Summary
Undersökt flera, kan endogena post-translationella modifieringar för ett målprotein vara mycket utmanande. Tekniker som beskrivs här utnyttja en optimerad lysis buffert och filter system utvecklats med specifika PTM-targeting, affinitet matriser att upptäcka de acetylering, ubikvitinering, SUMOylation 2/3 och tyrosin fosforylering ändringarna för ett mål protein med en enda, strömlinjeformad system.
Abstract
Det är nu väl uppskattat att post-translationella modifieringar (PTMs) spelar en viktig roll i regleringen av en Proteinets struktur och funktion, som kan vara väsentliga för en given proteinets roll både fysiologiskt och sjukligt. Anrikning av PTMs är ofta nödvändigt när du undersöker ett målprotein PTM status, eftersom PTMs är ofta övergående och relativt låg i överflöd. Många fallgropar påträffas när berikande för en PTM av ett målprotein, såsom buffert oförenlighet, mål protein antikroppen är inte IP-kompatibla, PTM signalförlust, m.fl. Svårighetsgraden förstoras när du undersöker flera PTMs som acetylering, ubikvitinering, SUMOylation 2/3 och tyrosin fosforylering för ett visst målprotein. Studera en kombination av dessa PTMs kan vara nödvändigt, som överhörning mellan PTMs är utbrett och kritisk till protein förordning. Ofta, studeras dessa PTMs i olika lysis buffertar och med unika hämmare kompositioner. För att förenkla processen, ett unikt denatureringen lysis system utvecklades som effektivt isolerar och bevarar dessa fyra PTMs; Således gör det möjligt för utredning av potentiella överhörning i en enda Lys-systemet. Ett unikt filtersystem var konstruerad för att ta bort kontaminerande genomiskt DNA från den lysate, som är en problematisk biprodukt denaturera buffertar. Robust affinitet matriser inriktning var och en av de fyra PTMs har utvecklats i konsert med buffert för att maximera anrikning och detektion av endogena påstår av dessa fyra PTMs. Denna omfattande PTM upptäckt verktygsuppsättning effektiviserar processen för att erhålla kritisk information om huruvida ett protein ändras genom en eller flera av dessa PTMs.
Introduction
Post-translationella modifieringar (PTMs) är starkt reglerade ändringar av ett protein, varvid ändringen läggs till eller tas bort på ett särskilt sätt. PTMs är ofta dynamiska, övergående förändringar som avsevärt förändrar Proteinets struktur, interaktioner med partner proteiner, rumsliga lokalisering och slutligen aktivera proteinet att utföra olika funktioner1,2 , 3 , 4. PTMs är så rikligt att de ökar antalet unika protein former (eller proteoforms) från omkring 30.000 genprodukter till över en miljon proteoforms5,6. Att identifiera PTMs och definiera deras effekt på ett målprotein är kritisk mot att förstå proteinets funktioner fysiologiska och patologiska7,8,9,10, 11,12,13,14. Arbeta på Välj proteiner som tubulin, p53 och epidermal tillväxtfaktor (EGFR) har klarlagts rollerna reglerande PTMs15,16,17. Dessa studier avslöjat att regleringen av dessa proteiner sker genom flera PTMs, och i många fall dessa ändringar arbetar i samförstånd för att främja en specifik funktion. Nya studier har visat att både kooperativa och negativa PTM överhörning kan uppstå på flera olika proteiner18,19,20,21,22, 23,24,25. PTM profiler av majoriteten av proteiner byggs dock från flera studier som har använt olika modeller och unika förutsättningar. Med ett optimerat system att undersöka flera PTMs i ett system skulle vara mycket fördelaktigt att få insikt i potentiella PTM överhörning för ett målprotein.
En utmaning med att utreda PTMs i ett enda system är att specifika PTMs utreds med distinkta lysis buffertar. Till exempel kan utnyttjandet av buffertar som RIPA eller NP-40 som vanligen används för fosforylering eller ubikvitinering utredningar vara otillräcklig för att studera en labila PTM som små ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) ylation26. Dessutom icke-denatureringen buffertar är otillräckliga för att separera proteininteraktioner, och kan leda till falskt positiva PTM identifiering27. Undersöka PTMs i en denatureringen lysisbuffert kan vara att föredra, eftersom det är betydligt bättre isolera proteiner från alla cellulära fack28, kommer att separera de flesta proteininteraktioner, och kommer att hämma proteaser som förändrar PTM stater, såsom deSUMOylases 26. men kan denatureringen buffertar äventyra integriteten i specifika affinitet reagens såsom ubiquitin bindande domän-baserade verktyg27. Utveckla ett denatureringen-liknande lysis system för att studera flera PTMs av ett protein i en affinitet reagens-kompatibla system skulle vara mycket fördelaktigt för PTM överhörning utredningar.
Även om denatureringen buffertar har viktiga fördelar jämfört med icke-denatureringen buffertar för att undersöka PTMs, de används mindre ofta på grund av sin betydande nackdelar, såsom oförenlighet med konventionell protein-analyser, betydande genomisk deoxiribonukleinsyra (DNA) kontaminering, och störningar till immunoprecipitation (IP) reagens29. Dessa nackdelar kan resultera i längre förberedelsetid och potentiella skador till målprotein när klippning genomiskt DNA. Två vanliga metoder för att klippa DNA inkluderar spruta lysis och ultraljudsbehandling29. Båda metoderna kräver omfattande optimering och ofta saknar exakta reproducerbarhet. Alternativa metoder för att ta bort genomiskt DNA inkluderar tillägg av DNAses; Detta kan dock kräva ytterligare optimering och förändringar i buffert sammansättning. En enkel och reproducerbar metod att avlägsna genomisk DNA nedsmutsning skulle i slutändan vara fördelaktigt när du arbetar med denatureringen lysis buffertar för PTM utredningar.
Målet med denna teknik är att utveckla ett system för att isolera och undersöka ubikvitinering (Ub), tyrosin fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) och acetylering (Ac) PTMs i ett enda system för att bättre undersöka PTM överhörning för ett målprotein. Detta system för upptäckt av PTM utnyttjades för att snabbt undersöka flera målproteiner endogena PTM profil i ett enda system. Ny insikt i eventuella överhörning var identifierade30,31. Övergripande, den teknik som beskrivs här förbättrar befintliga metoder för att undersöka PTMs och PTM överhörning på tre olika sätt: 1) en unik denatureringen buffert utvecklades som isolerar proteiner från alla cellulära fack, medan det fortfarande är kompatibel med PTM affinitet reagenser, 2) ett unikt filtersystem utvecklades som snabbt avlägsnar genomisk DNA kontaminering från denaturerat lysates med hög reproducerbarhet och kräver ingen specialutrustning och 3) den robusta affinitet pärlor, Lys-systemet, och hämmande Reagenserna är kompatibla. Således, förenkla isolering av dessa fyra PTMs för ett målprotein maximera PTM anrikning och effektivt undersöka potentiella överhörning.
Protocol
1. provberedning: Cellkultur
- Växa fyra 150 mm plattor av A431 celler i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum.
- Växa A431 cellerna till 50% konfluens.
- Serum begränsa A431 celler med serumfritt DMEM för 24 h fyra plåtar.
- Behandla två plattor av A431 celler med 33,3 mg/mL av epidermal tillväxtfaktor för 1 h. lämnar de andra två plattor som obehandlade.
Obs: Cell tillväxt och behandling villkor visas här ge ett exempel; Denna metod är dock tillämpliga på många olika celltyper och behandling villkor.
- Förbered blastR lysis och utspädning buffertar med hämmare (tabell 1). Kombinera 2.895 mL lyseringsbuffert blastR med 15 µL av tyrosin fosfatas hämmare, 30 µL av deubiquitinase och deSUMOylase-hämmare, 30 µL av Histon histondeacetylas (HDAC)-inhibitor och 30 µL av proteashämmare cocktail.
- Kombinera 9.65 mL förtunningsbuffert blastR med 50 µL av tyrosin fosfatas hämmare, 100 µL av deubiquitinase och deSUMOylase-hämmare, 100 µL av Histon histondeacetylas (HDAC)-hämmare och 100 µL av proteashämmare cocktail.
Obs: Se Tabell av material för buffert sammansättning och hämmare information.
- Kombinera 9.65 mL förtunningsbuffert blastR med 50 µL av tyrosin fosfatas hämmare, 100 µL av deubiquitinase och deSUMOylase-hämmare, 100 µL av Histon histondeacetylas (HDAC)-hämmare och 100 µL av proteashämmare cocktail.
- Häll av kultur media och placera cellerna på is. Sedan tvätta cellerna två gånger med 10 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Ta bort så mycket PBS som möjligt innan du lägger till blastR lyseringsbuffert för att maximera cellys.
Obs: Se Tabell av material för buffert sammansättning.
- Ta bort så mycket PBS som möjligt innan du lägger till blastR lyseringsbuffert för att maximera cellys.
- Tillsätt 600 µL blastR lyseringsbuffert för varje 150 mm platta. Mängden buffert är baserad på förväntad protein avkastning (tabell 2).
- Lysera celler använder en cell skrapa. Den lysate blir trögflytande på grund av nukleära lysis.
- Använd en beckasin 1 mL pipettspetsen överföra rå lysate i ett blastR filter som har placerats i en 15 mL collection tube (figur 1). Här används en 15 mL falconrör.
- Använd en medföljande filter kolven helt komprimera blastR filtret och samla den lysate genomflödestest, inklusive eventuella bubblor, i en 15 mL tub (figur 1).
- Valfritt: Överföring förtydligas lysate i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och centrifugera det lysate vid ungefärligt 10.000 x g under 1 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny 15 mL falconrör.
- Späd den klargj橬一j lysate med blastR förtunningsbuffert till en slutlig volym av 3 mL för varje 150 mm platta. Den slutliga volymen är baserad på förväntad protein avkastning (tabell 2).
Obs: Detta steg är viktigt eftersom slutligt buffertvärde sammansättning påverkar IP reaktion striktheten. - Kvantifiera proteinkoncentration (avsnitt 2).
2. protein kvantifiering Assay
Obs: Använd en standard kolorimetriska protein kvantifiering analys för att bestämma protein kvantifiering. Här, bestäms protein kvantifiering med precision röd avancerade protein-analys.
- Tillsätt 1 mL precision röd avancerade protein assay reagens till var och en av två 1 mL kyvetter.
- Blanda 10 µL av blastR lyseringsbuffert och 40 µL förtunningsbuffert blastR i en ren 1,5 mL mikrocentrifug rör på is.
Obs: Detta kommer att användas för att läsa tomma protein provet. - Tillsätt 20 µL av Lys/spädning buffert mixen (från steg 2.2) till första kyvetten och blanda genom att vända två till tre gånger.
- Tillsätt 20 µL av den utspädda cellen lysate (från experiment) till den andra kyvetten, blandning som ovan.
- Inkubera prover för 1 min i rumstemperatur.
- Tom spektrofotometer med Lys/spädning buffert mix provet (från steg 2.3).
- Mät absorbansen hos lysate provet (från steg 2,4) på 600 nm.
- Avgöra den lysate proteinkoncentration följande;
exempel läsa OD600 x 5 = proteinkoncentration i mg/mL
Obs: OD avläsningar under 0,05 eller över 0,5 är nära protein analysens linjära området kapacitet. För avläsningar > 0,5, prover kan spädas. För avläsningar < 0,05, mer lysate kan läggas till precision röd avancerade protein assay reagens (upp till 50 µL). Se tabell 3 för multiplikatorer att konvertera spektrofotometer avläsningar till mg/mL lysat proteinkoncentration. Om det finns otillräcklig protein i en tallrik, rekommenderas det att använda 2 eller fler plattor per IP. I det här fallet kommer plattor att skördas i serien, överföra den ursprungliga 300 μl lyseringsbuffert mellan plattorna. - Baserat på proteinkoncentration, späd provet med en buffert blandning (1 del blastR lysis: 4 delar blastR utspädning) önskad koncentration (vanligtvis 1 mg/mL).
- Snapin frysa alikvoter av prover som inte ska användas omedelbart.
- Lagra prover vid-70 ° C.
- Fortsätt till avsnitt 3.
3. Immunoprecipitation (IP)-analys
Obs: Affinitet pärla koncentrationer, lysate koncentrationer och inkubationstider är rekommenderade riktlinjer, och kan vara unik för varje målproteinet och specifika PTM utreds.
- Invertera lager reagensrör som innehåller Ub affinitet pärlor, pY affinitet pärlor, SUMO 2/3 affinitet pärlor och Ac affinitet pärlor flera gånger för att kontrollera att är pärlorna helt resuspended i röret.
- För varje IP-analys, alikvotens pärla suspension i separata 1,5 mL mikrocentrifugrör på is (IP-rör). Här lägga till 20 µL av ubiquitin tillhörighet pärlor, 30 µL av phosphotyrosine affinitet pärlor, 40 µL av SUMOylation 2/3 affinitet pärlor eller 50 µL av acetylering affinitet pärlor till enskilda 1,5 mL mikrocentrifugrör på is.
Obs: Se tabell 4 för den rekommenderade volymen pärla suspension ska användas för varje affinitet pärla. - Invertera lager reagensrör innehållande ubikvitinering IP-kontroll pärlor och IgG kontroll pärlor flera gånger för att kontrollera att är pärlorna helt resuspended i röret.
- Alikvotens kontroll pärlor per kontroll reaktion att fastställa icke-specifik bindning (kontroll IP rör). Här lägga till 20 µL av Ub kontroll pärlor, 30 µL av pY kontroll pärlor, 40 µL av SUMO 2/3 kontroll pärlor eller 50 µL av Ac kontroll pärlor till enskilda 1,5 mL mikrocentrifugrör på is.
Obs: Se tabell 4 för den rekommenderade volymen pärla suspension ska användas för varje typ av affinitet pärla. - Spara en liten mängd lysate (20 µL) körs som en western blot ingång lysate kontroll. Tillsätt 5 µL 5 x provet buffert och koka vid 95 ° C i 5 min.
Obs: Se Tabell av material för buffert sammansättning. - Lägg till lysate varje IP-tube och kontroll IP-tube. Här användes 1 mg lysate per IP och kontroll reaktion, som resulterar i totalt 8 IP-reaktioner.
Obs: 1,0 mg lysate per analys rekommenderas som utgångspunkt. Mängden lysate krävs kommer att variera beroende på överflödet av modifierade målprotein. - Inkubera rören på en över slut roterande plattform vid 4 ° C i 2 h. Här användes en ATR tube rotator hastighet 22.
- Samla pärlor genom centrifugering vid 3,000-5,000 x g för 1 min vid 4 ° C.
- Aspirera ut lika mycket supernatanten som möjligt utan att störa pärlorna.
- Tvätta pärlor i 1 mL blastR tvättbuffert (hämmare inte är nödvändig i detta skede) för 5 min på en 4 ° C roterande plattform.
- Samla pärlor genom centrifugering vid 3,000-5,000 x g för 1 min vid 4 ° C.
- Aspirera ut lika mycket supernatanten som möjligt utan att störa pärlorna.
- Upprepa tvättningen (steg 3.10-3.12) två gånger.
- Efter den sista tvättningen, helt ta bort buffert supernatanten. Minimala störningar av den pärla pelleten är acceptabelt (upp till en 5% förlust). Ta bort återstående supernatanten med en smal bar protein lastning tip.
- Tillsätt 30 µL av pärla eluering buffert och resuspendera pärlorna genom att försiktigt knacka/snärta sidan av röret. Använd inte en pipett i detta skede.
Obs: Se Tabell av material för buffert sammansättning. - Odla i rumstemperatur i 5 min.
- Försiktigt överföra varje pärla suspension till en 1,5 mL mikrocentrifug spin kolumn som har placerats i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: Det rekommenderas att knipsa i slutet bort av överföring pipettspetsen för skonsammare överföring. - Centrifugera 9.000-10.000 x g för 1 min i rumstemperatur att samla in IP-provet.
- Tillsätt 2 µL av 2-merkaptoetanol i varje prov och blanda väl.
Obs: Det är bekvämt att knäppa av locket från kolumnen spin och använda detta till cap samling röret för vidare bearbetning. - Placera prover i 95 ° C vattenbad för 5 min. samla prov genom centrifugering vid 10 000 x g för 1 min på RT.
- Om nödvändigt, lagra prover vid-70 ° C och sluta här eller fortsätta att köra SDS-PAGE, överföring och western blot analys (avsnitt 4).
4. Western Blot analys: Identifiering av Protein av intresse
- Separata prover av sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och överför till en polyvinylidene fluor (PVDF) membran, enligt standard laboratorium protokoll32.
- Använda en primär antikropp för att identifieras post-translationally modifierade versioner av proteinet av intresse. Här var PD-L1 antikropp används för att upptäcka post-translationally modifierade PD-L1.
- Använd ultrasensitive chemiluminescence upptäckt reagens för upptäckt.
Obs: Den kemiluminiscerande reagensen bör användas tillsammans med en HRP-märkt sekundär antikropp som kan upptäcka den primär antikroppen. - Använda en volym av 2 mL kemiluminiscerande reagens per mini-gel-stora överföring membran (ca 8 x 7 cm).
- Efter inkubation med lämpliga sekundära antikroppar (60 min på RT rekommenderas), tvätta blot 6 x 10 min i 30 mL tris-buffrad koksaltlösning med tween-20 (TBST).
Obs: Se Tabell av material för buffert sammansättning. - Omedelbart före användning, blanda 1 mL kemiluminiscerande reagens A med 1 mL kemiluminiscerande reagens B (tillräckligt för en 8 x 7 cm membran).
- Lägga till kemiluminiscerande reagens i membran och inkubera med mild gunga på RT för 1-5 min före visualisering av protein signal med röntgenfilm eller kostnad – tillsammans enhet (CCD) kamera imaging.
Obs: Kortare inkubationstider i kemiluminiscerande reagens kan vara nödvändigt för mycket riklig proteiner.
- Efter inkubation med lämpliga sekundära antikroppar (60 min på RT rekommenderas), tvätta blot 6 x 10 min i 30 mL tris-buffrad koksaltlösning med tween-20 (TBST).
Representative Results
Dessa verktyg förmåga att undersöka PTM överhörning genom effektivt upptäcka dessa 4 PTMs är delvis beroende av systemets unika lysis buffert. BlastR denatureringen bufferten isolerar effektivt proteiner från alla cellulära fack på samma sätt som andra denatureringen buffertar, vilket garanterar en komplett protein profil (figur 2A). Dessutom bevarar det mycket labila PTM signaler som SUMO 2/3, som snabbt minskar i icke-denatureringen buffertar som radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (figur 2B). Allt efter spädning på lämpligt sätt, påverkar det inte integriteten av affinitet reagenser som andra denatureringen buffertar (t.ex. Laemmli buffert).
Ett stort hinder när du arbetar med denatureringen buffertar är förmågan att effektivt ta bort genomisk DNA kontaminering. Den konventionella metoden för att minska viskositeten är att klippa DNA genom att använda en sprutans nål eller sonicating provet. Figur 3A visar genomisk DNA-kontaminering i A431 cell lysate efter behandling med BlastR filter, sprutans nål eller ultraljudsbehandling. Det finns nästan fullständigt avlägsnande av genomisk DNA med hjälp av BlastR filter, vilket inte är fallet med en konventionell sprutans nål eller ultraljudsbehandling. Genomiskt DNA kontaminering påverkar avsevärt protein migration genom en SDS-akrylamid gel; dock avlägsnar behandling med BlastR filter genomiskt DNA, vilket resulterar i ordentlig protein migration (figur 3B). Förändrad migration orsakas av genomisk DNA kontaminering kan påverka tolkning av western blotting; till exempel kan utsmetade EGFR mönstret sett i den ofiltrerade lysate felaktigt tolkas som ökat uttryck i förhållande till filtrerade provet (figur 3 c).
Genom att utnyttja detta optimerade PTM anrikning och detection system, kan man snabbt avgöra om ett målprotein ändras genom en eller fler PTMs. utredning av PD-L1 PTM profilen utfördes nyligen med hjälp av denna teknik, och resultaten visade att PD-L1 ubiquitineras, acetylerade, och tyrosin fosforyleras svar på EGF (figur 4). Ännu viktigare, uppgifter dessa endogena PD-L1 PTM förändringar, som föreställde en liten andel av den totala PD-L1 identifieras.
Figur 1: filtrering genomiskt DNA från cell lysate med BlastR filter. (A) bild av BlastR filter. (B) Lysate läses in i filtret som placerades i en 15 mL collection tube. (C) placeras kolven i sprutan och lysat passerar genom filtret av komprimering. (D) samla lysate, inklusive eventuella bubblor genom komplett komprimering. (E) filtrerad lysate.
Figur 2: jämförelse av BlastR lyseringsbuffert till alternativa lysis buffertar. Figur 2A anpassad från Horita o.a. 2017. Biosci. Rep. 31 (A) A431 celler var lyserat och med BlastR, RIPA, mPER, IP-Lys, denaturering (1% SDS), och Laemmli lysis buffertar. Alla denatureringen lysates hade genomiskt DNA bort med BlastR filter. Isolering av proteiner från membran, cytoplasmiska, mitokondriell, och kärn markörer bestämdes med hjälp av antikroppar mot de respektiva fack markör proteinerna. (B) A431 celler var lyserat med BlastR, RIPA och 1% SDS denatureringen buffert. Lysates var immunoprecipitated med SUMO 2/3 eller kontroll IgG affinitet pärlor. Proverna var åtskilda av SDS-PAGE och analyseras av western blot använder en SUMO 2/3-pepparrotsperoxidas (HRP) antikropp. Representant blotting från N≥3 oberoende experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: BlastR lysis filter är effektiva på att ta bort genomiskt DNA. (A) A431 celler var lyserat med en denatureringen lyseringsbuffert. Genomiskt DNA togs bort eller skevas med BlastR filter, sprutans nål eller ultraljudsbehandling för 5, 10, 20 eller 30 sekunder. 2% av den lysate analyserades av etidiumbromid, agaros gelelektrofores. (B) Lysate från A431 celler lyserat med denatureringen buffert var antingen ofiltrerat eller filtrera med BlastR filter. Proverna var separerade med SDS-PAGE och visualiseras med Coomassie fläcken. (C) dubblett prover från B var åtskilda av SDS-PAGE, överförs till PVDF, och EGFR protein undersöktes med hjälp av en EGFR-antikropp. Representativa blotting från N ≥3 oberoende experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Påvisande av EGF-inducerad post-translationella modifieringar för PD-L1. Figur anpassad från Horita o.a. 2017. neoplasi30(A). Serum-begränsad A431 celler var antingen ostimulerade (UT) eller stimuleras med EGF under en timme före lysis med BlastR lyseringsbuffert. WCL analyserades för PD-L1 nivåer (körfält 1,2). Ubiquitin bindande pärlor (UBA01) användes till IP ubiquitineras proteiner (körfält 3,4). Phosphotyrosine bindande pärlor (APY03) användes för att IP-tyrosin-fosforyleras proteiner (körfält 5,6). SUMO 2/3 bindande pärlor (ASM24) användes för att IP-SUMOylated 2/3 proteiner (körfält 7,8). Acetyl lysin bindande pärlor (AAC01) användes för att IP-acetylerade proteiner (körfält 9,10). IgG bindande kontroll pärlor användes till IP icke-specifika bindningsproteiner (körfält 11,12). Proverna var åtskilda av SDS-PAGE och analyseras av western blot med en PD-L1-antikroppen. En representativ skamfläck från N ≥3 oberoende experiment visas. Vita asterisker användes för att belysa PD-L1 pY och Ac protein band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Beräkningar för BlastR lyseringsbuffert | ||||
| 1,0 mL | 2,0 mL | 5,0 mL | 10,0 mL | |
| BlastR lyseringsbuffert | 965 ΜL | 1930 ΜL | 4.825 mL | 9.650 mL |
| Tyrosin fosfatas hämmare | 5 ΜL | 10 ΜL | 25 ΜL | 50 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase-hämmare | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| HDAC-hämmare | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Proteashämmare cocktail | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Beräkningar för BlastR förtunningsbuffert | ||||
| 4,0 mL | 8,0 mL | 20,0 mL | 40,0 mL | |
| BlastR lyseringsbuffert | 3.86 mL | 7.72 mL | 19,3 mL | 38,6 mL |
| Tyrosin fosfatas hämmare | 20 ΜL | 40 ΜL | 100 ΜL | 200 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase-hämmare | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| HDAC-hämmare | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Proteashämmare cocktail | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
Tabell 1: Lys och utspädning buffert förberedelse diagrammet. Diagrammet ger koncentrationer av hämmare att lägga till för en given lysis och utspädning buffert volym när du förbereder buffertar för cellen lysis.
| Tallrik proteininnehåll | Rekommenderade BlastR lyseringsbuffert volym | Rekommenderade BlastR förtunningsbuffert volym |
| < 1 mg | Kombinera protein från flera plattor | Att göra 1,5 mL slutlig volym |
| 1-2 mg | 300 ΜL | Att göra 1,5 mL slutlig volym |
| 2-4 mg | 600 ΜL | Att göra 3 mL slutlig volym |
| 4-6 mg | 900 ΜL | Att göra 4,5 mL slutlig volym |
Tabell 2: BlastR Lys/spädning buffert diagrammet. Diagrammet ger rekommenderas lysis och utspädning buffert volymer när få lysate.
| Volymen av cell lysate tillsätts 1 ml Precision Red Protein Assay reagens (µL) | Multiplikator för användning med prov läsning OD600 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
Tabell 3: Multiplikatorer att konvertera spektrofotometer avläsningar till mg/mL lysat. Diagrammet ger konvertering nummer till medhjälpare med beräkning av proteinkoncentration.
| affinitet pärlor | volymen av pärla flytgödsel/IP (mL) |
| Ubikvitinering | 20 |
| Phosphotyrosine | 30 |
| SUMOylation 2/3 | 40 |
| Acetylering | 50 |
| kontroll pärlor | volymen av pärla flytgödsel/IP (mL) |
| Ubikvitinering kontroll pärlor | 20 |
| Phosphotyrsoine kontroll pärlor | 30 |
| SUMOylation 2/3 kontroll pärlor | 40 |
| Acetylering kontroll pärlor | 50 |
Tabell 4: Rekommenderade mängden pärlor/IP diagrammet. Diagrammet ger rekommenderade mängder affinitet pärlor att använda per IP-reaktion.
Discussion
Ursprungliga metoder används för att bestämma om ett målprotein ändras genom en PTM kan utföras med mål protein specifika antikroppen för IP, följt av western blot med en PTM-antikropp (t.ex., anti acetyl lysin), eller genom att använda en PTM antikropp för IP, följt av western blot med de mål protein specifika antikropp30,31,33. Båda metoderna fungerar teoretiskt, har utnyttja en mål-protein-specifika antikropp fler potentiella fallgropar, som antikroppen kan inte IP kompatibel, eller stora PTM ändringar kan blockera webbplatsen antikropp erkännande på målproteinet34 ,35. Fördelen med PTM affinitet pärlorna är att antikroppen eller bindande domänerna specifikt känna igen PTM av intresse. ändringar i målproteinet bör således inte ändra erkännande av affinitet pärlorna. PD-L1 Ub identifierades med den teknik som beskrivs här som ett exempel, och båda endogena mono - och poly-Ub observerades (figur 4). En ny publikation av Lim et al. utnyttjas i vitro Ub tekniker för att undersöka PD-L1 Ub, och resultatet var mycket likt de resultat som visas i figur 436. Intressant, utförde de också IP med en PD-L1-antikropp att berika PD-L1 från cell lysate, där Ub var i ökad utsträckning och MG-132 lades till förbättra signalen. Ub mönstret var inte robust och mycket distinkt från in vitro- Ub mönstret. Utredning av endogena PD-L1 Ub i cell kultur modeller utfördes inte i Lim et al. rapport att klargöra skillnaden mellan deras kultur och in vitro- data i cellen.
Utreda huruvida ett protein ändras genom en PTM kan vara en utmaning på grund av dess låga överflöd och övergående natur37,38, och kräver ofta berikning via IP. Effektiva IP av PTMs kräver optimering av flera viktiga steg och reagens, såsom lysis buffertar och affinitet reagenser. När du undersöker flera PTMs av ett målprotein, ökar krävs optimering sannolikt. Utnyttja blastR lysis systemet är ett viktigt steg i detta protokoll, eftersom det upprätthåller robusta IP-kapacitet, medan aktivera PTM identifiering av pY, SUMO 2/3, Ub och Ac PTMs i ett enda system. Denna teknik optimerar tid och resurser som krävs för att avgöra om ett visst målprotein ändras genom dessa fyra PTMs, och potentiellt ger en bättre bild av PTM överhörning i förhållande till jämföra PTM resultat utförs med flera lysis system. Utredning av blastR lysis systemets kompatibilitet med alternativa PTMs, som glycosylation, utfördes; men har det inte undersökts uttömmande för alla typer av PTMs.
Rikliga genomiskt DNA kan störa protein mätningar med antingen kolorimetrisk eller nanodrop metoder, påverkar migrationen av proteiner i en SDS akrylamid gel och förhindra protein och affinitet matrix interaktion under IP-analyser. Metoden beskrivs här utnyttjar ett specialiserade filter för att effektivt ta bort genomisk DNA-kontaminering, som är ett annat viktigt steg i detta protokoll. För att belysa denna punkt, viskositet tester utfördes före och efter blastR filter behandling och resultaten visade en minskning från en hög viskositet att viskositeten av vatten (inga data anges). Denna förändring i viskositet stöddes av resultaten i figur 3visar nästan alla genomisk DNA hade tagits bort. Allt är DNA inte klippt med denna metod, som någon klippt DNA inte kommer att fångas av filtret (inga data anges). Detta verktyg är överlägsen konventionella metoder, som ultraljudsbehandling eller spruta-DNA-klippning, eftersom det kräver ingen specialutrustning, är mycket reproducerbara och tar bort DNA i stället för klippning det. Dessutom kommer det inte försämra protein i den lysate, vilket kan ske med konventionella metoder29. Använda filtret tar 5-30 sekunder per prov jämfört med alternativa metoder där effektiv uppdelning av DNA kan ta flera minuter (dvssprutan klippning) och kan resultera i provet heterogenitet som DNA föroreningar kvar i den lysate. Omfattande analys av lysat före och efter blastR filtrering utfördes, och ingen observerbara skillnad i protein profil observerades av Coomassie, target-specifika västra, eller totalt och target-specifika PTM analyser; Således, integriteten av den protein-profilen kan inte ha påverkats genom att filtrera bort genomisk DNA. Ytterst, detta filtersystem är fördelaktigt för alla western eller IP-program där genomiskt DNA är närvarande och kan påverka tolkningen av den protein-analysen.
Det är viktigt att notera att det finns risk för falskt negativa upptäckt utnyttja denna teknik, vilket kan bero delvis på affinitet pärla mättnad, bindande webbplats störningar eller PTM maskering. Exempelvis kan ett visst målprotein ändras av Ac på mycket låga nivåer. Det kan således inte isoleras av pan-acetyl lysin affinitet pärlor som har mättats av rikligare Ac-modifierade målproteiner. Pågående studier utförs för att bedöma detektionsgränserna för affinitet reagenserna utnyttjas i detta protokoll, men en ny publikation antyder en mycket robust detektionsgränsen. Data visade att denna teknik kunde identifiera så få som 17 acetylerade mål proteinmolekyler per cell31. Fortfarande, särskilda omständigheter såsom cell skriver specificitet, övergående PTMs svar på specifika stimuli, eller maskering av PTMs på grund av protein interaktion kan alla resultera i falska negativa resultat. Detta är potentiella fallgropar av denna teknik, liksom de flesta PTM IP metoder. Således, det rekommenderas att bekräfta resultat med hjälp av flera metoder.
Ändringar som glycosylation och fosforylering har visat att konkurrera om liknande aminosyror39,40, och andra PTMs som ubikvitinering och fosforylering har visat att arbeta sekventiellt för att reglera en proteinets funktion17,41. Senaste arbete på neuropatologiska proteinet Tau betonade vikten av PTM överhörning, där hyper Tau-fosforylering och Tau SUMOylation förstärkt varandra42. Dessutom, denna grupp visade att SUMOylation av Tau hindrade poly-Ub och efterföljande Tau nedbrytning, möjligen leder till aggregering. Detta är bara ett av många exempel på föreskrivande PTM överhörning och nyttan av denna teknik kommer att hjälpa för att belysa vikten av PTMs och deras överhörning i regleringen av viktiga proteiner i hälsa och sjukdom.
Disclosures
H.H. och A.L. är anställda av cytoskelettet Inc. K.M. är en av grundarna av cytoskelettet Inc.
Acknowledgments
Vi tackar cytoskelettet Inc. forskare och Drs. Brian Hoover och Ashley Davis för deras kritisk granskning, redigering och givande diskussioner på manuskriptet. Dessutom, tackar vi Dr. Robert Hom för hans bidrag under produktionen video manuskriptet. Detta arbete stöds av finansiering från cytoskelettet Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D.
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W.
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
