Summary
Расследование нескольких, эндогенного столб-поступательные изменения для целевого белка может быть чрезвычайно сложной задачей. Описанные здесь методы используют оптимизированного лизис буфер фильтра разработанная система и с конкретными ПТМ таргетинг, матрицы сродства обнаружить ацетилирования, ubiquitination, SUMOylation 2/3 и тирозина фосфорилирование модификаций для целевого объекта белка с помощью единого, упорядоченной системы.
Abstract
Это сейчас хорошо оценили, что столб-поступательные изменения (PTMs) играют важную роль в регулировании структуры и функции, которые могут иметь важное значение для роли данного белка, физиологически и патологически белка. Обогащение PTMs часто бывает необходимо при расследовании PTM статус целевого белка, потому что PTMs часто являются временными и относительно низкая в изобилии. Многие подводные камни встречаются при обогащает PTM целевого белка, например буфер несовместимости, целевого белка антитела не является IP-совместимый, потеря сигнала PTM и др. Степень сложности усиливается при расследовании несколько PTMs как ацетилирования, ubiquitination, SUMOylation 2/3 и тирозина фосфорилирование для данного целевого белка. Изучая сочетание этих PTMs могут оказаться необходимыми, как перекрестных помех между PTMs распространенных и критических для регулирования белка. Часто эти PTMs изучаются в различных лизис буферов и с уникальными ингибитор композиции. Чтобы упростить процесс, уникальный денатурируя лизис была разработана система, эффективно изолирует и сохраняет эти четыре PTMs; Таким образом включение расследование потенциальных помех в системе единого lysis. Уникальный фильтр системы был спроектирован для удаления загрязнения геномной ДНК от lysate, который является проблематичным побочным продуктом денатурации буферов. В концерте с системой буфера для максимизации обогащения и обнаружения эндогенного государств этих четырех PTMs были разработаны матрицы надежные сродство ориентации каждого из четырех PTMs. Этот всеобъемлющий набор инструментов обнаружения PTM упрощает процесс получения важной информации о ли белок изменяется одним или несколькими из этих PTMs.
Introduction
Столб-поступательные изменения (PTMs), жестко регулируемых перестройка с белком, whereby модификация добавляется или удаляется в определенным образом. PTMs часто являются динамичной, переходные изменения, которые значительно изменить структуру протеина, взаимодействий с партнером белки и пространственной локализации и в конечном итоге позволит белка для выполнения отдельных функций1,2 , 3 , 4. PTMs настолько многочисленны, что они увеличивают количество уникальных белков формы (или proteoforms) от примерно 30 000 генов продуктов до более чем миллиона proteoforms5,6. Выявление PTMs и определение их влияния на целевой белок имеет решающее значение на пути к пониманию белка физиологических и патологических функции7,8,9,10, 11,12,,1314. Работа по выберите белки как тубулин, p53 и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) освещены нормативной роли PTMs15,16,17. Эти исследования выявили тот факт, что регулирование этих белков происходит на несколько PTMs, и во многих случаях эти изменения работают согласованно способствовать конкретной функции. Новые исследования показали, что как совместные, так и отрицательные перекрестных PTM может произойти на нескольких различных белков18,19,20,21,22, 2324,,25. Однако ПТМ профили большинства белков строятся из нескольких исследований, которые использовали различные модели и уникальные условия. Оптимизированные системы для изучения нескольких PTMs в одной системе было бы весьма полезно получить представление о потенциальных PTM перекрестных помех для целевого белка.
Одна проблема с расследованием PTMs в одной системе является, что конкретные PTMs исследованы с помощью различных лизис буферов. Например использование буферов как RIPA или NP-40, которые обычно используются для фосфорилирование или ubiquitination расследования может оказаться недостаточным для изучения лабильной PTM как маленький убиквитин как модификатор (сумо) ylation26. Кроме того не денатурации буферы являются недостаточными для отделения взаимодействий протеина и может привести к ложных положительных PTM идентификации27. Расследование PTMs денатурируя литического буфера может быть предпочтительным, как он значительно лучше на изоляцию белки от всех клеточных отсеков28, будет отделить большинство взаимодействий протеина и будет препятствовать протеаз, которые изменяют PTM государства, такие как deSUMOylases 26; Однако денатурации буферов может нарушить целостность конкретных сродство реагентов как убиквитин привязки на основе домена инструменты27. Лизис денатурации как системы для изучения нескольких PTMs белка в близость реагент совместимой системы было бы весьма полезно для PTM перекрестных исследований.
Хотя денатурируя буферы имеют преимущества над-денатурации буферы для расследования PTMs, они менее широко используются из-за их существенные недостатки, как несовместимость с обычными белка анализов, значительные геномной загрязнение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и срыва реагентов иммунопреципитации (IP)29. Эти недостатки может привести к расширенной подготовки и потенциальный ущерб для белков-мишеней при стрижки геномной ДНК. Два часто используемых методов для сдвига ДНК включать шприц лизис и sonication29. Оба метода требуют большой оптимизации и часто не хватает точных воспроизводимость. Альтернативные методы для удаления геномной ДНК включают добавление DNAses; Однако это может потребовать дополнительных оптимизации и изменения в составе буфера. В конечном счете простой и воспроизводимый метод, чтобы удалить загрязнения геномной ДНК бы полезно при работе с денатурации лизис буферы для расследований ПТМ.
Цель этой техники заключается в разработке системы изоляции и расследовать ubiquitination (Ub), фосфорилирования тирозина (pY), SUMOylation 2/3 (сумо 2/3) и PTMs ацетилирования (Ac) в одной системе лучше исследовать PTM перекрестных помех для целевого белка. Эта система обнаружения PTM был использован для быстро исследовать эндогенного PTM профиль нескольких целевых белков в одной системе. Новое понимание потенциальных помех был выявленных30,31. В целом, метод, описанный здесь улучшает существующие методы расследования PTMs и ПТМ перекрестных тремя разными способами: 1) уникальная денатурируя буфер был разработан которая изолирует белки от всех клеточных отсеков, сохраняя при этом совместимость с PTM сродство реагентов, 2) была разработана система уникальный фильтр, который быстро удаляет загрязнения геномной ДНК из денатурированные лизатов с высокой воспроизводимостью и требует без специального оборудования и 3) надежные сродство бусы, лизис системы и тормозной Реагенты, совместимы; Таким образом упрощая изоляции этих четырех PTMs для целевого белка максимизировать PTM обогащения, и эффективно изучать потенциальных помех.
Protocol
1. Пробоподготовка: Клеточная культура
- Расти четыре 150 мм пластин A431 клеток в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10%.
- Вырасти клетки A431 до 50% confluency.
- Сыворотка ограничить четырьмя пластинами клетки A431 с сыворотка свободный DMEM за 24 ч.
- Лечить две пластины с 33,3 мг/мл эпидермального фактора роста клетки A431, 1 ч. оставить другие две пластины не лечить.
Примечание: Клетки роста и лечения условий, показанный здесь служить примером; Однако эта методология применяется к много различных типов клеток и условий лечения.
- Подготовка blastR лизис и разбавления буферы с ингибиторами (Таблица 1). Объединить 2.895 мл буфера lysis blastR с 15 мкл фосфатазы ингибитор тирозин, 30 мкл deubiquitinase и ингибитора deSUMOylase, 30 мкл Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) и 30 мкл ингибитора протеазы коктейль.
- 9.65 мл буфера для разведения blastR в сочетании с 50 мкл фосфатазы ингибитор тирозин, 100 мкл deubiquitinase и ингибитора deSUMOylase, 100 мкл Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) и 100 мкл ингибитора протеазы коктейль.
Примечание: Буфер состав и АБС битор информацию смотрите в разделе Таблица материалов .
- 9.65 мл буфера для разведения blastR в сочетании с 50 мкл фосфатазы ингибитор тирозин, 100 мкл deubiquitinase и ингибитора deSUMOylase, 100 мкл Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) и 100 мкл ингибитора протеазы коктейль.
- Слить культуры средств массовой информации и место клетки на льду. Затем вымойте клетки дважды с 10 мл 1 x-фосфатный буфер (PBS).
- Удалите столько PBS как можно, перед добавлением буфера lysis blastR максимизировать лизис клеток.
Примечание: См. Таблицу материалов для буфера композиции.
- Удалите столько PBS как можно, перед добавлением буфера lysis blastR максимизировать лизис клеток.
- 600 мкл буфера lysis blastR для каждой пластины 150 мм. Объем буфера на основе ожидаемых белка урожая (Таблица 2).
- Лизируйте клетки, клетки скребком. Lysate будет становятся вязкими из-за ядерных lysis.
- Используйте срезанный 1 мл наконечник пипетки для передачи lysate сырой в blastR фильтр, который был помещен в коллекцию 15 мл (рис. 1). Здесь используется 15 мл трубки сокола.
- Используйте предоставленный фильтра поршень полностью сжимать blastR фильтр и собирать lysate проточный, включая любые пузыри в 15 мл трубку (рис. 1).
- Опционально: Передача разъяснил lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги lysate на примерно 10 000 x g 1 мин при 4 ° C.
- Супернатант передать новой трубки сокола 15 мл.
- Разбавить уточнить lysate с буфером для разбавления проб blastR окончательный объемом 3 мл для каждой пластины 150 мм. Окончательный объем на основе ожидаемых белка урожая (Таблица 2).
Примечание: Этот шаг имеет важное значение, поскольку состав окончательный буфера повлияет жесткости реакции IP. - Quantitate концентрацию белка (раздел 2).
2. белка Quantitation Assay
Примечание: Используйте количественный пробирного Стандартный колориметрический белка для определения белков quantitation. Здесь количественный белков определяется с помощью assay красный передовых протеина точности.
- Добавьте 1 mL реагента assay красный передовых протеина точности для каждой из двух кюветы 1 мл.
- Смесь 10 мкл буфера lysis blastR и 40 мкл буфера для разведения blastR в трубке microcentrifuge чистой 1,5 мл на льду.
Примечание: Это будет использоваться для чтения образец пустой протеина. - Добавьте 20 мкл смеси буфера lysis/разрежения (от шага 2.2) первый кювет и микс, инвертирование два-три раза.
- Добавьте 20 мкл разбавленного lysate клетки (эксперимент) для второй кювета, смешивания, как указано выше.
- Проинкубируйте образцы за 1 мин при комнатной температуре.
- Пустой спектрофотометр с образцом микс буфера lysis/разрежения (от шага 2.3).
- Измерение оптической плотности lysate образца (от шаг 2.4) на 600 Нм.
- Определить концентрацию белка lysate следующим образом;
Пример чтения ОД600 x 5 = концентрация белка в мг/мл
Примечание: OD чтений ниже 0,05 или выше 0.5 близки диапазона линейной емкости assay протеина. Для чтения > 0,5, образцы могут быть ослаблены. Для чтения < 0,05, более lysate могут быть добавлены к точности красный передовых белка пробирного реагента (до 50 мкл). Смотрите в таблице 3 для множители для преобразования спектрофотометр чтений в мг/мл, концентрация lysate белка. Если есть недостаточно белка в одной тарелке, рекомендуется использовать 2 или более пластины на IP. В этом случае плиты будет собран в серии, передачи оригинального 300 мкл буфера lysis между пластинами. - Основываясь на концентрацию белка, разбавить образца с буферной смеси (1 часть blastR лизис: 4 части blastR разрежения) к желаемой конечной концентрации (обычно 1 мг/мл).
- Оснастки заморозить аликвоты образцов, которые не будут использоваться сразу.
- Хранить образцы на 70 ° C.
- Перейдите к разделу 3.
3. иммунопреципитации (IP) Assay
Примечание: Бусина концентрации сходства, lysate концентрации и инкубации раз рекомендуются руководящие принципы и могут быть уникальными для каждого целевого белка и конкретных PTM ведется расследование.
- Инвертируйте запасов реагентов пробирки, содержащие Ub сродство бусины, pY сродство бусины, сумо сродство 2/3 бусины и Ac сродство бусы несколько раз чтобы убедиться, что бисер полностью высокомобильна в трубе.
- Для калибровочных IP аликвота бусины подвеска в microcentrifuge отдельные 1,5 мл пробирок на льду (IP трубки). Здесь добавьте 20 мкл убиквитин сродство бусы, 30 мкл phosphotyrosine сходства бусы, 40 мкл SUMOylation 2/3 сродство бусы или 50 мкл ацетилирования сродство бусины microcentrifuge отдельных 1.5 мл пробирок на льду.
Примечание: См. таблицу 4 рекомендуемый объем бусины подвеска для использования для каждого соответствия шарик. - Инвертируйте запасов реагентов пробирки, содержащие ubiquitination IP контроля бусины и бисер IgG управления несколько раз чтобы убедиться, что бисер полностью высокомобильна в трубе.
- Аликвота управления бисер на реакции управления для определения неспецифической привязки (управления IP трубки). Здесь добавьте 20 мкл Ub управления бусы, 30 мкл pY управления бусы, 40 мкл сумо управления 2/3 бусинок или 50 мкл переменного тока управления бусины microcentrifuge отдельных 1.5 мл пробирок на льду.
Примечание: См. таблицу 4 рекомендуемый объем бусины подвеска для использования для каждого типа схожести шарик. - Сохраните небольшое количество lysate (20 мкл) для запуска как западную помарку ввода lysate управления. 5 мкл 5 x буфер образца и варить при 95 ° C за 5 мин.
Примечание: См. Таблицу материалов для буфера композиции. - Добавьте lysate каждому IP трубки и управления ИС трубки. Здесь 1 мг lysate был использован на IP и управления реакции, что приводит к в общей сложности 8 IP реакций.
Примечание: 1,0 мг lysate за пробирного рекомендуется в качестве отправной точки. Количество lysate необходимо будет варьироваться в зависимости от обилия изменение целевого белка. - Инкубируйте трубы на вращающейся платформе-над конца на 4 ° C на 2 ч. Здесь ATR трубки ротатор был использован на скорости 22.
- Собирать бусы центрифугированием при 3000-5000 x g 1 мин при 4 ° C.
- Аспирационная покинуть столько супернатанта как можно не нарушая бисер.
- Вымойте бусины в 1 мл blastR мыть буфера (ингибиторов нет необходимости на данном этапе) для 5 мин на 4 ° C, вращающаяся платформа.
- Собирать бусы центрифугированием при 3000-5000 x g 1 мин при 4 ° C.
- Аспирационная покинуть столько супернатанта как можно не нарушая бисер.
- Повторите шаг мыть (шаги 3.10-3.12) еще два раза.
- После окончательной стирки полностью удалите супернатант буфера. Минимальное нарушение шарик Пелле является приемлемым (до 5% потерь). Удаление остаточных супернатанта, используя штраф родила белка загрузки подсказки.
- 30 мкл буфера шарик и Ресуспензируйте бисер, осторожно нажав/стряхивая стороне трубки. НЕ используйте пипетку на данном этапе.
Примечание: См. Таблицу материалов для буфера композиции. - Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Аккуратно передачи каждой бусины подвеска столбец спин microcentrifuge 1,5 мл, который был помещен в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
Примечание: Рекомендуется СНиП конце офф наконечник пипетки передачи для мягче передачи. - Центрифуга на 9000-10000 x g 1 мин при комнатной температуре пробы IP.
- 2 мкл 2-меркаптоэтанол для каждого образца и хорошо перемешать.
Примечание: Это удобно для оснастки крышку столбце спин и использовать это, чтобы крышка коллекции трубки для дальнейшей обработки. - Поместите образцы в ванну воды 95 ° C за 5 минут собрать образец центрифугированием на 10000 x г за 1 мин на RT.
- При необходимости хранить образцы-70 ° c и остановить здесь или перейти к SDS-PAGE, передачи и Западный анализ помаркой (раздел 4).
4. Западный анализ помаркой: Идентификация протеина интереса
- Отдельные образцы, натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) и передачи винилидена фторида (PVDF) мембраной, согласно стандартных лабораторных протоколы32.
- Используйте основное антитело для обнаружения post-translationally модифицированные версии протеина интереса. Здесь PD-L1 антитела был использован для обнаружения post-translationally изменение PD-L1.
- Используйте реагент сверхчувствительная хемилюминесценции обнаружения для обнаружения.
Примечание: Хемилюминесцентный реагент должны использоваться в сочетании с ПХ меченых вторичные антитела способны обнаруживать основное антитело. - Использование тома 2 мл реагента хемилюминесцентный за мини-gel-размера передачи мембраны (приблизительно 8 х 7 см).
- После инкубации с соответствующим вторичное антитело (рекомендуется 60 мин в РТ), стирать пятно 6 x 10 мин в 30 мл физиологического раствора трис буфер с tween-20 (TBST).
Примечание: См. Таблицу материалов для буфера композиции. - Непосредственно перед применением смешайте 1 mL реагента хемилюминесцентный A с 1 мл раствора реагента хемилюминесцентный B (достаточно для одного 8 х 7 см мембраны).
- Добавьте хемилюминесцентный реагент мембраны и проинкубируйте с плавное покачивание на RT для 1-5 мин до визуализации белка сигнала с использованием рентгеновской пленки или изображений камеры зарядовой (связью ПЗС).
Примечание: Короче инкубационного раз в хемилюминесцентный реагент может быть необходимо для очень обильные протеины.
- После инкубации с соответствующим вторичное антитело (рекомендуется 60 мин в РТ), стирать пятно 6 x 10 мин в 30 мл физиологического раствора трис буфер с tween-20 (TBST).
Representative Results
Способность этих инструментов расследования PTM перекрестных помех путем эффективного обнаружения этих 4 PTMs частично зависит от уникальных лизис буферной системе. BlastR денатурируя буфера эффективно изолирует белки от всех клеточных отсеков аналогично для других денатурируя буферов, который обеспечивает полный белка профиль (рис. 2A). Кроме того она сохраняет весьма лабильным PTM сигналы как сумо 2/3, который быстро уменьшается в-денатурации буферов как radioimmunoprecipitation проба (RIPA) (рис. 2B). Важно отметить, что при разбавлении надлежащим образом, это не влияет на целостность сродство реагентов как другие денатурируя буферов (например, буфер Лэмли).
Значительное препятствие при работе с денатурируя буферов является способность эффективно удалять загрязнения геномной ДНК. Обычные методологии для уменьшения вязкости является сдвига ДНК с помощью иглой шприца или sonicating образца. На рисунке 3A показывает геномной ДНК загрязнение в клетки A431 lysate после лечения с BlastR фильтр, игла шприца или sonication. Существует почти полное удаление геномной ДНК с помощью фильтра BlastR, которая не в случае с использованием обычных шприц иглой или sonication. Геномная ДНК загрязнения существенно влияет на белок миграции через гель SDS-акриламида; Однако лечение с BlastR фильтр удаляет геномной ДНК, что приводит к миграции надлежащего белка (рис. 3B). Изменены миграции, вызванной геномной ДНК загрязнения может существенно повлиять на толкование западных помарках; к примеру размытый шаблон EGFR, видели в нефильтрованное lysate может неточно толковаться как увеличение выражения по отношению к отфильтрованной образца (рис. 3 c).
Используя этот оптимизированный PTM обогащения системы и системы обнаружения, можно быстро определить если целевой белок изменяется одним или более PTMs. расследование PD-L1 PTM профиля недавно была выполнена с помощью этой методики, и результаты показали, что PD-L1 убиквитинированных, ацетилированные и тирозина, фосфорилированных в ответ на EGF (рис. 4). Важно отметить, что эти данные о эндогенного PD-L1 PTM изменения, которые составляют небольшой процент всего PD-L1 определены.
Рисунок 1: Фильтрация геномной ДНК от lysate клетки с фильтром BlastR. (A) изображение BlastR фильтр. (B) Lysate загружается в фильтр, который был помещен в 15 мл коллекции. (C) поршень помещается в шприц и lysate передается через фильтр сжатия. (D) собирайте lysate, включая любые пузыри через полное сжатие. (E) фильтр lysate.
Рисунок 2: сравнение BlastR буфера lysis альтернативных лизис буферы. Рисунок 2A адаптировано из Horita и др. 2017. Biosci. REP. 31 (A) клетки A431 были лизированы с BlastR, RIPA, mPER, IP лизиса, денатурации (1% SDS) и Лэмли лизис буферов. Все денатурируя лизатов имел геномной ДНК, удалены с помощью фильтра BlastR. Изоляция белков от мембраны, цитоплазмы, митохондриальных и ядерных маркеров были определены с использованием антитела против белков маркер соответствующих отсека. (B) клетки A431 были лизированы с BlastR, Раис и 1% SDS денатурируя буфера. Лизатов были immunoprecipitated с сумо 2/3 или управления IgG сродство бисером. Образцы были разделены SDS-PAGE и анализируется Западная помарка, используя антитело 2/3-пероксидаза (ПХ) сумо. Представитель помарок от N≥3 указаны независимые эксперименты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: BlastR лизис фильтр эффективны в удалении геномной ДНК. (A) клетки A431 были лизированы с денатурируя буфера lysis. Геномная ДНК был удален или стриженый с BlastR фильтр, игла шприца или sonication для 5, 10, 20 или 30 секунд. 2% от lysate был проанализирован бромид ethidium, электрофорез геля агарозы. (B) Lysate из клетки A431 лизированы с буфером денатурируя либо нефильтрованное или фильтр с помощью фильтра BlastR. Образцы были отделены с SDS-PAGE и визуализированы с помощью Кумасси пятно. (C) дубликатов образцов из B были разделены SDS-PAGE, переданы PVDF, и белка EGFR рассматривался с помощью EGFR антитела. Показываются представитель пятна от N ≥3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: обнаружение EGF-индуцированной столб-поступательные изменения для PD-L1. Рисунок, взято из Horita и др. 2017. злокачественные новообразования30(A). Сыворотка ограничено клетки A431 были либо кератоз (UT) или стимулировали с EGF за один час до лизис с BlastR буфера lysis. ВКТ была проанализирована для PD-L1 уровней (полос 1,2). Убиквитин привязки бисер (UBA01) были использованы для IP убиквитинированных белки (полос 3,4). Phosphotyrosine привязки бисер (APY03) были использованы для белки тирозин фосфорилированных IP (5,6 полос). СУМО 2/3 привязки бисер (ASM24) были использованы для IP SUMOylated 2/3 белки (полос 7,8). Ацетил лизин привязки бисер (AAC01) были использованы для IP ацетилированные белков (полос 9,10). IgG привязки управления бусины были использованы для IP привязки неспецифических белков (полос 11,12). Образцы были разделены SDS-PAGE и анализируется Западная помарка, используя антитело PD-L1. Представитель пятно от N ≥3 независимых экспериментов показано. Белые звездочки были использованы для выделения PD-L1 pY и Ac белка полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Расчеты для буфера lysis BlastR | ||||
| 1,0 мл | 2,0 мл | 5,0 мл | 10,0 мл | |
| Буфер BlastR Lysis | 965 МКЛ | 1930 МКЛ | 4.825 мл | 9.650 мл |
| Фосфатаза ингибитор тирозин | 5 МКЛ | 10 МКЛ | 25 МКЛ | 50 МКЛ |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase ингибитор | 10 МКЛ | 20 МКЛ | 50 МКЛ | 100 МКЛ |
| Ингибиторы ГДАЦ | 10 МКЛ | 20 МКЛ | 50 МКЛ | 100 МКЛ |
| Ингибитор протеазы коктейль | 10 МКЛ | 20 МКЛ | 50 МКЛ | 100 МКЛ |
| Расчеты для буфера для разведения BlastR | ||||
| 4.0 мл | 8.0 мл | 20,0 мл | 40.0 мл | |
| Буфер BlastR Lysis | 3.86 мл | 7.72 мл | 19.3 мл | 38,6 мл |
| Фосфатаза ингибитор тирозин | 20 МКЛ | 40 МКЛ | 100 МКЛ | 200 МКЛ |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase ингибитор | 40 МКЛ | 80 МКЛ | 200 МКЛ | 400 МКЛ |
| Ингибиторы ГДАЦ | 40 МКЛ | 80 МКЛ | 200 МКЛ | 400 МКЛ |
| Ингибитор протеазы коктейль | 40 МКЛ | 80 МКЛ | 200 МКЛ | 400 МКЛ |
Таблица 1: Лизис и разбавления буфера подготовка диаграммы. Диаграмма, обеспечивая концентрацию ингибиторов для добавления для данного лизис и разбавления объем буфера при подготовке буферов для лизиса клеток.
| Содержание белка пластины | Рекомендуемый объем буфера Lysis BlastR | Рекомендуемый объем буфера для разведения BlastR |
| < 1 мг | Объединить белка из нескольких пластин | Чтобы сделать окончательный объем 1,5 мл |
| 1-2 мг | 300 МКЛ | Чтобы сделать окончательный объем 1,5 мл |
| 2-4 мг | 600 МКЛ | Чтобы сделать окончательный объем 3 мл |
| 4-6 мг | 900 МКЛ | Чтобы сделать окончательный объем 4.5 мл |
Таблица 2: BlastR лизис/разрежения буфера диаграмма. График предоставления рекомендовал тома буфера lysis и разбавления, при получении lysate.
| Объем lysate клетки добавляется 1 ml реагента Assay протеина красный точности (мкл) | Множитель, который следует использовать с образцом, чтение ОД600 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
Таблица 3: Множители для преобразования спектрофотометр чтений в мг/мл Lysate. График предоставления преобразования чисел Помощник расчета концентрации протеина.
| сродство бисер | количество бисера навозной жижи/IP (мл) |
| Ubiquitination | 20 |
| Phosphotyrosine | 30 |
| SUMOylation 2/3 | 40 |
| Ацетилирования | 50 |
| управления бисер | количество бисера навозной жижи/IP (мл) |
| Ubiquitination управления бусины | 20 |
| Phosphotyrsoine управления бусины | 30 |
| Бусы SUMOylation управления 2/3 | 40 |
| Ацетилирование управления бусины | 50 |
Таблица 4: Рекомендуется объем бусины/IP диаграммы. График предоставления рекомендованных сумм бисера сродство для использования на IP реакции.
Discussion
Первоначальные подходы, используемые для определения, если целевой белок изменяется PTM может производиться с использованием целевого белка специфическое антитело для IP, следуют Западная помарка с PTM антитела (например., анти ацетил лизина), или с помощью PTM антитела для IP, Далее следуют Западная помарка с31,30,целевого белка специфическое антитело33. Хотя теоретически работать оба подхода, используя антитела целевых белков имеет больше потенциальных ошибок, такие как антитела не могут быть совместимы IP, или большие изменения PTM может заблокировать сайт признание антитела на целевого белка34 ,35. Преимущество шарики сходства PTM заключается в что антитело или связывания доменов конкретно признать PTM интерес; Таким образом изменения целевого белка не следует изменять признания сходства бисером. Например PD-L1 Ub отождествлялся с техникой, описанных здесь, и оба эндогенного моно - и поли Ub было отмечено (рис. 4). В недавно опубликованном Лим и др. использованы в vitro Ub методы расследования Ub PD-L1, и результат был очень похож на результаты, показанные на рисунке 436. Интересно, что они также исполнила IP с PD-L1 антитела обогатить PD-L1 от ячейки lysate, где оверэкспрессировали Ub и мг-132 было добавлено для повышения сигнал. Ub шаблон не был надежный и очень отличается от шаблона Ub в пробирке . Расследование эндогенного PD-L1 Ub в модели культуры клеток не была выполнена в Лим и др. доклад уточнить разницу между их культуры и в пробирке данные ячеек.
Расследование, изменяется ли белок PTM может быть сложным, благодаря своей низкой изобилия и преходящий характер37,38и часто требует обогащения через IP. Эффективное IP PTMs требует оптимизации нескольких ключевых шагов и реагенты, например лизис буферов и близость реагенты. При расследовании несколько PTMs целевого белка, вероятно требует оптимизации увеличивается. Используя blastR лизис системы является важнейшим шагом в этом протоколе, как он поддерживает надежные IP возможности, позволяя PTM обнаружения pY, сумо 2/3, Ub и PTMs переменного тока в одной системе. Эта технология оптимизирует время и ресурсы, необходимые для определения конкретных целевых белков изменяется, эти четыре PTMs и потенциально обеспечивает более четкое представление о перекрестных PTM относительно сравнения PTM результаты, с использованием нескольких систем лизиса. Расследование blastR лизис системы совместимости с альтернативной PTMs, как гликозилирования, была выполнена; Однако он не рассматривался исчерпывающим образом для всех видов PTMs.
Обильное геномной ДНК может мешать белка измерений с использованием колориметрического или nanodrop методы, влияющие на миграцию белков в Полимерность гелей SDS и предотвратить белка и близость матрица взаимодействия во время анализов IP. Метод, описанный здесь использует специализированный фильтр для эффективного удаления геномной ДНК загрязнения, которое является еще одним критическим шагом этого протокола. Чтобы подчеркнуть этот момент, вязкость испытания проводились до и после лечения blastR фильтра, и результаты показали снижение с высокой вязкостью до вязкости воды (данные не показаны). Это изменение вязкости было поддержано результаты на рисунке 3показаны, что почти все геномной ДНК была удалена. Важно отметить, что ДНК не состригается с помощью этого метода, как любой стриженый ДНК не будет захвачен фильтр (данные не показаны). Этот инструмент превосходит обычные методы, такие как sonication или шприц ДНК стрижка, потому что он не требует специализированного оборудования, высокую воспроизводимость и удаляет ДНК, а не резать его. Кроме того он не будет деградировать белок в lysate, который может произойти с использованием обычных методов29. Используя фильтр принимает 5-30 секунд на сэмпл, по сравнению с альтернативными методами, где эффективное распределение ДНК может занять несколько минут (т.е., шприц сдвига) и может привести к неоднородности образец как ДНК загрязнителей остаются в lysate. Был проведен обширный анализ lysate blastR до и после фильтрации и наблюдаемой разницы в профиль белка наблюдали Кумасси, целевой объект специфического Западной, или общее и целевой объект специфического PTM анализов; Таким образом целостность профиль белка может не были затронуты отфильтровывать геномной ДНК. В конечном итоге этот фильтр система полезна для любой западной или IP приложения, где геномной ДНК присутствует и может повлиять на интерпретацию анализа белка.
Важно отметить, что существует потенциал для ложные отрицательные обнаружения, используя эту технику, которая может быть частично обусловлено близость шарик насыщения, привязки сайта вмешательства или PTM маскировки. Например конкретного целевого белка может быть изменен с переменного тока на очень низком уровне; Таким образом он не может быть изолированы Пан ацетил лизин сродство бусы, которые был насыщен более обильные Ac изменение целевых белков. Текущие исследования проводятся для оценки пределов обнаружения сходства реагентов, используемых в настоящем Протоколе, но недавнее издание предлагает очень надежного обнаружения предел. Данные показали, что этот метод можно определить как 17 ацетилированный целевой белковых молекул в ячейке31. Тем не менее конкретные обстоятельства таких клеток типа конкретности, переходных PTMs в ответ на конкретные стимулы, или маскировки PTMs из-за взаимодействия протеина могут все результат в ложные отрицательные результаты. Это потенциальные ловушки этой техники, а также большинство методов PTM IP. Таким образом рекомендуется для подтверждения результатов, используя несколько подходов.
Было показано, что изменения как гликозилирование и фосфорилирование конкурировать за аналогичные аминокислот39,40и других PTMs, как работать последовательно регулировать белка показали ubiquitination и фосфорилирование Функция17,41. Последние работы по патологического белка Тау подчеркнул важность PTM перекрестных помех, где Тау гипер фосфорилирования и Тау SUMOylation укрепить друг друга42. Кроме того эта группа показала, что SUMOylation Тау предотвратить поли Ub и последующие Тау деградации, возможно, приведет к агрегации. Это лишь один из многих примеров регулирования PTM перекрестных помех, и полезность этой техники поможет осветить важность PTMs и их уровень помех в регулировании основных белков в здоровье и болезни.
Disclosures
Его Высочество и а.л. являются сотрудники цитоскелета Inc. к.м. является основателем цитоскелета Inc.
Acknowledgments
Мы благодарим цитоскелета Inc. исследования ученых и Drs. Брайан Hoover и Дэвис Эшли за их критического обзора, редактирования и плодотворных дискуссий по рукописи. Кроме того мы благодарим д-р Роберт Hom за его вклад во время производства видео рукописи. Эта работа была поддержана финансирование из цитоскелет Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D.
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W.
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
