادل لبروتين هدف. واستخدم هذا النظام كشف PTM لسرعة التحقيق الشخصية PTM الذاتية للعديد من البروتينات المستهدفة في نظام واحد. وكان ثاقبة جديدة الحديث المتبادل المحتملة المحددة30،31. وعموما، يحسن الأسلوب الموصوفة هنا في الأساليب الحالية للتحقيق في بتمس و PTM الحديث المتبادل بثلاث طرق مختلفة: 1) وضعت حاجزاً يشوه فريدة من نوعها بعزل البروتينات من جميع مقصورات الهاتف الخلوي، في حين لا يزال يجري متوافقة مع PTM تقارب الكواشف، 2) وضع نظام تصفية فريدة من نوعها بسرعة إزالة المجينية الحمض النووي التلوث من التشويه والتحريف ليساتيس مع إمكانية تكرار نتائج عالية ويتطلب أي معدات متخصصة، و 3) الخرز تقارب قوية، وتفسخ النظام، والمثبطة الكواشف متوافقة؛ وبالتالي، تبسيط عزلة هذه بتمس الأربعة لبروتين مستهدفة لزيادة إثراء PTM، ودراسة كفاءة الحديث المتبادل المحتملة.
Protocol
1-نموذج إعداد: خلية ثقافة
- تنمو أربع لوحات 150 مم من الخلايا A431 في المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين.
- تنمو الخلايا A431 إلى كونفلوينسي 50%.
- مصل تقييد أربعة ألواح من الخلايا A431 مع دميم خالية من المصل ح 24.
- التعامل مع لوحات اثنين من الخلايا A431 مع 33.3 ملغ/مل عامل نمو البشرة لترك حاء 1 لوحات اثنين آخرين دون علاج.
ملاحظة: شروط النمو وعلاج الخلية المعروضة هنا توفر مثالاً على ذلك؛ بيد أن هذه المنهجية ينطبق على العديد من أنواع الخلايا المختلفة وشروط المعاملة.
- إعداد بلاستر مخازن تحلل وتمييع مع مثبطات (الجدول 1). الجمع بين مل 2.895 بلاستر تحلل المخزن المؤقت مع 15 ميليلتر من تيروزين الفوسفاتيز المانع، 30 ميليلتر من ديوبيكويتيناسي ومثبطات ديسومويلاسي و 30 ميليلتر من هيستون deacetylase (هداك) المانع 30 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل.
- الجمع بين 9.65 مل من المخزن المؤقت لتمييع بلاستر مع 50 ميليلتر من تيروزين الفوسفاتيز المانع، 100 ميليلتر من ديوبيكويتيناسي ومثبطات ديسومويلاسي و 100 ميليلتر من هيستون deacetylase (هداك) المانع 100 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل.
ملاحظة: انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات التكوين ومثبط للمخزن المؤقت.
- الجمع بين 9.65 مل من المخزن المؤقت لتمييع بلاستر مع 50 ميليلتر من تيروزين الفوسفاتيز المانع، 100 ميليلتر من ديوبيكويتيناسي ومثبطات ديسومويلاسي و 100 ميليلتر من هيستون deacetylase (هداك) المانع 100 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل.
- من أجل إيقاف وسائل الإعلام الثقافة ووضع الخلايا على الجليد. ثم، تغسل الخلايا مرتين مع 10 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- قم بإزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن قبل إضافة المخزن المؤقت لتحلل بلاستر إلى أقصى حد ممكن تحلل الخلية.
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت.
- قم بإزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن قبل إضافة المخزن المؤقت لتحلل بلاستر إلى أقصى حد ممكن تحلل الخلية.
- إضافة 600 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل بلاستر لكل لوحة 150 مم. يستند مقدار المخزن المؤقت الغلة المتوقعة من البروتين (الجدول 2).
- الخلايا باستخدام مكشطة خلية. ليساتي ستصبح اللزوجة بسبب تحلل النووية.
- استخدام تلميح ماصة مقصوص 1 مل لنقل النفط الخام ليستي إلى عامل تصفية بلاستر التي وضعت في أنبوب جمع 15 مل (الشكل 1). وهنا، يستخدم أنبوب صقر 15 مل.
- استخدام المكبس عامل تصفية التي تم توفيرها لضغط عامل التصفية بلاستر تماما وجمع ليستي التدفق من خلال، بما في ذلك أي فقاعات، في أنبوب 15 مل (الشكل 1).
- اختياري: نقل توضيح إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة والطرد المركزي في 10,000 تقريبا x ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب صقر 15 مل جديدة.
- تمييع توضيح مع المخزن المؤقت لتمييع بلاستر إلى وحدة تخزين نهائي 3 مل لكل لوحة 150 مم. وحدة التخزين النهائي يستند على العائد المتوقع من البروتين (الجدول 2).
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتكوين المخزن المؤقت النهائي سوف تؤثر على صرامة رد فعل الملكية الفكرية. - كوانتيتاتي تركيز البروتين (القسم 2).
2-بروتين الإنزيم كوانتيتيشن
ملاحظة: تستخدم مقايسة كوانتيتيشن بروتين قياس ألوان قياسية لتحديد كوانتيتيشن البروتين. هنا، تحدد كوانتيتيشن البروتين باستخدام مقايسة البروتين المتقدمة الأحمر الدقة.
- أضف 1 مل كاشف مقايسة البروتين المتقدمة الأحمر الدقة إلى كل من اثنين 1 مل الترعة.
- ميكس 10 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل بلاستر وميليلتر 40 من المخزن المؤقت لتمييع بلاستر في أنبوب نظيف 1.5 مل ميكروسينتريفوجي على الجليد.
ملاحظة: هذا سيتم استخدام لقراءة العينة البروتين فارغة. - إضافة 20 ميليلتر من مزيج تحلل/إضعاف المخزن المؤقت (من الخطوة 2، 2) ومبومو والمزيج الأول بعكس مرتين إلى ثلاث مرات.
- إضافة 20 ميليلتر من الخلية المخففة ليستي (من تجربة) إلى ومبومو الثانية، خلط كما هو مذكور أعلاه.
- احتضان عينات لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- جهاز المطياف الضوئي فارغة مع المخزن المؤقت لتحلل/تمييع ميكس العينة (من الخطوة 2، 3).
- قياس امتصاص العينة ليساتي (من الخطوة 2، 4) 600 نانومتر.
- تحديد تركيز البروتين ليستي على النحو التالي؛
عينة من قراءة OD600 x 5 = تركيز البروتين في مغ/مل
ملاحظة: قراءات OD أدناه 0.05 أو أعلاه 0.5 بالقرب من قدرة مجموعة الخطي مقايسة البروتين. لقراءات > 0.5، يمكن أن تضعف العينات. لقراءات < 0.05، أكثر يمكن أن تضاف إلى الكاشف مقايسة البروتين المتقدمة الأحمر الدقة (تصل إلى 50 ميليلتر). انظر الجدول 3 لمضاعفات لتحويل قراءات جهاز المطياف الضوئي لتركيز البروتين ليستي ملغ/مل. إذا كان هناك عدم كفاية البروتين في لوحة واحدة، فإنه من المستحسن استخدام لوحات 2 أو أكثر في مجال الملكية الفكرية. وفي هذه الحالة، سوف تحصد لوحات في السلسلة، ونقل ميليلتر 300 الأصلي لتحلل العازلة بين الألواح. - استناداً إلى تركيز البروتين، تمييع عينة مع مزيج المخزن مؤقت (تحلل بلاستر الجزء 1: 4 أجزاء بلاستر تمييع) إلى تركيز نهائي المطلوب (عادة 1 ملغ/مل).
- الأداة الإضافية تجميد مختبرين للعينات التي لن يتم استخدامها فورا.
- تخزين العينات في-70 درجة مئوية.
- انتقل إلى القسم 3.
3-إيمونوبريسيبيتيشن (IP) الإنزيم
ملاحظة: تقارب تركيزات حبة وتركيزات ليستي، وأوقات الاحتضان هي أوصت المبادئ التوجيهية، وقد تكون فريدة من نوعها لكل البروتين المستهدف و PTM محددة يجري التحقيق فيها.
- عكس الأسهم كاشف الأنابيب المحتوية على الخرز التقارب Ub والخرز تقارب السنة التحضيرية سومو تقارب 2/3 حبات الخرز تقارب Ac عدة مرات التأكد من أن يتم تماما حراكه الخرز في الأنبوب.
- لكل فحص الملكية الفكرية، تعليق حبة الكوة في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة 1.5 مل على الجليد (أنبوب الملكية الفكرية). هنا، إضافة 20 ميليلتر من حبات تقارب ubiquitin 30 ميليلتر من فوسفوتيروسيني تقارب الخرز، 40 ميليلتر من سومويليشن تقارب 2/3 حبات أو 50 ميليلتر من حبات تقارب acetylation لأنابيب ميكروسينتريفوجي الفردية 1.5 مل على الجليد.
ملاحظة: انظر الجدول 4 للحجم الموصى به من تعليق حبة لاستخدام لكل حبة تقارب. - عكس الأسهم كاشف الأنابيب المحتوية على أوبيكويتينيشن الملكية الفكرية مراقبة الخرز والخرز مراقبة مفتش عدة مرات التأكد من أن يتم تماما حراكه الخرز في الأنبوب.
- التحكم اليكووت الخرز كل التحكم كرد فعل لتحديد ربط غير محددة (أنبوب مراقبة الملكية الفكرية). هنا، إضافة 20 ميليلتر من حبات التحكم Ub 30 ميليلتر من حبات التحكم بأي، 40 ميليلتر من السومو التحكم 2/3 حبات أو 50 ميليلتر من التيار المتردد التحكم الخرز لأنابيب ميكروسينتريفوجي الفردية 1.5 مل على الجليد.
ملاحظة: انظر الجدول 4 للحجم الموصى به من تعليق حبة لاستخدام لكل نوع من تقارب حبة. - حفظ كمية صغيرة من ليستي (20 ميليلتر) لتشغيل وصمة عار غربية إدخال التحكم ليستي. إضافة 5 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة x 5 ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت. - إضافة إلى كل أنبوب الملكية الفكرية والملكية الفكرية مراقبة أنبوب. هنا، تم استخدام 1 مغ من ليستي كل رد فعل الملكية الفكرية ومراقبة، أسفر عن ما مجموعة 8 ردود فعل الملكية الفكرية.
ملاحظة: من المستحسن 1.0 ملغ من كل مقايسة كنقطة انطلاق. مقدار الإرادة المطلوبة ليستي تختلف تبعاً لوفرة البروتين المعدل المستهدف. - احتضان هذه الأنابيب على منصة الدورية نهاية أكثر في 4 درجات مئوية عن ح 2. هنا، كان يستخدم المدورة أنبوب ATR سرعة 22.
- جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 5,000 س ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نضح قبالة المادة طافية قدر ممكن دون الإخلال بالخرز.
- أغسل حبات في 1 مل بلاستر يغسل المخزن المؤقت (مثبطات غير ضرورية في هذه المرحلة) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية بالتناوب منصة.
- جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 5,000 س ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نضح قبالة المادة طافية قدر ممكن دون الإخلال بالخرز.
- كرر الخطوة يغسل (الخطوات 3، 3، 10-12) مرتين أخريين.
- بعد الغسيل النهائي، تماما إزالة المادة العازلة طافية. أقل قدر من الاضطراب بيليه حبة مقبول (ما يصل إلى خسارة 5%). إزالة المتبقية باستخدام غرامة المادة طافية تتحمل البروتين تحميل تلميح.
- إضافة 30 ميليلتر من حبة شطف المخزن المؤقت، وريسوسبيند الخرز بالتنصت بلطف/التحريك على الجانب من الأنبوب. لا تستخدم ماصة في هذه المرحلة.
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت. - احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- بلطف بنقل كل تعليق حبة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي عمود دوران التي وضعت في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
ملاحظة: من المستحسن لقص نهاية الخروج من طرف ماصة نقل لنقل الطف. - الطرد المركزي في 9,000-10,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع العينة الملكية الفكرية.
- إضافة 2 ميليلتر من 2-mercaptoethanol لكل عينة ومزيج جيد.
ملاحظة: أنها مريحة المفاجئة الغطاء قبالة عمود الدوران واستخدام هذا إلى كاب أنبوب جمع لمزيد من المعالجة. - وضع العينات في حمام مائي 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5 جمع العينة باستخدام الطرد المركزي في 10,000 غ س ل 1 دقيقة في الرايت
- إذا لزم الأمر، تخزين العينات في-70 درجة مئوية ويتوقف هنا، أو الشروع في تشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ونقل، وتحليل لطخة غربية (القسم 4).
4-الغربية وصمة عار التحليل: تحديد البروتين للفائدة
- عينات منفصلة بالصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) ونقل إلى غشاء فلوريد (PVDF) الفينيليدن، وفقا للبروتوكولات القياسية مختبر32.
- استخدام جسم الأولية للكشف عن الإصدارات المعدلة بوستترانسلاتيونالي من بروتين الفائدة. هنا، استخدمت جسم PD-L1 للكشف عن بوستترانسلاتيونالي معدلة PD-L1.
- استخدام تشيميلومينيسسينسي أولتراسينسيتيفي الكشف عن الكاشف للكشف.
ملاحظة: يجب استخدام الكاشف تشيميلومينيسسينت بالاقتران مع جسم ثانوي المسمى HRP قادرة على اكتشاف الأجسام المضادة الأولية. - استخدام وحدة تخزين 2 مل من كاشف تشيميلومينيسسينت في غشاء نقل مصغرة الحجم جيل (8 × 7 سم تقريبا).
- بعد الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي المناسب (60 دقيقة في الرايت مستحسن)، غسل وصمة عار 6 × 10 دقيقة في 30 مل من المحلول الملحي تريس مخزنة مع توين-20 (تبسة).
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت. - فورا قبل الاستخدام، مزيج 1 مل كاشف تشيميلومينيسسينت أ مع 1 مل كاشف تشيميلومينيسسينت ب (كافية لغشاء واحد 8 × 7 سم).
- إضافة كاشف تشيميلومينيسسينت للغشاء واحتضان مع هزاز لطيف في RT 1-5 دقيقة قبل تصور إشارة البروتين باستخدام فيلم الأشعة السينية أو التصوير الكاميرا بجهاز اقتران (CCD).
ملاحظة: قد تكون أقصر حضانة في الكاشف تشيميلومينيسسينت اللازمة لوفرة عالية البروتينات.
- بعد الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي المناسب (60 دقيقة في الرايت مستحسن)، غسل وصمة عار 6 × 10 دقيقة في 30 مل من المحلول الملحي تريس مخزنة مع توين-20 (تبسة).
Representative Results
قدرة هذه الأدوات على التحقيق PTM الحديث المتبادل عن طريق الكشف عن فعالية هذه بتمس 4 تعتمد جزئيا على نظام المخزن المؤقت تحلل فريدة من نوعها. يعزل بلاستر المخزن المؤقت يشوه فعالية البروتينات من جميع مقصورات الهاتف الخلوي وبالمثل للمخازن المؤقتة يشوه الأخرى، مما يضمن ملف تعريف بروتين كامل (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحافظ على إشارات PTM مجا عالية مثل السومو 2/3، الذي يتناقص سريعاً في المخازن المؤقتة غير يشوه مثل الإنزيم راديويمونوبريسيبيتيشن (RIPA) (الشكل 2). الأهم من ذلك، عندما تضعف على نحو مناسب، فإنه لا يؤثر في سلامة الكواشف تقارب مثل مخازن يشوه أخرى (مثلاً، لايملي المخزن المؤقت).
عقبة هامة عند العمل مع المخازن المؤقتة يشوه هو القدرة على إزالة فعالية المجينية الحمض النووي التلوث. المنهجية التقليدية لتقليل اللزوجة القص الحمض النووي باستخدام إبرة محقن أو سونيكاتينج العينة. الشكل 3 ألف تبين المجينية الحمض النووي التلوث في الخلية A431 ليستي بعد العلاج بتصفية بلاستر، إبرة المحقن أو sonication. وهناك الإزالة الكاملة تقريبا للحمض النووي باستخدام عامل التصفية بلاستر، الذي ليس هو الحال استخدام إبرة الحقن التقليدية أو sonication. المجينية الحمض النووي التلوث يؤثر إلى حد كبير الهجرة البروتين من خلال هلام اكريلاميد مخزونات النشر الاستراتيجي؛ ومع ذلك، يزيل العلاج مع عامل التصفية بلاستر الحمض النووي، أسفر عن هجرة البروتين السليم (الشكل 3B). غيرت الهجرة الناجمة عن الجينوم الحمض النووي التلوث يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على تفسير للبقع الغربية؛ على سبيل المثال، نمط EGFR بقع ينظر في فلتر ليستي قد غير دقيق تفسر على أنها تعبير زيادة بالنسبة للعينة التي تمت تصفيتها (الشكل 3).
باستخدام هذا PTM تخصيب اليورانيوم والكشف عن النظام الأمثل، واحد سرعة تحديد إذا بروتين هدف هو تعديل بواسطة واحدة أو أكثر بتمس. التحقيق في ملف التعريف PTM PD-L1 أجرى مؤخرا باستخدام هذا الأسلوب، وأظهرت النتائج أن PD-L1 أوبيكويتيناتيد، أسيتيلاتيد، وتيروزين فوسفوريلاتيد ردا على مماثلة (الشكل 4). الأهم من ذلك، ذكرت هذه البيانات الذاتية PTM PD-L1 التغييرات، التي تمثل نسبة ضئيلة من مجموع المشتريات-L1 المحددة.
رقم 1: تصفية الحمض النووي من خلية ليستي مع تصفية بلاستر. تصفية "الصورة بلاستر" (A) . (ب) يتم تحميل ليستي في عامل التصفية الذي تم وضعه في أنبوب جمع 15 مل. (ج) يتم وضع المكبس في المحاقن وليستي يتم تمريرها من خلال المرشح بضغط. (د) جمع، بما في ذلك أي فقاعات عن طريق ضغط كاملة. (ه) تم تصفيته ليستي.
رقم 2: مقارنة بلاستر تحلل العازلة للمخازن المؤقتة لتحلل البديلة. الشكل 2 (أ) مقتبس من هرتا et al. 2017. بيوسسي . Rep. 31 (أ) تم تفكيك خلايا A431 مع بلاستر، المعهد الملكي، مبر، وتحلل الملكية الفكرية، يشوه (الحزب الديمقراطي الصربي 1%)، ومخازن تحلل لايملي. وقد ليساتيس يشوه كل الحمض النووي إزالتها باستخدام عامل تصفية بلاستر. وتحددت عزل البروتينات من غشاء هيولى، الميتوكوندريا، وعلامات النووية استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات علامة كل منها حجرة. (ب) تم تفكيك خلايا A431 مع بلاستر وريبا 1% الحزب الديمقراطي الصربي يشوه المخزن المؤقت. وكانت ليساتيس إيمونوبريسيبيتاتيد مع سومو 2/3 أو مراقبة مفتش تقارب الخرز. كانت مفصولة بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة عينات وتحليلها من قبل لطخة غربية استخدام جسم 2/3-الفجل البيروكسيديز (HRP) سومو. اسطوانات يقوم الممثل من N≥3 تظهر التجارب المستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: بلاستر تحلل عوامل التصفية فعالة في إزالة الدنا الجينومي. (أ) تم تفكيك خلايا A431 مع عازلة تحلل يشوه. تم إزالة الحمض النووي أو المنفصمة مع عامل تصفية بلاستر أو إبرة المحقن أو سونيكيشن لمدة 5 أو 10 أو 20 أو 30 ثانية. وقد تم تحليل % 2 اثيديوم بروميد, [اغروس] هلام التفريد. (ب) تفكيك من الخلايا A431 مع المخزن مؤقت يشوه أما فلتر أو تصفية مع عامل التصفية بلاستر. وتم فصل مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عينات وتصور استخدام أخذ وصمة عار. (ج) كانت تفصل عينات مكررة من ب صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ونقل إلى PVDF، وفحص البروتين EGFR استخدام جسم EGFR. تظهر البقع الممثل من التجارب المستقلة إيه ثري ن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الكشف عن التعديلات بوستترانسلاشونال لو فعل لشعبة المشتريات-L1- الشكل مقتبس من هوريتا et al. 2017. نيوبلسا30(A). كانت أما أونستيمولاتيد (UT) مقيدة بمصل الخلايا A431 أو حفزت مع لو لمدة ساعة واحدة قبل تحلل مع المخزن المؤقت لتحلل بلاستر. الاتحاد العالمي للعمل وقد تم تحليل مستويات PD-L1 (الممرات 1 و 2). واستخدمت الخرز ملزمة أوبيكويتين (UBA01) للملكية الفكرية أوبيكويتيناتيد البروتينات (الممرات 3 و 4). واستخدمت الخرز ملزمة فوسفوتيروسيني (APY03) للبروتينات تيروزين فوسفوريلاتيد الملكية الفكرية (الممرات 5, 6). واستخدمت سومو الملزمة 2/3 حبات (ASM24) للبروتينات IP سومويلاتيد 2/3 (الممرات 7، 8). أسيتيل يسين ملزمة الخرز (AAC01) استخدمت للملكية الفكرية أسيتيلاتيد البروتينات (الممرات 9 و 10). مفتش ملزمة تحكم الخرز واستخدمت للملكية الفكرية غير محددة ملزمة البروتينات (الممرات 11,12). كانت مفصولة بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة عينات وتحليلها من قبل لطخة غربية استخدام جسم PD-L1. ويرد ممثل وصمة عار من التجارب المستقلة إيه ثري ن. واستخدمت النجمة البيضاء لتسليط الضوء على pY PD-L1 ونطاقات البروتين التيار المتردد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| العمليات الحسابية للمخزن المؤقت لتحلل بلاستر | ||||
| مل 1.0 | مل 2.0 | مل 5.0 | مل 10.0 | |
| المخزن المؤقت لتحلل بلاستر | ميليلتر 965 | ميليلتر عام 1930 | مل 4.825 | مل 9.650 |
| تيروزين الفوسفاتيز المانع | 5 ميليلتر | 10 ميليلتر | 25 ميليلتر | 50 ميليلتر |
| المانع دي-أوبيكويتيناسي/دي-سومويلاسي | 10 ميليلتر | 20 ميليلتر | 50 ميليلتر | 100 ميليلتر |
| المانع هداك | 10 ميليلتر | 20 ميليلتر | 50 ميليلتر | 100 ميليلتر |
| مثبط البروتياز كوكتيل | 10 ميليلتر | 20 ميليلتر | 50 ميليلتر | 100 ميليلتر |
| العمليات الحسابية للمخزن المؤقت لتمييع بلاستر | ||||
| مل 4.0 | مل 8.0 | مل 20.0 | مل 40.0 | |
| المخزن المؤقت لتحلل بلاستر | مل 3.86 | مل 7.72 | مل 19.3 | 38.6 مل |
| تيروزين الفوسفاتيز المانع | 20 ميليلتر | 40 ميكروليتر | 100 ميليلتر | 200 ميليلتر |
| المانع دي-أوبيكويتيناسي/دي-سومويلاسي | 40 ميكروليتر | ميليلتر 80 | 200 ميليلتر | 400 ميليلتر |
| المانع هداك | 40 ميكروليتر | ميليلتر 80 | 200 ميليلتر | 400 ميليلتر |
| مثبط البروتياز كوكتيل | 40 ميكروليتر | ميليلتر 80 | 200 ميليلتر | 400 ميليلتر |
الجدول 1: تحلل وتمييع المخزن المؤقت إعداد المخطط- مخطط توفير تركيزات مثبطات لإضافة لتحلل وتمييع المخزن مؤقت حجم معين عند إعداد المخازن لتحلل الخلية.
| لوحة من البروتين | حجم "المخزن المؤقت لتحلل بلاستر" الموصى بها | وأوصى حجم "المخزن المؤقت لتمييع بلاستر" |
| < 1 ملغ | الجمع بين البروتين من لوحات متعددة | جعل وحدة التخزين النهائي 1.5 مل |
| 1-2 مغ | 300 ميليلتر | جعل وحدة التخزين النهائي 1.5 مل |
| 2-4 ملغ | 600 ميليلتر | لجعل المجلد 3 مل النهائي |
| 4-6 ملغ | ميليلتر 900 | جعل وحدة التخزين النهائي 4.5 مل |
الجدول 2: بلاستر تحلل/إضعاف المخزن المؤقت المخطط- تقديم المخطط أوصى تحلل وتمييع حجم المخزن المؤقت عند الحصول على ليستي.
| حجم الخلية ليستي إضافة إلى 1 مل كاشف "مقايسة البروتين الأحمر الدقة" (ميليلتر) | المضاعف لاستخدامها مع نموذج القراءة OD600 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
الجدول 3: مضاعفات لتحويل قراءات جهاز المطياف الضوئي بملغ/مل ليستي. مخطط توفير أرقام التحويل إلى مساعدي مع حساب تركيز البروتين.
| تقارب الخرز | حجم حبة الملاط/IP (mL) |
| أوبيكويتيناتيون | 20 |
| فوسفوتيروسيني | 30 |
| سومويليشن 2/3 | 40 |
| أسيتيليشن | 50 |
| مراقبة الخرز | حجم حبة الملاط/IP (mL) |
| أوبيكويتينيشن تحكم الخرز | 20 |
| فوسفوتيرسويني تحكم الخرز | 30 |
| سومويليشن الخرز التحكم 2/3 | 40 |
| أسيتيليشن تحكم الخرز | 50 |
الجدول 4: وأوصى حجم المخطط الخرز/الملكية الفكرية- تقديم المخطط أوصى كميات من الخرز تقارب استخدام لكل رد فعل الملكية الفكرية.
Discussion
يمكن تنفيذ النهج الأولية المستخدمة لتحديد إذا كان بروتين هدف هو تعديل بواسطة PTM باستخدام الأجسام المضادة المحددة البروتين المستهدف للملكية الفكرية، تليها لطخة غربية مع جسم PTM (مثلاً.، يسين أسيتيل المضادة)، أو باستخدام جسم PTM للملكية الفكرية، تليها لطخة غربية مع الهدف البروتين جسم معين30،،من3133. بينما يعمل كلا النهجين نظرياً، استخدام جسم محددة الهدف البروتين قد أكثر المزالق المحتملة، مثل الأجسام المضادة قد لا تكون الملكية الفكرية متوافقة، أو قد كتلة كبيرة PTM التعديلات على الموقع التعرف على جسم البروتين المستهدف34 ،35. وميزة الخرز تقارب PTM أن المجالات جسم أو ملزمة تعترف على وجه التحديد PTM الاهتمام؛ وهكذا، ينبغي أن لا تغير التعديلات للبروتين الهدف الاعتراف بالخرز تقارب. على سبيل مثال، قد حددت Ub PD-L1 مع الأسلوب الموصوفة هنا، ولوحظ كلا الذاتية مونو-وبولي-يو بي (الشكل 4). منشور صدر مؤخرا بيم وآخرون. تستخدم في المختبر Ub تقنيات التحقيق Ub PD-L1، وكانت النتيجة مشابهة جداً للنتائج هو موضح في الشكل 436. من المثير للاهتمام، أدوا أيضا الملكية الفكرية مع جسم PD-L1 لإثراء PD-L1 من الخلية، حيث كان أوفيريكسبريسيد Ub وأضيفت ملغ-132 لتعزيز الإشارات. نمط Ub لم تكن قوية ومتميزة للغاية من نمط Ub في المختبر . لم يتم إجراء التحقيق من Ub PD-L1 الذاتية في نماذج الثقافة الخلية في ليم وآخرون. التقرير لتوضيح الفرق بين البيانات خلية الثقافة و في المختبر .
التحقيق في ما إذا كان بروتين معدلة بواسطة PTM يمكن أن يكون تحديا، نظراً لوفرة منخفضة وطبيعة عابرة37،38، وغالباً ما يتطلب الإثراء من خلال الملكية الفكرية. الملكية الفكرية بتمس فعالة يتطلب الاستغلال الأمثل للعديد من الخطوات الرئيسية والكواشف، مثل المخازن المؤقتة لتحلل وتقارب الكواشف. عند التحقيق بتمس متعددة من البروتين المستهدف، يزيد من التحسين المطلوب عرضه. استخدام نظام تحلل بلاستر يعد خطوة حاسمة في هذا البروتوكول، كما أنها تحتفظ بقدرة الملكية الفكرية قوية، مع تمكين الكشف PTM pY وسومو 2/3، يو بي، و "التيار المتردد بتمس" في نظام واحد. يحسن هذا الأسلوب بالوقت والموارد اللازمة لتحديد إذا كان بروتين مستهدفة محددة يتم تعديلها بواسطة هذه بتمس أربعة، ويحتمل أن يقدم صورة أفضل عن PTM الحديث المتبادل بالنسبة لمقارنة النتائج PTM إجراء باستخدام العديد من أنظمة تحلل. وأجرى التحقيق في التوافق نظام تحلل بلاستر مع بتمس البديلة، مثل جليكوسيلاتيون،؛ ومع ذلك، لا قد درست مستفيض لجميع أنواع بتمس.
غزير الحمض النووي يمكن أن تتداخل مع البروتين القياسات باستخدام أما اللونية أو أساليب نانودروب، تؤثر هجرة البروتينات في هلام اكريلاميد الحزب الديمقراطي الصربي، ومنع التفاعل مصفوفة البروتين وتقارب خلال فحوصات الملكية الفكرية. ويستخدم الأسلوب الموصوفة هنا عامل تصفية متخصصة لفعالية إزالة التلوث الجينوم بالحمض النووي، الذي يعد خطوة حاسمة أخرى من هذا البروتوكول. لتسليط الضوء على هذه النقطة، أجريت اختبارات اللزوجة قبل وبعد العلاج تصفية بلاستر، وأظهرت النتائج انخفاضا من لزوجة عالية اللزوجة من المياه (البيانات لا تظهر). وأيد هذا التغير في اللزوجة النتائج في الشكل 3، تظهر كلها تقريبا الحمض النووي قد أزيلت. الأهم من ذلك، لا يتم المنفصمة الحمض النووي مع هذا الأسلوب، كما سوف يتم القبض على أي الحمض النووي المنفصمة لا بواسطة عامل تصفية (البيانات لا تظهر). هذه الأداة متفوقة على الأساليب التقليدية، مثل سونيكيشن أو حقنه-الحمض النووي القص، لأنه يتطلب أي معدات متخصصة، واستنساخه بدرجة عالية، ويزيل الحمض النووي بدلاً من قص عليه. وعلاوة على ذلك، فإنه سوف لا تتحلل البروتين في، الذي يمكن أن يحدث باستخدام الأساليب التقليدية في29. استخدام عامل التصفية يأخذ 5-30 ثانية كل عينة مقارنة بالأساليب البديلة حيث قد يستغرق عدة دقائق (أيحقنه القص) توزيع فعال للحمض النووي ويمكن أن يؤدي عدم تجانس عينة الملوثات الحمض النووي لا تزال في. تم إجراء تحليل مستفيض لتصفية بلاستر ليساتي ما قبل وما بعد، ولا يوجد فرق ملحوظ في التشكيل الجانبي للبروتين لوحظ بأخذ، محددة الهدف الغربي، أو مجموع ومحددة الهدف PTM التحليلات؛ وهكذا، تكامل الشخصية البروتين قد لا تأثرت بتصفية الحمض النووي. وفي نهاية المطاف، هذا النظام عامل تصفية مفيد لأي غربي أو تطبيق الملكية الفكرية فيها الحمض النووي الحالي وقد تؤثر على تفسير لتحليل البروتين.
من المهم أن نلاحظ أن هناك إمكانية للكشف عن سلبية زائفة استخدام هذا الأسلوب، الذي قد يعود في جزء منه إلى تقارب حبة التشبع أو تدخل الموقع ملزمة، أو إخفاء PTM. على سبيل المثال، قد يتم تعديل بروتين هدف معين بالتيار المتردد عند مستويات منخفضة جداً؛ وهكذا، قد عزلت بعموم-أسيتيل يسين تقارب الخرز التي قد تم مشبعة بالبروتينات المستهدفة تعديل التيار المتردد أكثر وفرة لا. تنفذ الدراسات الجارية لتقييم حدود الكشف والكواشف النسب المستخدمة في هذا البروتوكول، ولكن منشور صدر مؤخرا يشير إلى حد كشف قوية جداً. وأظهرت البيانات أن هذه التقنية يمكن أن تحدد عدد قليل من الجزيئات البروتينية الهدف أسيتيلاتيد 17 كل خلية31. لا يزال، ظروف محددة مثل الخلية اكتب خصوصية، بتمس عابر في الاستجابة للمحفزات محددة، أو إخفاء بتمس بسبب التفاعل البروتين قد تؤدي جميع النتائج السلبية الكاذبة. هذه هي المزالق المحتملة لهذه التقنية، فضلا عن معظم PTM IP أساليب. وهكذا، من المستحسن لتأكيد النتائج باستخدام نهج متعددة.
أظهرت التعديلات مثل glycosylation والفسفره للتنافس على الأحماض الأمينية مماثلة39،40وبتمس الأخرى مثل أوبيكويتينيشن والفسفره قد ثبت أن العمل بالتتابع لتنظيم نسبة البروتين وظيفة17،41. وأبرز العمل مؤخرا على البروتين لاثيل تاو أهمية PTM الحديث المتبادل، حيث فرط تاو-الفسفرة و "سومويلاتيون تاو" تعزيز بعضها البعض42. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه المجموعة أن منع "سومويليشن تاو" بولي-يو بي واللاحقة Tau التدهور، مما قد يؤدي إلى التراكم. هذا مجرد واحدة من العديد من الأمثلة على الحديث المتبادل PTM التنظيمية، وفائدة هذا الأسلوب سيساعد على إلقاء الضوء على أهمية بتمس وعلى الحديث المتبادل في تنظيم البروتينات الأساسية في الصحة والمرض.
Disclosures
سمو والجامعة العربية موظفا من "سيتوسكيليتون وشركة ك. م." مؤسس شركة سيتوسكيليتون
Acknowledgments
ونشكر سيتوسكيليتون وشركة أبحاث العلماء والدكتور ريان هوفر واشلي ديفيس لاستعراض دقيق والتحرير، ومناقشات مثمرة حول المخطوطة. بالإضافة إلى ذلك، نشكر الدكتور روبرت هوم لمساهمته خلال إنتاج المخطوطة الفيديو. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من شركة سيتوسكيليتون
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D.
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W.
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
