Summary
At undersøge flere, kan endogene posttranslationelle modifikationer for en target protein være ekstremt udfordrende. Teknikker beskrevet her udnytte en optimeret lysis buffer og filter system udviklet med specifikke PTM målretning, affinitet matricer til at registrere acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering ændringerne for et mål protein ved hjælp af et enkelt, strømlinet system.
Abstract
Det er nu godt værdsat, at posttranslationelle modifikationer (PTMs) spille en integrerende rolle i reguleringen af en protein struktur og funktion, som kan være afgørende for en given protein rolle både fysiologisk og patologisk. Berigelse af PTMs er ofte nødvendig, når undersøger PTM status for et mål protein, fordi PTMs er ofte forbigående og relativt lav i overflod. Mange faldgruber er stødt når berigende for en PTM en target protein, som buffer uforenelighed, target protein antistof er ikke IP-kompatible, PTM signaltab og andre. Graden af sværhedsgrad er forstørret når undersøger flere PTMs som acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering for en given mål protein. At studere en kombination af disse PTMs kan være nødvendigt, da krydstale mellem PTMs er udbredt og kritisk til protein forordning. Ofte, er disse PTMs studeret i forskellige lysis buffere og med unikke hæmmer kompositioner. Hen til simplificere oparbejde, et unikt denaturering lysis system blev udviklet som effektivt isolerer og bevarer disse fire PTMs; således, at undersøgelsen af potentielle krydstale i en enkelt lysis system. Et unikt filtersystem blev manipuleret til at fjerne forurenende genomisk DNA fra den lysate, som er en problematisk biprodukt af denatureringen buffere. Robust affinitet matricer rettet mod hver af de fire PTMs blev udviklet i koncert med buffersystem til at maksimere berigelse og påvisning af de endogene stater af disse fire PTMs. Denne omfattende PTM påvisning værktøjssæt strømliner processen med at opnå vigtige oplysninger om om et protein er modificeret ved en eller flere af disse PTMs.
Introduction
Posttranslationelle modifikationer (PTMs) er stærkt reguleret ændringer til et protein, hvorved ændringen er tilføjet eller fjernet på en bestemt måde. PTMs er ofte dynamisk, forbigående ændringer, som markant ændrer proteinets struktur, interaktioner med partner proteiner, og geografisk lokalisering, og i sidste ende gør det muligt for protein til at udføre forskellige funktioner1,2 , 3 , 4. PTMs er så rigelige, at de øger antallet af unikke protein former (eller proteoforms) fra omkring 30.000 genprodukter til over en million proteoforms5,6. At identificere PTMs og definere deres effekt på et mål protein er kritiske mod forståelse proteinets fysiologiske og patologiske funktioner7,8,9,10, 11,12,13,14. Arbejde på Vælg proteiner som tubulin, p53 og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) har belyst de regulerende roller PTMs15,16,17. Disse undersøgelser afslørede, at reguleringen af disse proteiner opstår af flere PTMs, og i mange tilfælde disse ændringer arbejde i fællesskab for at fremme en bestemt funktion. Nye undersøgelser har vist, at både kooperativ og negative PTM krydstale kan forekomme på flere forskellige proteiner18,19,20,21,22, 23,24,25. Imidlertid bygges PTM profiler af størstedelen af proteiner fra flere undersøgelser, der har brugt forskellige modeller og unikke forhold. At have et optimeret system at undersøge flere PTMs i ét system ville være meget gavnligt at få indsigt i potentielle PTM krydstale for en target protein.
En udfordring med at undersøge PTMs i et enkelt system er, at specifikke PTMs undersøges ved hjælp af særskilte lysis buffere. For eksempel, kan udnyttelse af buffere som RIPA eller NP-40, der er almindeligt anvendt til fosforylering eller ubiquitination undersøgelser være utilstrækkelige til at studere en labile PTM som små ubiquitin-lignende modifier (SUMO) ylation26. Derudover ikke denatureringen buffere er utilstrækkelige for fællesinstansen protein interaktioner, og kan føre til falsk positive PTM identifikation27. Undersøger PTMs i en denaturering lysisbuffer kan være foretrukne, da det er betydeligt bedre på at isolere proteiner fra alle cellulære rum28, vil adskille de fleste protein interaktioner og vil hæmme proteaser, der ændrer PTM stater, såsom deSUMOylases 26; dog kan denatureringen buffere kompromittere integriteten af specifik affinitet reagenser som ubiquitin bindende domæne-baserede værktøjer27. Udvikle en denaturering-lignende lysis system at studere flere PTMs af en protein i en affinitet reagens-kompatibelt system ville være meget gavnlige for PTM krydstale undersøgelser.
Selv om denaturering buffere har vigtigste fordele i forhold til ikke-denatureringen buffere for at undersøge PTMs, de er mindre almindeligt anvendt på grund af deres betydelige ulemper såsom uforenelighed med konventionelle protein assays, betydelig genomisk Deoxyribonukleinsyre (DNA) forurening, og afbrydelse af immunoprecipitation (IP) reagenser29. Disse ulemper kan resultere i forlængede forberedelsestid og potentielle skader på target proteiner når klipning genomisk DNA. To almindeligt anvendte metoder til at vride DNA omfatter sprøjte lysis og ultralydbehandling29. Begge metoder kræver omfattende optimering og ofte mangler præcise reproducerbarhed. Alternative metoder til at fjerne genomisk DNA omfatter tilføjelse af DNAses; Dette kan dog kræve yderligere optimering og ændringer i buffer sammensætning. I sidste ende, en simpel og reproducerbar metode til at fjerne genomisk DNA forurening ville være gavnligt, når du arbejder med denatureringen lysis buffere for PTM undersøgelser.
Målet med denne teknik er at udvikle et system for at isolere og undersøge ubiquitination (Ub), tyrosin fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) og acetylation (Ac) PTMs i et enkelt system til bedre undersøge PTM krydstale for en target protein. Denne PTM detection system blev udnyttet til at hurtigt undersøge den endogene PTM profil af flere mål proteiner i et enkelt system. Ny indsigt i potentielle krydstale blev identificeret30,31. Alt i alt den teknik beskrevet her forbedrer på eksisterende metoder til at undersøge PTMs og PTM krydstale på tre forskellige måder: 1) en unik denaturering buffer blev udviklet der isolerer proteiner fra alle cellulære rum, mens den stadig er kompatibel med PTM affinitet reagenser, 2) et unikt filtersystem blev udviklet som hurtigt fjerner genomisk DNA forurening fra denatureret lysates med høj reproducerbarhed og kræver ingen specialudstyr og 3) robuste affinitet perler, lysis system, og hæmmende reagenser er forenelige; således forenkle isolationen af disse fire PTMs for en target protein til at maksimere PTM berigelse, og effektivt undersøge potentielle krydstale.
Protocol
1. Prøvetilberedning: Cellekultur
- Vokse fire 150 mm plader af A431 celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum.
- Vokse A431 celler til 50% confluency.
- Serum begrænse de fire plader af A431 celler med serum-fri DMEM i 24 timer.
- Behandle to plader af A431 celler med 33.3 mg/mL af epidermal vækstfaktor for 1 h. forlade de andre to plader ubehandlet.
Bemærk: Celle vækst- og behandlingsbetingelser vist her giver et eksempel; denne metode er dog gældende for mange forskellige celletyper og behandling betingelser.
- Forberede blastR lysis og fortynding buffere med hæmmere (tabel 1). Kombinere 2.895 mL af blastR lysisbuffer med 15 µL af tyrosin phosphatase inhibitor, 30 µL af deubiquitinase og deSUMOylase inhibitor, 30 µL af Histon deacetylase (HDAC) hæmmer og 30 µL af protease hæmmer cocktail.
- Kombinere 9.65 mL af blastR fortynding buffer med 50 µL af tyrosin phosphatase inhibitor, 100 µL af deubiquitinase og deSUMOylase inhibitor, 100 µL af Histon deacetylase (HDAC) hæmmer og 100 µL af protease hæmmer cocktail.
Bemærk: Se Tabel af materialer buffer sammensætning og hæmmer oplysninger.
- Kombinere 9.65 mL af blastR fortynding buffer med 50 µL af tyrosin phosphatase inhibitor, 100 µL af deubiquitinase og deSUMOylase inhibitor, 100 µL af Histon deacetylase (HDAC) hæmmer og 100 µL af protease hæmmer cocktail.
- Hæld dyrkningsmedier og placere celler på is. Derefter cellerne vaskes to gange med 10 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Fjern så meget PBS som muligt før tilføje blastR lysisbuffer for at maksimere celle lysering.
Bemærk: Se Tabel af materialer til buffer sammensætning.
- Fjern så meget PBS som muligt før tilføje blastR lysisbuffer for at maksimere celle lysering.
- Tilføje 600 µL af blastR lysisbuffer for hver 150 mm plade. Mængden af buffer er baseret på forventede protein udbytte (tabel 2).
- Lyse celler ved hjælp af en celle skraber. Den lysate vil blive tyktflydende på grund af nukleare lysering.
- Bruge en bekkasin 1 mL pipette tip til at overføre den rå lysate i et blastR filter, der er blevet placeret i en 15 mL collection tube (figur 1). Her, er en 15 mL falcon tube brugt.
- Bruge en medfølgende filter stemplet til helt at komprimere blastR filter og indsamle de lysate gennemstrømning, herunder eventuelle bobler i en 15 mL tube (figur 1).
- Valgfrit: Overførsel afklares lysate til en 1,5 mL microcentrifuge rør og lysate på cirka 10.000 x g der centrifugeres i 1 min. ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten til en ny 15 mL falcon tube.
- Fortynd den klarede lysate med blastR fortynding buffer til en endelige mængden af 3 mL for hver 150 mm plade. Den sidste bog er baseret på forventede protein udbytte (tabel 2).
Bemærk: Dette trin er vigtigt, da den endelige buffer sammensætning vil påvirke IP reaktion strenghed. - Kvantificere proteinkoncentration (afsnit 2).
2. protein kvantitering Assay
Bemærk: Udnytte en standard kolorimetriske protein kvantitering analyse for at bestemme protein kvantitering. Protein kvantitering bestemmes her, ved hjælp af præcision røde avancerede protein assay.
- Der tilsættes 1 mL af præcision røde avancerede protein assay reagens til hver af to 1 mL kuvetter.
- Mix 10 µL af blastR lysisbuffer og 40 µL blastR fortynding buffer i en ren 1,5 mL microcentrifuge tube på is.
Bemærk: Dette vil blive brugt til læsning af eksemplet Tom protein. - Tilføj 20 µL af lysis/fortynding buffer mix (fra trin 2.2) til den første kuvette og mix af invertere to til tre gange.
- Tilføj 20 µL af de fortyndede celle lysate (fra eksperimentet) til den anden kuvette, blanding som ovenfor.
- Inkuber prøver i 1 minut ved stuetemperatur.
- Tom Spektrofotometer med lysis/fortynding buffer mix prøve (fra trin 2.3).
- Måler absorbansen af den lysate prøve (fra trin 2.4) på 600 nm.
- Bestemme lysate proteinkoncentration som følger;
prøve læsning OD600 x 5 = proteinkoncentration i mg/mL
Bemærk: OD aflæsninger under 0,05 eller over 0,5 er tæt på den lineære område kapacitet af protein assay. For behandlinger > 0,5, prøver kan fortyndes. For aflæsninger < 0,05, mere lysate kan føjes til præcision røde avancerede protein assay reagens (op til 50 µL). Se tabel 3 for multiplikatorer at konvertere Spektrofotometer aflæsninger til mg/mL lysate proteinkoncentration. Hvis der er utilstrækkelig protein i en plade, er det anbefales at bruge 2 eller flere plader pr. IP. I dette tilfælde vil plader blive høstet i serien, overføres de oprindelige 300 µL af lysisbuffer mellem pladerne. - Baseret på proteinkoncentration, fortyndes prøven med en buffer mix (1 del blastR lysis: 4 dele blastR fortynding) til en ønskede slutkoncentration (sædvanligvis 1 mg/mL).
- Snap fryse delprøver af prøver, der ikke vil blive brugt øjeblikkeligt.
- Opbevare prøver ved-70 ° C.
- Gå til afsnit 3.
3. Immunoprecipitation (IP) Assay
Bemærk: Affinitet perle koncentrationer, lysate koncentrationer og inkuberingstider er anbefalede retningslinjer, og kan være unikke for hvert mål protein og specifikke PTM undersøges.
- Inverter stock reagens rør indeholdende Ub affinitet perler, pY affinitet perler, SUMO 2/3 affinitet perler og Ac affinitet perler flere gange til at sikre, at er perlerne helt genopslemmes i røret.
- For hver IP assay, alikvot perle suspension i separate 1,5 mL microcentrifuge rør på is (IP tube). Her, tilføje 20 µL af ubiquitin affinitet perler, 30 µL af phosphotyrosine affinitet perler, 40 µL af SUMOylation 2/3 affinitet perler eller 50 µL af acetylation affinitet perler til individuelle 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
Bemærk: Se tabel 4 for den anbefalede mængde af perle suspension til brug for hver affinitet perle. - Inverter stock reagens rør indeholdende ubiquitination IP kontrol perler og IgG kontrol perler flere gange til at sikre, at er perlerne helt genopslemmes i røret.
- Alikvot kontrol perler pr. kontrol reaktion til at bestemme ikke-specifik binding (kontrol IP tube). Her, tilføje 20 µL af Ub control perler, 30 µL af pY kontrol perler, 40 µL af SUMO 2/3 kontrol perler eller 50 µL af Ac kontrol perler til individuelle 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
Bemærk: Se tabel 4 for den anbefalede mængde af perle suspension til brug for hver type af affinitet perle. - Gem en lille mængde af lysate (20 µL) til at køre som en vestlige skamplet input lysate kontrol. Tilsæt 5 µL af 5 x prøvebuffer og kog ved 95 ° C i 5 min.
Bemærk: Se Tabel af materialer til buffer sammensætning. - Føje lysate til hver IP tube og kontrol IP tube. Her, blev 1 mg af lysate brugt pr. IP og kontrol reaktion, hvilket resulterer i alt 8 IP reaktioner.
Bemærk: 1,0 mg lysate pr. assay anbefales som udgangspunkt. Mængden af lysate kræves vil variere afhængigt af overfloden af modificerede mål protein. - Inkuber rør på en roterende platform, slut over ved 4 ° C i 2 timer. Her, blev en ATR tube rotator brugt i fart 22.
- Indsamle perler ved centrifugering ved 3.000-5.000 x g i 1 min. ved 4 ° C.
- Opsug off så meget supernatanten som muligt uden at forstyrre perlerne.
- Vask perler i 1 mL blastR vaskebuffer (hæmmere ikke er nødvendigt på nuværende tidspunkt) for 5 min på en 4 ° C roterende platform.
- Indsamle perler ved centrifugering ved 3.000-5.000 x g i 1 min. ved 4 ° C.
- Opsug off så meget supernatanten som muligt uden at forstyrre perlerne.
- Gentag trinnet vask (trin 3.10-3.12) to gange mere.
- Efter den sidste vask, helt fjerne buffer supernatanten. Minimal afbrydelse af perle pellet er acceptabel (op til 5% tab). Fjern resterende supernatanten ved hjælp af en bøde bore protein lastning tip.
- Tilføj 30 µL af perle eluering buffer, og pelleten perlerne af forsigtigt trykke/svippede siden af røret. Brug ikke en pipette på dette stadium.
Bemærk: Se Tabel af materialer til buffer sammensætning. - Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Forsigtigt overføre hver perle suspension til en 1,5 mL microcentrifuge spin kolonne, der er blevet placeret i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
Bemærk: Det anbefales at snip slutningen af overførsel pipette tip til blidere overførsel. - Der centrifugeres ved 9000-10.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur til at indsamle IP-prøven.
- Tilsæt 2 µL af 2-mercaptoethanol til hver prøve og bland godt.
Bemærk: Det er praktisk at låget på off kolonnen spin og bruge denne til cap collection tube til videreforarbejdning. - Placer prøver i en 95 ° C vandbad i 5 min. indsamle prøven ved centrifugering ved 10.000 x g i 1 min på RT.
- Hvis det er nødvendigt, opbevare prøver ved-70 ° C og stoppe her, eller videre til kører SDS-PAGE, overførsel og western blot analyse (afsnit 4).
4. Western Blot analyse: Identifikation af Protein af interesse
- Separate prøver af sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og overføre til en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran, ifølge standard laboratorium protokoller32.
- Bruge en primær antistof til påvisning af post-translationally modificerede versioner af protein af interesse. Her, blev PD-L1 antistof brugt til at registrere post-translationally modificerede PD-L1.
- Brug ultrasensitive kemiluminescens påvisning reagens til registrering.
Bemærk: Den kemiluminescerende reagens bør anvendes sammen med en HRP-mærket sekundær antistof i stand til at opdage det primære antistof. - Bruge en volumen på 2 mL af kemiluminescerende reagens pr. mini-gel mellemstore overførsel membran (ca. 8 x 7 cm).
- Efter inkubering med passende sekundær antistof (60 min. ved RT anbefales), vasker skamplet 6 x 10 min i 30 mL af tris-bufferet saltvand med tween-20 (TBST).
Bemærk: Se Tabel af materialer til buffer sammensætning. - Umiddelbart før anvendelsen, 1 mL af kemiluminescerende reagens A blandes med 1 mL af kemiluminescerende reagens B (tilstrækkelig for en 8 cm x 7 cm membran).
- Tilføje kemiluminescerende reagens til membran og inkuberes med blid vuggende på RT for 1-5 min før visualisering af protein signal ved hjælp af x-ray film eller afgift - sammen enhed (CCD) kamera billedbehandling.
Bemærk: Kortere inkuberingstider i den kemiluminescerende reagens kan være nødvendigt for meget rigelige proteiner.
- Efter inkubering med passende sekundær antistof (60 min. ved RT anbefales), vasker skamplet 6 x 10 min i 30 mL af tris-bufferet saltvand med tween-20 (TBST).
Representative Results
Disse værktøjer evne til at undersøge PTM krydstale ved effektivt at registrere disse 4 PTMs er delvis afhængig af unikke lysis buffersystem. BlastR denaturering buffer isolerer effektivt proteiner fra alle cellulære rum på samme måde til andre denaturering buffere, der sikrer en komplet protein profil (figur 2A). Derudover bevarer det meget labile PTM signaler som SUMO 2/3, som er hurtigt faldet i ikke-denatureringen buffere ligesom radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (figur 2B). Vigtigere, når fortyndet korrekt, det ikke påvirke integriteten af affinitet reagenser som andre denaturering buffere (f.eks. Laemmli buffer).
En væsentlig hurdle, når du arbejder med denaturering buffere er evnen til effektivt at fjerne genomisk DNA forurening. Den konventionelle metode til at reducere viskositeten er at vride DNA ved hjælp af en sprøjte nål eller sonicating prøven. Figur 3A viser genomisk DNA forurening i A431 celle lysate efter behandling med BlastR filter, sprøjte nål eller ultralydbehandling. Der er næsten fuldstændig fjernelse af genomisk DNA bruger filteret BlastR, hvilket ikke er tilfældet ved hjælp af en konventionel sprøjte nål eller ultralydbehandling. Genomisk DNA forurening væsentligt påvirker protein migration gennem en SDS-acrylamid gel; behandling med BlastR filter fjerner dog genomisk DNA, hvilket resulterer i korrekt protein migration (figur 3B). Ændrede migration forårsaget af genomisk DNA forurening har væsentlig indflydelse på fortolkning af western blotting; for eksempel, kan smurt EGFR mønsteret set i den ufiltrerede lysate fejlagtigt fortolkes som øget udtryk i forhold til den filtrerede prøve (figur 3 c).
Ved at udnytte denne optimerede PTM berigelse og registrering system, kan man hurtigt afgøre hvis en target protein er modificeret ved en eller flere PTMs. undersøgelse af PD-L1 PTM profil blev for nylig udført ved hjælp af denne teknik, og resultaterne viste, at PD-L1 ubiquitinated, acetyleret, og tyrosin fosforyleret svar på EGF (figur 4). Vigtigere, rapporterede disse data endogene PD-L1 PTM ændringer, som udgjorde en lille procentdel af den samlede PD-L1 identificeret.
Figur 1: filtrering genomisk DNA fra en celle i lysate med BlastR filter. (A) billede af BlastR filter. (B) Lysate er indlæst i det filter, der var placeret i en 15 mL collection tube. (C) stemplet er placeret ind i sprøjten og lysate er passeret gennem filteret af komprimering. (D) indsamle lysate, herunder eventuelle bobler gennem fuldstændig komprimering. (E) filtreret lysate.
Figur 2: sammenligning af BlastR lysisbuffer til alternative lysis buffere. Figur 2A tilpasset fra Horita et al. 2017. Biosci. Rep. 31 (A) A431 celler blev mængden med BlastR, RIPA, mPER, IP lysis, denatureringen (1% SDS), og Laemmli lysis buffere. Alle denaturering lysates havde genomisk DNA fjernes ved hjælp af BlastR filter. Isolering af proteiner fra membran, cytoplasmatisk, mitokondrier, og nukleare markører blev bestemt ved hjælp af antistoffer mod de respektive rum markør proteiner. (B) A431 celler blev mængden BlastR, RIPA og 1% SDS denaturering buffer. Lysates blev immunoprecipitated med SUMO 2/3 eller kontrol IgG affinitet perler. Prøver var adskilt af SDS-PAGE og analyseret af vestlige skamplet ved hjælp af en SUMO 2/3-peberrodsperoxidase (HRP) antistof. Repræsentant blotting fra N≥3 uafhængige forsøg er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: BlastR lysis filter er effektiv til at fjerne genomisk DNA. (A) A431 celler blev mængden med en denaturering lysisbuffer. Genomisk DNA blev fjernet eller forskydes med BlastR filter, sprøjte nål eller ultralydbehandling i 5, 10, 20 eller 30 sekunder. 2% af den lysate blev analyseret af ethidiumbromid, Agarosen gelelektroforese. (B) Lysate fra A431 celler mængden med en denaturering buffer var enten ufiltreret eller filtrere med BlastR filter. Prøver var adskilt med SDS-PAGE og visualiseres ved hjælp af Coomassie farvning. (C) to eksemplarer prøver fra B var adskilt af SDS-PAGE, overført til PVDF, og EGFR protein blev undersøgt ved hjælp af et EGFR antistof. Repræsentative klatter fra N ≥3 uafhængige forsøg er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: påvisning af EGF-induceret posttranslationelle modifikationer for PD-L1. Figur tilpasset fra Horita et al. 2017. neoplasi30(A). Serum-begrænset A431 celler var enten unstimulated (UT) eller stimuleret med EGF for én time før lysis med BlastR lysisbuffer. WCL blev analyseret for PD-L1 niveauer (baner 1,2). Ubiquitin bindende perler (UBA01) blev brugt til IP ubiquitinated proteiner (baner 3,4). Phosphotyrosine bindende perler (APY03) blev brugt til IP tyrosin-fosforyleret proteiner (baner 5,6). SUMO 2/3 bindende perler (ASM24) blev brugt til IP SUMOylated 2/3 proteiner (baner 7,8). Acetyl lysin bindende perler (AAC01) blev brugt til IP acetyleret proteiner (baner 9,10). IgG bindende kontrol perler blev brugt til at IP ikke-specifik binding proteiner (baner 11,12). Prøver var adskilt af SDS-PAGE og analyseret af vestlige skamplet ved hjælp af en PD-L1 antistof. En repræsentativ skamplet fra N ≥3 uafhængige forsøg er vist. Hvide stjerner blev brugt til at fremhæve PD-L1 pY og Ac protein bands. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Beregninger for BlastR lysisbuffer | ||||
| 1,0 mL | 2,0 mL | 5,0 mL | 10,0 mL | |
| BlastR lysisbuffer | 965 ΜL | 1930 ΜL | 4.825 mL | 9.650 mL |
| Tyrosin phosphatase hæmmer | 5 ΜL | 10 ΜL | 25 ΜL | 50 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase hæmmer | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| HDAC-hæmmer | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Protease hæmmer cocktail | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Beregninger for BlastR fortynding buffer | ||||
| 4,0 mL | 8,0 mL | 20,0 mL | 40.0 mL | |
| BlastR lysisbuffer | 3,86 mL | 7.72 mL | 19,3 mL | 38,6 mL |
| Tyrosin phosphatase hæmmer | 20 ΜL | 40 ΜL | 100 ΜL | 200 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase hæmmer | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| HDAC-hæmmer | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Protease hæmmer cocktail | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
Tabel 1: Lysis og fortynding Buffer forberedelse diagram. Diagram giver koncentrationer af hæmmere tilføjes for en given lysis og fortynding buffer volumen ved udarbejdelsen af buffere for celle lysering.
| Plade proteinindhold | Anbefalede BlastR lysisbuffer volumen | Anbefalede BlastR fortynding Buffer volumen |
| < 1 mg | Kombinere proteiner fra flere plader | At gøre 1,5 mL endelige rumfang |
| 1-2 mg | 300 ΜL | At gøre 1,5 mL endelige rumfang |
| 2-4 mg | 600 ΜL | At gøre 3 mL endelige rumfang |
| 4-6 mg | 900 ΜL | At gøre 4,5 mL endelige rumfang |
Tabel 2: BlastR Lysis/fortynding Buffer diagram. Diagram giver anbefalede lysis og fortynding buffer diskenheder, når opnåelse af lysate.
| Mængden af cellen lysate tilsættes 1 ml af præcision rød Protein Assay reagens (µL) | Multiplikatoren til brug med prøve læsning OD600 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
Tabel 3: Multiplikatorer at konvertere Spektrofotometer aflæsninger til mg/mL Lysate. Diagram giver konverteringstal til aide med beregning af proteinkoncentration.
| affinitet perler | volumen af perle gylle/IP (mL) |
| Ubiquitination | 20 |
| Phosphotyrosine | 30 |
| SUMOylation 2/3 | 40 |
| Acetylation | 50 |
| kontrol perler | volumen af perle gylle/IP (mL) |
| Ubiquitination kontrol perler | 20 |
| Phosphotyrsoine kontrol perler | 30 |
| SUMOylation 2/3 kontrol perler | 40 |
| Acetylation kontrol perler | 50 |
Tabel 4: Anbefalede mængde perler/IP diagram. Diagram giver anbefalede mængder af affinitet perler til at bruge pr IP reaktion.
Discussion
Første retningslinjer bruges til at bestemme, hvis en target protein er modificeret ved en PTM kan udføres ved hjælp af target protein specifikt antistof til IP, efterfulgt af vestlige skamplet med en PTM antistof (fx., anti-acetyl lysin), eller ved hjælp af en PTM antistof for IP, efterfulgt af vestlige skamplet med target protein specifikt antistof30,31,33. Mens begge tilgange teoretisk arbejde, har udnytte en target-protein-specifikke antistof flere potentielle faldgruber, såsom antistoffet kan ikke IP kompatibel, eller store PTM ændringer kan blokere antistof anerkendelse websted på target proteinet34 ,35. Fordelen ved PTM affinitet perler er at det antistof eller bindende domæner specifikt genkender PTM af interesse; således bør ændringer til target proteinet ikke ændre anerkendelse af affinitet perler. Som et eksempel, PD-L1 Ub blev identificeret med teknikken beskrevet her, og begge endogene mono - og poly-Ub blev observeret (figur 4). En nylig publikation af Lim mfl. udnyttet i vitro Ub teknikker til at undersøge PD-L1 Ub, og resultatet var meget lig resultaterne vist i figur 436. Interessant nok, optrådte de også IP med et PD-L1 antistof til at berige PD-L1 fra celle lysate, hvor Ub var overexpressed og MG-132 blev tilføjet for at forbedre signalet. Ub mønster var ikke robust og meget forskellige fra in vitro- Ub mønster. Undersøgelse af endogene PD-L1 Ub i celle kultur modeller blev ikke udført i Lim mfl. betænkningen at præcisere forskellen mellem deres celle kultur og in vitro- data.
Undersøger, om et protein er modificeret ved en PTM kan være udfordrende, på grund af sin lave overflod og forbigående natur37,38, og ofte kræver berigelse gennem IP. Effektiv IP af PTMs kræver optimering af flere vigtige skridt og reagenser, såsom lysis buffere og affinitet reagenser. Når undersøger flere PTMs af en target protein, øger den krævede optimering sandsynligt. Udnytte blastR lysis system er et afgørende skridt i denne protokol, da den fastholder robust IP kapacitet, samtidig med at PTM påvisning af pY, SUMO 2/3, Ub og Ac PTMs i et enkelt system. Denne teknik optimerer tid og ressourcer til at afgøre, om et bestemt mål protein er modificeret af disse fire PTMs, og potentielt giver et bedre billede af PTM krydstale i forhold til sammenligning PTM resultater udføres ved hjælp af flere lysis systemer. Undersøgelse af blastR lysis systemets kompatibilitet med alternative PTMs, ligesom glykosylering, blev udført; men det er ikke blevet undersøgt udtømmende for alle typer af PTMs.
Rigelige genomisk DNA kan interferere med protein målinger ved hjælp af enten kolorimetriske eller nanodrop metoder, påvirke migration af proteiner i en SDS acrylamid gel, og forhindre protein og affinitet matrix interaktion under IP assays. Metoden beskrevet her udnytter et specialiseret filter til at fjerne effektivt genomisk DNA forurening, som er en anden afgørende skridt i denne protokol. For at fremhæve dette punkt, viskositet tests blev udført før og efter blastR filter behandling, og resultaterne viste en nedsættelse fra en høj viskositet viskositet vand (data ikke vist). Denne ændring i viskositet blev støttet af resultaterne i figur 3, viser næsten alle genomisk DNA var blevet fjernet. Vigtigere, er DNA ikke forskydes med denne metode, som enhver afrevne DNA ikke vil blive fanget af filter (data ikke vist). Dette værktøj er overlegen i forhold til konventionelle metoder, som sonikering eller sprøjte-DNA-klipning, fordi det kræver ingen specialiseret udstyr, er yderst reproducerbare og fjerner DNA i stedet for klipning det. Derudover vil det ikke forringe protein i den lysate, som kan opstå ved hjælp af konventionelle metoder29. Udnytte filteret tager 5-30 sekunder pr. sample sammenlignet med alternative metoder, hvor effektiv fordeling af DNA kan tage flere minutter (dvs., sprøjte klipning) og kan resultere i stikprøven heterogenitet som DNA forurenende stoffer forbliver i den lysate. Omfattende analyse af lysate før og efter blastR filtrering blev udført, og ingen observerbare forskel i profilen protein blev observeret af Coomassie, destination-specifikke vestlige, eller total og target-specifikke PTM analyser; således kan integriteten af protein-profil ikke har påvirket ved at frafiltrere genomisk DNA. I sidste ende, dette filtersystem er gavnlige for western eller IP ansøgningen hvor genomisk DNA er til stede og kan påvirke fortolkningen af proteinanalyse.
Det er vigtigt at bemærke, at der er potentiale for falsk negativ opdagelse udnytte denne teknik, som kan skyldes delvis at affinitet perle mætning, bindende site indblanding eller PTM maskering. For eksempel, kan et særligt mål protein ændres af Ac på et meget lavt niveau; således kan det ikke være isoleret af pan-acetyl lysin affinitet perler, der har været mættet af mere rigelige Ac-modificerede mål proteiner. Igangværende undersøgelser udføres for at vurdere påvisningsgrænserne for affinitet reagenser udnyttes i denne protokol, men en nylig publikation tyder på en meget robust detektionsgrænsen. Data viste, at denne teknik kunne identificere så få som 17 acetyleret target proteinmolekyler pr. celle31. Stadig, særlige omstændigheder som celle type specificitet, forbigående PTMs som svar på bestemte stimuli, eller maskering af PTMs på grund af protein interaktion kan alle resultere i falske negative resultater. Disse er potentielle faldgruber af denne teknik, såvel som de fleste PTM IP metoder. Det anbefales således, at bekræfte resultater ved hjælp af flere metoder.
Ændringer som glykosylering og fosforylering har vist sig at konkurrere for lignende aminosyrer39,40, og andre PTMs som ubiquitination og fosforylering har vist sig at arbejde sekventielt for at regulere et protein funktionen17,41. Seneste arbejde Neuropatologisk protein Tau fremhævet betydningen af PTM krydstale, hvor Tau hyper-fosforylering og Tau SUMOylation forbedret hinanden42. Denne gruppe viste desuden, at SUMOylation af Tau forhindret poly-Ub og efterfølgende Tau nedbrydning, eventuelt fører til sammenlægning. Dette er blot et af mange eksempler på lovgivningsmæssige PTM krydstale, og nytten af denne teknik vil hjælpe til at belyse betydningen af PTMs og deres krydstale i reguleringen af vigtige proteiner i sundhed og sygdom.
Disclosures
H.H. og A.L. er ansatte i Cytoskeleton Inc. K.M. er grundlægger af Cytoskeleton Inc.
Acknowledgments
Vi takker Cytoskeleton Inc. forskere og Drs. Brian Hoover og Ashley Davis for deres kritisk gennemgang, redigering og frugtbare drøftelser på manuskriptet. Derudover takker vi Dr. Robert Hom for hans bidrag under produktionen af video håndskriftet. Dette arbejde blev støttet af midler fra Cytoskeleton Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D.
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W.
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
