At undersøge flere, kan endogene posttranslationelle modifikationer for en target protein være ekstremt udfordrende. Teknikker beskrevet her udnytte en optimeret lysis buffer og filter system udviklet med specifikke PTM målretning, affinitet matricer til at registrere acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering ændringerne for et mål protein ved hjælp af et enkelt, strømlinet system.
Det er nu godt værdsat, at posttranslationelle modifikationer (PTMs) spille en integrerende rolle i reguleringen af en protein struktur og funktion, som kan være afgørende for en given protein rolle både fysiologisk og patologisk. Berigelse af PTMs er ofte nødvendig, når undersøger PTM status for et mål protein, fordi PTMs er ofte forbigående og relativt lav i overflod. Mange faldgruber er stødt når berigende for en PTM en target protein, som buffer uforenelighed, target protein antistof er ikke IP-kompatible, PTM signaltab og andre. Graden af sværhedsgrad er forstørret når undersøger flere PTMs som acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering for en given mål protein. At studere en kombination af disse PTMs kan være nødvendigt, da krydstale mellem PTMs er udbredt og kritisk til protein forordning. Ofte, er disse PTMs studeret i forskellige lysis buffere og med unikke hæmmer kompositioner. Hen til simplificere oparbejde, et unikt denaturering lysis system blev udviklet som effektivt isolerer og bevarer disse fire PTMs; således, at undersøgelsen af potentielle krydstale i en enkelt lysis system. Et unikt filtersystem blev manipuleret til at fjerne forurenende genomisk DNA fra den lysate, som er en problematisk biprodukt af denatureringen buffere. Robust affinitet matricer rettet mod hver af de fire PTMs blev udviklet i koncert med buffersystem til at maksimere berigelse og påvisning af de endogene stater af disse fire PTMs. Denne omfattende PTM påvisning værktøjssæt strømliner processen med at opnå vigtige oplysninger om om et protein er modificeret ved en eller flere af disse PTMs.
Posttranslationelle modifikationer (PTMs) er stærkt reguleret ændringer til et protein, hvorved ændringen er tilføjet eller fjernet på en bestemt måde. PTMs er ofte dynamisk, forbigående ændringer, som markant ændrer proteinets struktur, interaktioner med partner proteiner, og geografisk lokalisering, og i sidste ende gør det muligt for protein til at udføre forskellige funktioner1,2 , 3 , 4. PTMs er så rigelige, at de øger antallet af unikke protein former (eller proteoforms) fra omkring 30.000 genprodukter til over en million proteoforms5,6. At identificere PTMs og definere deres effekt på et mål protein er kritiske mod forståelse proteinets fysiologiske og patologiske funktioner7,8,9,10, 11,12,13,14. Arbejde på Vælg proteiner som tubulin, p53 og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) har belyst de regulerende roller PTMs15,16,17. Disse undersøgelser afslørede, at reguleringen af disse proteiner opstår af flere PTMs, og i mange tilfælde disse ændringer arbejde i fællesskab for at fremme en bestemt funktion. Nye undersøgelser har vist, at både kooperativ og negative PTM krydstale kan forekomme på flere forskellige proteiner18,19,20,21,22, 23,24,25. Imidlertid bygges PTM profiler af størstedelen af proteiner fra flere undersøgelser, der har brugt forskellige modeller og unikke forhold. At have et optimeret system at undersøge flere PTMs i ét system ville være meget gavnligt at få indsigt i potentielle PTM krydstale for en target protein.
En udfordring med at undersøge PTMs i et enkelt system er, at specifikke PTMs undersøges ved hjælp af særskilte lysis buffere. For eksempel, kan udnyttelse af buffere som RIPA eller NP-40, der er almindeligt anvendt til fosforylering eller ubiquitination undersøgelser være utilstrækkelige til at studere en labile PTM som små ubiquitin-lignende modifier (SUMO) ylation26. Derudover ikke denatureringen buffere er utilstrækkelige for fællesinstansen protein interaktioner, og kan føre til falsk positive PTM identifikation27. Undersøger PTMs i en denaturering lysisbuffer kan være foretrukne, da det er betydeligt bedre på at isolere proteiner fra alle cellulære rum28, vil adskille de fleste protein interaktioner og vil hæmme proteaser, der ændrer PTM stater, såsom deSUMOylases 26; dog kan denatureringen buffere kompromittere integriteten af specifik affinitet reagenser som ubiquitin bindende domæne-baserede værktøjer27. Udvikle en denaturering-lignende lysis system at studere flere PTMs af en protein i en affinitet reagens-kompatibelt system ville være meget gavnlige for PTM krydstale undersøgelser.
Selv om denaturering buffere har vigtigste fordele i forhold til ikke-denatureringen buffere for at undersøge PTMs, de er mindre almindeligt anvendt på grund af deres betydelige ulemper såsom uforenelighed med konventionelle protein assays, betydelig genomisk Deoxyribonukleinsyre (DNA) forurening, og afbrydelse af immunoprecipitation (IP) reagenser29. Disse ulemper kan resultere i forlængede forberedelsestid og potentielle skader på target proteiner når klipning genomisk DNA. To almindeligt anvendte metoder til at vride DNA omfatter sprøjte lysis og ultralydbehandling29. Begge metoder kræver omfattende optimering og ofte mangler præcise reproducerbarhed. Alternative metoder til at fjerne genomisk DNA omfatter tilføjelse af DNAses; Dette kan dog kræve yderligere optimering og ændringer i buffer sammensætning. I sidste ende, en simpel og reproducerbar metode til at fjerne genomisk DNA forurening ville være gavnligt, når du arbejder med denatureringen lysis buffere for PTM undersøgelser.
Målet med denne teknik er at udvikle et system for at isolere og undersøge ubiquitination (Ub), tyrosin fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) og acetylation (Ac) PTMs i et enkelt system til bedre undersøge PTM krydstale for en target protein. Denne PTM detection system blev udnyttet til at hurtigt undersøge den endogene PTM profil af flere mål proteiner i et enkelt system. Ny indsigt i potentielle krydstale blev identificeret30,31. Alt i alt den teknik beskrevet her forbedrer på eksisterende metoder til at undersøge PTMs og PTM krydstale på tre forskellige måder: 1) en unik denaturering buffer blev udviklet der isolerer proteiner fra alle cellulære rum, mens den stadig er kompatibel med PTM affinitet reagenser, 2) et unikt filtersystem blev udviklet som hurtigt fjerner genomisk DNA forurening fra denatureret lysates med høj reproducerbarhed og kræver ingen specialudstyr og 3) robuste affinitet perler, lysis system, og hæmmende reagenser er forenelige; således forenkle isolationen af disse fire PTMs for en target protein til at maksimere PTM berigelse, og effektivt undersøge potentielle krydstale.
Første retningslinjer bruges til at bestemme, hvis en target protein er modificeret ved en PTM kan udføres ved hjælp af target protein specifikt antistof til IP, efterfulgt af vestlige skamplet med en PTM antistof (fx., anti-acetyl lysin), eller ved hjælp af en PTM antistof for IP, efterfulgt af vestlige skamplet med target protein specifikt antistof30,31,33. Mens begge tilgange teoretisk arbejde, har udnytte en target-protein-specifikke antistof flere potentielle faldgruber, såsom antistoffet kan ikke IP kompatibel, eller store PTM ændringer kan blokere antistof anerkendelse websted på target proteinet34 ,35. Fordelen ved PTM affinitet perler er at det antistof eller bindende domæner specifikt genkender PTM af interesse; således bør ændringer til target proteinet ikke ændre anerkendelse af affinitet perler. Som et eksempel, PD-L1 Ub blev identificeret med teknikken beskrevet her, og begge endogene mono – og poly-Ub blev observeret (figur 4). En nylig publikation af Lim mfl. udnyttet i vitro Ub teknikker til at undersøge PD-L1 Ub, og resultatet var meget lig resultaterne vist i figur 436. Interessant nok, optrådte de også IP med et PD-L1 antistof til at berige PD-L1 fra celle lysate, hvor Ub var overexpressed og MG-132 blev tilføjet for at forbedre signalet. Ub mønster var ikke robust og meget forskellige fra in vitro- Ub mønster. Undersøgelse af endogene PD-L1 Ub i celle kultur modeller blev ikke udført i Lim mfl. betænkningen at præcisere forskellen mellem deres celle kultur og in vitro- data.
Undersøger, om et protein er modificeret ved en PTM kan være udfordrende, på grund af sin lave overflod og forbigående natur37,38, og ofte kræver berigelse gennem IP. Effektiv IP af PTMs kræver optimering af flere vigtige skridt og reagenser, såsom lysis buffere og affinitet reagenser. Når undersøger flere PTMs af en target protein, øger den krævede optimering sandsynligt. Udnytte blastR lysis system er et afgørende skridt i denne protokol, da den fastholder robust IP kapacitet, samtidig med at PTM påvisning af pY, SUMO 2/3, Ub og Ac PTMs i et enkelt system. Denne teknik optimerer tid og ressourcer til at afgøre, om et bestemt mål protein er modificeret af disse fire PTMs, og potentielt giver et bedre billede af PTM krydstale i forhold til sammenligning PTM resultater udføres ved hjælp af flere lysis systemer. Undersøgelse af blastR lysis systemets kompatibilitet med alternative PTMs, ligesom glykosylering, blev udført; men det er ikke blevet undersøgt udtømmende for alle typer af PTMs.
Rigelige genomisk DNA kan interferere med protein målinger ved hjælp af enten kolorimetriske eller nanodrop metoder, påvirke migration af proteiner i en SDS acrylamid gel, og forhindre protein og affinitet matrix interaktion under IP assays. Metoden beskrevet her udnytter et specialiseret filter til at fjerne effektivt genomisk DNA forurening, som er en anden afgørende skridt i denne protokol. For at fremhæve dette punkt, viskositet tests blev udført før og efter blastR filter behandling, og resultaterne viste en nedsættelse fra en høj viskositet viskositet vand (data ikke vist). Denne ændring i viskositet blev støttet af resultaterne i figur 3, viser næsten alle genomisk DNA var blevet fjernet. Vigtigere, er DNA ikke forskydes med denne metode, som enhver afrevne DNA ikke vil blive fanget af filter (data ikke vist). Dette værktøj er overlegen i forhold til konventionelle metoder, som sonikering eller sprøjte-DNA-klipning, fordi det kræver ingen specialiseret udstyr, er yderst reproducerbare og fjerner DNA i stedet for klipning det. Derudover vil det ikke forringe protein i den lysate, som kan opstå ved hjælp af konventionelle metoder29. Udnytte filteret tager 5-30 sekunder pr. sample sammenlignet med alternative metoder, hvor effektiv fordeling af DNA kan tage flere minutter (dvs., sprøjte klipning) og kan resultere i stikprøven heterogenitet som DNA forurenende stoffer forbliver i den lysate. Omfattende analyse af lysate før og efter blastR filtrering blev udført, og ingen observerbare forskel i profilen protein blev observeret af Coomassie, destination-specifikke vestlige, eller total og target-specifikke PTM analyser; således kan integriteten af protein-profil ikke har påvirket ved at frafiltrere genomisk DNA. I sidste ende, dette filtersystem er gavnlige for western eller IP ansøgningen hvor genomisk DNA er til stede og kan påvirke fortolkningen af proteinanalyse.
Det er vigtigt at bemærke, at der er potentiale for falsk negativ opdagelse udnytte denne teknik, som kan skyldes delvis at affinitet perle mætning, bindende site indblanding eller PTM maskering. For eksempel, kan et særligt mål protein ændres af Ac på et meget lavt niveau; således kan det ikke være isoleret af pan-acetyl lysin affinitet perler, der har været mættet af mere rigelige Ac-modificerede mål proteiner. Igangværende undersøgelser udføres for at vurdere påvisningsgrænserne for affinitet reagenser udnyttes i denne protokol, men en nylig publikation tyder på en meget robust detektionsgrænsen. Data viste, at denne teknik kunne identificere så få som 17 acetyleret target proteinmolekyler pr. celle31. Stadig, særlige omstændigheder som celle type specificitet, forbigående PTMs som svar på bestemte stimuli, eller maskering af PTMs på grund af protein interaktion kan alle resultere i falske negative resultater. Disse er potentielle faldgruber af denne teknik, såvel som de fleste PTM IP metoder. Det anbefales således, at bekræfte resultater ved hjælp af flere metoder.
Ændringer som glykosylering og fosforylering har vist sig at konkurrere for lignende aminosyrer39,40, og andre PTMs som ubiquitination og fosforylering har vist sig at arbejde sekventielt for at regulere et protein funktionen17,41. Seneste arbejde Neuropatologisk protein Tau fremhævet betydningen af PTM krydstale, hvor Tau hyper-fosforylering og Tau SUMOylation forbedret hinanden42. Denne gruppe viste desuden, at SUMOylation af Tau forhindret poly-Ub og efterfølgende Tau nedbrydning, eventuelt fører til sammenlægning. Dette er blot et af mange eksempler på lovgivningsmæssige PTM krydstale, og nytten af denne teknik vil hjælpe til at belyse betydningen af PTMs og deres krydstale i reguleringen af vigtige proteiner i sundhed og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cytoskeleton Inc. forskere og Drs. Brian Hoover og Ashley Davis for deres kritisk gennemgang, redigering og frugtbare drøftelser på manuskriptet. Derudover takker vi Dr. Robert Hom for hans bidrag under produktionen af video håndskriftet. Dette arbejde blev støttet af midler fra Cytoskeleton Inc.
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
cell scrapers | Costar | 3008 | |
BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
PTM Immunoprecipitation | |||
Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
Cell growth and treatment | |||
Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |