Summary
複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1 つの合理化されたシステムを使用して蛋白質。
Abstract
それは今ポスト翻訳の修正 (Ptm) はタンパク質の構造と機能、生理学的および病理学的に与えられた蛋白質の役割のために不可欠かもしれないの調節に不可欠な役割を果たすは当然。Ptm の濃縮は、ターゲット蛋白質の PTM の状態を調査するとき、Ptm は一時的なことが多いし、比較的低い豊富で必要があります。ターゲット蛋白質の PTM の豊かなときに多くの落とし穴が発生した IP 対応、PTM の信号の損失はバッファーの非互換性などターゲット蛋白抗体はありません。指定されたターゲット蛋白質のためのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化のような複数の Ptm を調査するとき、難易度が拡大されます。Ptm 間のクロストークが普及し蛋白質の規則のために重要なこれらの Ptm の組み合わせを勉強する必要があります。多くの場合、これらの Ptm は異なる換散バッファーとユニークな阻害剤組成を研究されています。プロセスを簡素化する、ユニークな変性溶解装置の開発を効果的に分離し、これらの 4 つの Ptm; を維持したがって、単一の溶解システムで潜在的なクロストークの調査を有効にします。ユニークなフィルター システムは、削除バッファーの変化の問題の副産物である、ライセートからゲノム DNA を汚染する設計されました。ターゲットにそれぞれ 4 つの Ptm の強固な親和性のマトリックスは、濃縮とこれらの 4 つの Ptm の内因性の状態の検出を最大限にバッファー システムと連動で開発されました。この包括的な PTM 検出ツールは、1 つ以上これらの Ptm の蛋白質を変更するかどうかに関する重要な情報を取得するプロセスを合理化します。
Introduction
翻訳後修飾 (Ptm) が規制の厳しい変更蛋白質、変更を追加または特定の方法で削除するという。Ptm は、過渡変化蛋白質の構造を大幅変更するパートナー蛋白質と空間定位、最終的に異なる機能1,2を実行するタンパク質を有効にすると相互作用,3,4. Ptm が豊富な彼らは以上 100 万 proteoforms5,6約 30,000 の遺伝子産物からユニークなタンパク質フォーム (または proteoforms) の数を増加します。Ptm を識別して、標的のタンパク質への影響を定義する蛋白質の生理学的および病理学的機能7,8,9,10の理解に向けて重要です。 11,12,13,14。上皮成長因子受容体 (EGFR)、p53、チューブリンは Ptm15,16,17の規制の役割を解明したような選択のタンパク質についての研究します。これらの研究は、実際には複数の Ptm によってこれらの蛋白質の規制が発生し、多くの場合これらの変更は特定の機能を促進するために連携して動作を発見しました。新しい研究は、その協同と負 PTM のクロストークが発生するいくつかの異なった蛋白質18,19,20,21,22,の示されている23,24,25。ただし、タンパク質の大半の PTM のプロファイルは、さまざまなモデルや独自の条件を使用しているいくつかの研究から構築されます。1 つのシステムで複数の Ptm を調査するために最適化されたシステムを持つことはターゲット蛋白質の潜在的な PTM クロストークに洞察力を得るために非常に有益でしょう。
単一のシステムで Ptm の調査を 1 つの課題は、明確な換散バッファーを使用して特定の Ptm を調査することです。たとえば、リッパや NP 40 のようなリン酸化やユビキチン化調査に一般的に使用されるバッファーの使用率は小さなユビキチン様修飾 (相撲) ylation26のような不安定な PTM を勉強するために十分なあります。さらに、非変性バッファーが十分な蛋白質の相互作用を分離して偽肯定的な PTM 識別27につながることができます。それはすべての細胞コンパートメント28からタンパク質を分離することで大幅に向上は、ほとんどの蛋白質の相互作用が分離するしまうし、よう PTM の状態を変更するプロテアーゼを阻害する変性の換散バッファーの Ptm を調査が好まれるかもしれませんdeSUMOylases 26;ただし、バッファーの変化とユビキチン結合ドメイン ベースのツール27など特定のアフィニティ試薬の整合性が損なわれます。親和性試薬と互換性のあるシステムで蛋白質の複数の Ptm を勉強する変性のような溶解システム開発は PTM クロストーク調査にとって非常に有益でしょう。
従来の蛋白質の試金、重要な非互換性など、重大な欠点のために使用頻度が低い変性バッファーは、非変性バッファー Ptm を調査するための重要な利点を持っていますが、ゲノムデオキシリボ核酸 (DNA) の汚染および免疫沈降法 (IP) 試薬29停止。これらの欠点は、ゲノム DNA をせん断時ターゲット蛋白質に拡張の準備時間と潜在的な損傷で起因できます。DNA をせん断する 2 つの一般的に使用される方法には、注射器溶解および超音波処理29が含まれます。両方の方法は、広範な最適化を必要とし、正確な再現性に欠けます。ゲノム DNA を削除する別の方法は、Dnase; 添加しかし、これは、さらなる最適化とバッファー組成の変化を必要があります。最終的には、PTM の調査のための換散バッファーの変化を操作するとき、ゲノム DNA 汚染を削除するシンプルで再現性のある方法が有益となります。
この手法の目的は、分離しより良いターゲット蛋白質の PTM クロストークを調査する 1 つのシステムで Ptm (Ac) のアセチル化、sumo 化 2/3 (2/3 相撲)、チロシンリン酸化 (pY) ユビキチン (Ub) を調査するシステムを開発します。この PTM 検出システムに急速に単一のシステムで複数のターゲット蛋白質の内因性の PTM プロファイルを調査に利用されました。潜在的なクロストークに新しい洞察力は、識別された30,31だった。全体的に、ここで説明する手法は Ptm と PTM を調査するための既存の方法の向上 3 つの異なる方法でクロストーク: 1) 独自の変性バッファー開発ながらと互換性のあるすべての細胞コンパートメントからタンパク質を分離します。PTM 親和性試薬、2) ユニークなフィルター装置の開発を急速に再現性の高い変性 lysates からゲノム DNA 汚染を削除し、ない専用の装置と 3 が必要です) 堅牢なアフィニティ ビーズ、溶解システム、および抑制試薬はある;したがって、PTM 濃縮を最大化し、効率的に潜在的なクロストークを調べるターゲット蛋白質のこれらの 4 つの Ptm の分離を簡素化します。
Protocol
1. 前処理: 細胞培養
- ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清を添加した A431 細胞の 4 つの 150 の mm プレートを成長します。
- 50% の confluency に A431 細胞を成長します。
- 血清は、24 時間無料の血清 DMEM に A431 細胞の 4 つのプレートを制限します。
- 1 h. まま放置されて他の 2 つのプレートは、33.3 mg/ml の表皮の成長因子の A431 細胞の 2 つのプレートを扱います。
注: ここに示すセル成長および治療条件提供例;ただし、この方法は、多くの異なる種類の細胞、処理条件に適用されます。
- BlastR 阻害剤 (表 1) 溶解と希釈バッファーを準備します。チロシン脱燐酸化酵素阻害剤、脱ユビキチン化酵素 deSUMOylase 阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤 30 μ と 30 μ L のプロテアーゼ抑制剤のカクテルの 30 μ L の 15 μ L と blastR 換散バッファーの 2.895 mL を組み合わせます。
- チロシン脱燐酸化酵素阻害剤、脱ユビキチン化酵素 deSUMOylase 阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤の 100 μ L とプロテアーゼ阻害剤のカクテルの 100 μ L の 100 μ L の 50 μ L で 9.65 mL の blastR 希釈バッファーを組み合わせます。
注: バッファー組成と阻害剤については、材料の表を参照してください。
- チロシン脱燐酸化酵素阻害剤、脱ユビキチン化酵素 deSUMOylase 阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤の 100 μ L とプロテアーゼ阻害剤のカクテルの 100 μ L の 100 μ L の 50 μ L で 9.65 mL の blastR 希釈バッファーを組み合わせます。
- 培地を注ぎ、氷の上のセルを置きます。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 10 mL で 2 回細胞を洗います。
- セル換散を最大限に blastR 換散バッファーを追加する前にできるだけ多くの PBS を削除します。
注: バッファー組成材料の表を参照してください。
- セル換散を最大限に blastR 換散バッファーを追加する前にできるだけ多くの PBS を削除します。
- 各 150 mm 板 blastR 換散バッファーの 600 μ L を追加します。バッファーの量は、予想される蛋白質収量 (表 2) に基づいています。
- 細胞スクレーパーを使用して細胞を溶解させます。ライセートは、核溶解による粘性になります。
- 切り取られた 1 mL ピペット チップを使用すると、15 mL コレクション チューブ (図 1) に配置されている blastR フィルターに原油のライセートを転送します。ここでは、15 mL の隼の管が使用されます。
- 完全、ライセート通過、15 mL チューブ (図 1) で任意の気泡を含む収集 blastR フィルターを圧縮して指定されたフィルター プランジャーを使用します。
- (省略可能) 転送明らかに 1.5 mL 遠心チューブ、4 ° C で 1 分間遠心する約 10,000 x g でライセート ライセート
- 上清を新しい 15 mL ファルコン チューブに転送します。
- 明らかにし希釈 lysate blastR 希釈バッファー 150 mm の板をそれぞれ 3 mL の最終巻。最終巻は、予想される蛋白質収量 (表 2) に基づいています。
注: この手順は、最後のバッファー組成は IP 反応を厳密に影響を与えることが重要です。 - 蛋白質の集中 (セクション 2) 量的に表わします。
2. タンパク質定量分析
注: は、タンパク定量法を決定するための標準的な比色タンパク質定量分析を利用します。ここでは、タンパク定量法は、精度赤高度な蛋白質の試金を使用して決定されます。
- 2 つの 1 mL キュベットのそれぞれに精度赤高度な蛋白質の試金の試薬の 1 つの mL を追加します。
- BlastR 換散バッファーの氷の上のきれいな 1.5 mL 遠心チューブに blastR 希釈バッファーの 40 μ L ミックス 10 μ L。
注: これは、空白の蛋白質のサンプルを読んで使用されます。 - 2 〜 3 倍の反転によって最初のキュベットとミックスに (手順 2.2) から溶解/希釈バッファー ミックスの 20 μ L を追加します。
- 希薄化後の細胞ライセートの 20 μ L を追加 (実験) から上記のように 2 番目のキュベットに混合します。
- 部屋の温度で 1 分のサンプルをインキュベートします。
- 空白分光光度計 (ステップ 2.3) から溶解/希釈バッファー ミックス サンプル。
- 600 (ステップ 2.4) からライセート サンプルの吸光度を測定 nm。
- とおり; ライセート タンパク質濃度を測定します。
外径600 x 5 を読んでサンプル = mg/mL の蛋白質の集中
注: OD 測定値 0.5 以上 0.05 以下が蛋白質の試金の線形範囲容量の近くにあります。測定値 > 0.5、サンプルを希釈することができます。朗読の < 0.05、ライセートより精度赤高度な蛋白質の試金の試薬 (最大 50 μ L) に追加できます。分光光度計の測定値を mg/mL 溶解液のタンパク質濃度に変換する乗算器係数の表 3を参照してください。一皿で十分なタンパク質がある場合は、IP あたり 2 つ以上のプレートを使用することをお勧めします。この場合、板はシリーズは、プレート間の換散バッファーの元の 300 μ L を転送する収穫されます。 - バッファーでサンプルを希釈タンパク質濃度に基づいて、(1部 blastR 換散: 4 つの部分 blastR 希釈) 希望最終濃度 (通常 1 mg/mL) に。
- すぐには使用されませんのサンプルの因数に凍結します。
- -70 ° C で試料を保存します。
- セクション 3 に進んでください。
3. 免疫沈降 (IP) アッセイ
注: アフィニティ ビーズ濃度、溶解液の濃度、インキュベーション時間が推奨ガイドライン、およびターゲット蛋白質および調査されている特定の PTM ごとに一意であることがあります。
- Ub アフィニティ ビーズ、pY アフィニティ ビーズ、相撲 2/3 アフィニティ ビーズ、Ac アフィニティ ビーズにビードが完全にチューブで再停止されることを確認する数回を含む試薬ストック チューブを反転します。
- 各 IP 試金のため、氷上 (IP チューブ) 別 1.5 mL 遠心チューブに分注ビーズ懸濁液。ここでは、氷の上の個々 の 1.5 mL 遠心チューブにユビキチン アフィニティ ビーズの 20 μ L、ホスホチロシン アフィニティ ビーズの 30 μ L、sumo 化 2/3 アフィニティ ビーズ 40 μ L またはアセチル化アフィニティ ビーズの 50 μ L を追加します。
注: 各アフィニティ ビーズに使用するビーズ懸濁液の推奨されるボリュームの表 4を参照してください。 - ユビキチン化 IP コントロール ビーズと IgG コントロール ビーズにビードが完全にチューブで再停止されることを確認する数回を含む試薬ストック チューブを反転します。
- 非固有のバインド (コントロール IP チューブ) を決定するコントロール反応あたり因数管理ビーズ。ここでは、氷の上の個々 の 1.5 mL 遠心チューブに Ub コントロール ビーズの 20 μ L、pY コントロール ビーズの 30 μ L、相撲 2/3 コントロール ビーズ 40 μ L または Ac コントロール ビーズの 50 μ L を追加します。
注: は、アフィニティ ビーズの種類ごとに使用するビーズ懸濁液の推奨されるボリュームの表 4を参照してください。 - 少量溶解液 (20 μ L) 西部のしみのライセート制御入力を実行するを保存します。5 x サンプルバッファーの 5 μ L を追加し、95 ° C、5 分で沸騰します。
注: バッファー組成材料の表を参照してください。 - 各 IP 管と制御 IP チューブに lysate を追加します。ここでは、8 IP 反応の合計で、ip アドレスとコントロールの反応あたりライセートの 1 mg が使用されました。
注: 開始点としてには、アッセイごとライセートの 1.0 mg の使用をお勧めします。ライセート必要となります量変更されたターゲット蛋白質の豊富さによって異なります。 - 2 h の 4 ° C でエンド オーバー エンド回転プラットフォーム上管を孵化させなさい。ここでは、ATR チューブ腱板は速度 22 で使用されました。
- 4 ° C で 1 分の 3,000-5,000 × g で遠心分離してビーズを収集します。
- ビーズを乱すことがなく、できるだけ多くの上澄みを離れて吸い出しなさい。
- 1 mL blastR 回転台 4 ° C で 5 分間洗浄バッファー (この段階では、阻害剤を必要ありません) でビーズを洗浄します。
- 4 ° C で 1 分の 3,000-5,000 × g で遠心分離してビーズを収集します。
- ビーズを乱すことがなく、できるだけ多くの上澄みを離れて吸い出しなさい。
- 洗浄の手順 (手順 3.10 3.12) 2 回以上。
- 最終的な洗浄後バッファー上清を完全に削除します。ビーズ ペレットの最小限は (最大 5% の損失です)。罰金を使用して削除残留清は、蛋白質チップの読み込みを退屈させます。
- ビーズ溶出バッファーの 30 μ L を追加し、軽くタップ/フリック管の側でビードを再停止しなさい。この段階では、ピペットを使用しないでください。
注: バッファー組成材料の表を参照してください。 - 5 分間室温でインキュベートします。
- 軽く各ビーズ懸濁液を 1.5 mL 遠心チューブに配置されている 1.5 mL 容マイクロ スピン列に転送します。
注: 穏やかな転送の転送ピペット チップの端を切り取ることをお勧めします。 - IP サンプルを収集するために部屋の温度で 1 分間 9,000-10,000 × g で遠心分離機します。
- 各サンプルに 2-メルカプトエタノールの 2 μ L を加え、よく混ぜます。
注: 回転カラムのふたをスナップし、さらに処理するためのコレクション チューブをキャップにこれを使用すると便利です。 - 室温 1 分 10,000 × g で遠心分離によって 5 分収集サンプルの 95 ° C の水浴中サンプルを配置します。
- 必要に応じて、-70 ° C で試料を保存ここに停止や SDS-PAGE、転送、および西部のしみの分析 (セクション 4) 実行に進みます。
4 西部のしみの分析: 興味の蛋白質の同定
- ナトリウム ドデシルによって別のサンプルは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を硫酸し、標準的な実験室のプロトコル32によるとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転送。
- 一次抗体を使用すると、興味の蛋白質のファーストクリーニング改変されたバージョンを検出できます。ここでは、PD L1 抗体はファーストクリーニング変更された PD L1 を検出する使用されました。
- 検出用超高感度化学発光検出試薬を使用します。
注: 化学発光試薬は一次抗体を検出できる HRP 標識二次抗体と組み合わせて使用する必要があります。 - 化学発光試薬ミニ gel サイズ転送膜 (約 8 × 7 cm) あたり 2 mL の量を使用します。
- 適切な二次抗体の孵化後 (RT で 60 分お勧め)、tween 20 (TBST) とトリス緩衝生理食塩水 30 mL で 6 x 10 分しみを洗います。
注: バッファー組成材料の表を参照してください。 - 直前に使用、化学発光試薬 B (1 つ 8 × 7 cm 膜の十分な) 1 mL と化学発光試薬 A の 1 mL を混ぜます。
- 膜化学発光試薬を追加し、x 線フィルムまたは電荷結合素子 (CCD) カメラ画像を用いた蛋白質信号の可視化の前に 1-5 分の RT で穏やかな揺動と孵化します。
注: 化学発光試薬のインキュベーション時間の短縮は非常に豊富なタンパク質必要かもしれません。
- 適切な二次抗体の孵化後 (RT で 60 分お勧め)、tween 20 (TBST) とトリス緩衝生理食塩水 30 mL で 6 x 10 分しみを洗います。
Representative Results
これら 4 Ptm を効果的に検出することにより PTM クロストークを調査するこれらのツールの機能は部分的ユニークな換散バッファー システムによって異なります。効果的にその他の変性バッファーと同様にすべての細胞コンパートメントからタンパク質分離 blastR 変性バッファーを完全な蛋白質プロファイル (図 2 a) を保証すると。さらに、相撲 2/3 radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) (図 2 b) のような非変性バッファーの減少は急速のような非常に不安定な PTM 信号を保持します。重要なは、適切に希釈されたとき、その他の変性バッファー (例えば、塩化物イオンとバッファー) のような親和性試薬の整合性は影響しません。
変性バッファーを操作するときの重要なハードルは、ゲノム DNA の汚染を効果的に削除する機能です。粘度を下げるために従来の方法論は、sonicating サンプルや注射針を使用して DNA をせん断することです。図 3 aは、ゲノム DNA 汚染 A431 細胞ライセート治療後 BlastR フィルター、注射針、または超音波処理です。そうではない BlastR フィルターを使用して DNA のほぼ完全な除去がある従来の注射針または超音波を使用して。ゲノム DNA の汚染は SDS アクリルアミドゲルによる蛋白質の移行に大きな影響を及ぼします。ただし、BlastR フィルターによる治療は適切な蛋白質の移行 (図 3 b) の結果、ゲノムの DNA を削除します。ゲノム DNA の汚染によって引き起こされる変化の移行、西部のしみの解釈に大きく影響します。たとえば、フィルター処理されませんでまみれて EGFR パターン ライセート正確として解釈されるかもしれないないフィルターのサンプル (図 3) を基準にして発現の増加。
この最適化された PTM 濃縮・検出システムを活用することにより急速に決定できるかどうかターゲット蛋白質は 1 つによって変更または PD L1 PTM プロファイルのより多くの Ptm。 調査はこの技術を使用して最近行ったし、PD L1 があったことがわかったアセチル化、ユビキチンと EGF (図 4) への応答でリン酸化チロシン。重要なは、これらのデータは、内因性 PD L1 PTM の変更があり、合計の PD L1 識別の小さな割合を表した報告。
図 1: BlastR フィルターによる細胞ライセートからゲノム DNA をフィルタ リングします。(A) BlastR イメージ フィルター。(B) Lysate は、15 mL のコレクションの管に置かれたフィルターに読み込まれます。(C)プランジャーは注射器に配置され、ライセートが圧縮によってフィルターを通して渡されます。(D)収集ライセート、完全な圧縮を介して任意の気泡を含みます。(E)フィルター ライセート。
図 2: 代替の換散バッファー BlastR 換散バッファーの比較。図 2 a堀田らから適応2017。の研究。担当者。31(A) A431 細胞 BlastR、リッパ、mPER、IP 溶解溶解し (1 %sds) を変化させると塩化物イオンと換散バッファー。すべての変性 lysates BlastR フィルターを使用して削除されたゲノム DNA を持っていた。それぞれのコンパートメント マーカー蛋白に対する抗体を用いた膜、細胞質、ミトコンドリア、核マーカーからの蛋白質の分離を求めた。A431 細胞 BlastR、RIPA、1 %sds 変性バッファーと溶解し(B) 。Lysates は相撲 2/3 またはコントロール igg 抗体アフィニティ ビーズ沈澱しました。サンプルは、SDS-PAGE によって分離され、相撲 2/3-西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 抗体を用いたウエスタンブロット分析します。代表の独立実験のとおり N≥3 からしみ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BlastR 換散フィルターはゲノム DNA の除去に効果的です。(A) A431 細胞変性の換散バッファーに溶解し。ゲノム DNA は、削除、または BlastR フィルターや注射針、5、10、20、または 30 秒間超音波処理に変形します。ライセートの 2% は、エチジウム ブロマイド、agarose のゲルの電気泳動によって分析されました。(B) Lysate A431 細胞から分離変性バッファーとは、フィルターまたは BlastR フィルターとフィルターします。サンプルは SDS-PAGE と分離され、Coomassie 染色を用いて可視化します。(C) B から重複したサンプル PVDF に転送 SDS-PAGE によって分離し、EGFR 抗体を用いた EGFR タンパク質を調べた。N 3 の独立した実験から代表的なしみが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: PD L1 の EGF 誘導ポスト翻訳の修正の検出。堀田らから適応図2017。腫瘍30(A)。A431 細胞の血清制限いずれかの些細 (UT) または EGF 刺激 BlastR 換散バッファーに溶解する前に 1 時間。WCL は PD L1 レベル (レーン 1, 2) の分析だった。ユビキチン結合ビーズ (UBA01) は、IP および蛋白質 (レーン 3, 4) に使用されました。ホスホチロシン結合ビーズ (APY03) は、IP チロシン リン酸化タンパク質 (レーン 5, 6) に使用されました。相撲 2/3 結合ビーズ (ASM24) は、IP SUMOylated 2/3 タンパク質 (7, 8 レーン) に使用されました。アセチル リジン結合ビーズ (AAC01) を用いてタンパク質アセチル化 IP (レーン 9, 10)。バインド コントロール ビーズを igG IP 非特異的結合タンパク質 (11,12 車線) に使用されました。サンプルは、SDS-PAGE によって分離され、PD L1 抗体を用いたウエスタンブロット分析します。N 3 の独立した実験から代表的なしみが表示されます。白のアスタリスクは、PD L1 pY と Ac のタンパク バンドを強調する使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| BlastR 換散バッファーの計算 | ||||
| 1.0 mL | 2.0 mL | 5.0 mL | 10.0 mL | |
| BlastR 換散バッファー | 965 Μ L | 1930 Μ L | 4.825 mL | 9.650 mL |
| チロシン脱燐酸化酵素阻害剤 | 5 Μ L | 10 Μ L | 25 Μ L | 50 Μ L |
| デ-ubiquitinase/デ-sumoylase 阻害剤 | 10 Μ L | 20 Μ L | 50 Μ L | 100 Μ L |
| HDAC 阻害剤 | 10 Μ L | 20 Μ L | 50 Μ L | 100 Μ L |
| プロテアーゼ抑制剤のカクテル | 10 Μ L | 20 Μ L | 50 Μ L | 100 Μ L |
| BlastR 希釈バッファーの計算 | ||||
| 4.0 mL | 8.0 mL | 20.0 mL | 40.0 mL | |
| BlastR 換散バッファー | 3.86 mL | 7.72 mL | 19.3 mL | 38.6 mL |
| チロシン脱燐酸化酵素阻害剤 | 20 Μ L | 40 Μ L | 100 Μ L | 200 Μ L |
| デ-ubiquitinase/デ-sumoylase 阻害剤 | 40 Μ L | 80 Μ L | 200 Μ L | 400 Μ L |
| HDAC 阻害剤 | 40 Μ L | 80 Μ L | 200 Μ L | 400 Μ L |
| プロテアーゼ抑制剤のカクテル | 40 Μ L | 80 Μ L | 200 Μ L | 400 Μ L |
表 1:溶解と希釈バッファー準備グラフ。グラフの指定溶解と希釈バッファーのボリュームを準備するときは、セル換散のためバッファーを追加する阻害剤の濃度を提供します。
| プレートたんぱく | 推奨される BlastR 換散バッファーのボリューム | 推奨 BlastR 希釈バッファー量 |
| < 1 mg | 複数の板からの蛋白質を結合します。 | 1.5 mL の最終的なボリュームに |
| 1-2 mg | 300 Μ L | 1.5 mL の最終的なボリュームに |
| 2-4 mg | 600 Μ L | 3 mL の最終的なボリュームに |
| 4-6 mg | 900 Μ L | 4.5 mL 最終巻に |
表 2:BlastR 溶解/希釈バッファー グラフ。ライセートを取得するとき、溶解と希釈バッファー ボリューム グラフを提供することお勧めします。
| 細胞ライセート精度赤蛋白質の試金の試薬 (μ L) 1 ml に添加量 | 外径600を読んでサンプルを使用するための乗数 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
テーブル 3:Mg/mL に分光光度計の測定値を変換するための乗数ライセート。グラフは、補佐官に蛋白質の集中を計算するとコンバージョン数を提供します。
| アフィニティ ビーズ | ビーズ スラリー/IP (mL) のボリューム |
| ユビキチン化 | 20 |
| ホスホチロシン | 30 |
| Sumo 化 2/3 | 40 |
| アセチル化 | 50 |
| コントロール ビーズ | ビーズ スラリー/IP (mL) のボリューム |
| ユビキチン化コントロール ビーズ | 20 |
| Phosphotyrsoine コントロール ビーズ | 30 |
| Sumo 化 2/3 コントロール ビーズ | 40 |
| アセチル化コントロール ビーズ | 50 |
表 4:ビーズ/IP グラフのボリュームをお勧めします。グラフを提供する IP 反応ごとに使用するアフィニ ティー ビーズの量をお勧めします。
Discussion
初期アプローチのかどうか、PTM がターゲット蛋白質を変更を決定するために使用は、ip、PTM 抗体ウエスタンブロット続いてターゲット蛋白質特定の抗体を使用して実行できます (e.g、抗アセチル リジン)、または ip は、PTM の抗体を使用して。ターゲット蛋白質特定の抗体30,31,33と西部のしみが続きます。両方のアプローチは理論的には動作、ターゲット蛋白特異抗体を用いた抗体を IP 対応できない場合がありますまたは大きな PTM 変更はターゲット蛋白質34 の抗体認識部位をブロック可能性がありますなどのより多くの潜在的な落とし穴があり ,35。PTM アフィニティ ビーズの利点は抗体または結合ドメインが特に関心の PTM を認識したがって、ターゲット蛋白質への変更は、アフィニティ ビーズによって認識を変更しないでください。例として、PD L1 Ub は、ここで説明する手法で識別され、両方内因性モノラル- とポリ-Ub が観察された (図 4)。Limらによる最近の出版物。PD L1 Ub を調査するための in vitro Ub 技術を活用し、結果図 436に示す結果に非常に類似していた。興味深いことに、彼らはまた、Ub が過剰に発現して、MG 132 は、信号を向上させる追加された細胞ライセートから PD L1 を豊かにする PD L1 抗体を IP を行います。Ub パターンは堅牢なと体外Ub パターンから非常に明瞭ではなかった。Limら細胞培養モデルにおける内因性 PD L1 Ub の調査は実行されませんでした。レポートのセルの文化と体外のデータの違いを明らかにします。
性低豊富に過渡的な性質37,38, 挑戦することができ、IP による濃縮はしばしば必要とタンパク質が、PTM によって変更されたかどうかを調査します。Ptm の効果的な IP には、いくつかの重要な手順と換散バッファーなどの親和性試薬の試薬の最適化が必要です。ターゲット蛋白質の複数の Ptm を調査して、必要な最適化の可能性が増加します。このプロトコルの重要なステップは単一のシステムで pY、相撲 2/3、Ub、Ac Ptm の PTM の検出を可能にしながら、堅牢な IP 機能を維持は blastR 溶解システムを利用します。この手法は、時間と、特定のターゲット蛋白質は、これら 4 つの Ptm によって変更および PTM 結果複数の溶解システムを用いての比較基準にして PTM クロストークのより良い画像を提供する可能性を判別に必要なリソースを最適化します。糖鎖のような代替の Ptm blastR 溶解システムの互換性の調査を行った。しかし、それは検査されなかった余すところなく Ptm のすべてのタイプの。
豊富なゲノム DNA が蛋白質測定のいずれかを使用に干渉できる比色 nanodrop メソッド、SDS のアクリルアミドゲルの蛋白質の移行に影響を与えるおよび IP アッセイ中タンパク質との親和性のマトリックス相互作用を防止または。ここで説明する方法は、このプロトコルの別の重要なステップは、ゲノムの DNA 汚染を効果的に削除する特殊なフィルターを利用しています。この点を強調する粘度試験を行った blastR フィルター治療前後と結果を示した (データは示されていない) の水の粘度高粘度から削減。この粘度の変化は、図 3のほぼすべてのゲノム DNA が削除されていたの結果によって支えられました。重要なは、DNA をせん断してこの方法で任意傾斜された DNA はフィルター (データは示されていない) によってキャプチャされないようにないです。このツールは、特殊な機器は必要ありませんが、再現性の高い、それをせん断の代わりに DNA を削除しますので超音波や注射器せん断 DNA のような従来の方法よりも優れてです。さらに、従来の29を使用して発生することができますライセート、タンパク質は低下しません。フィルターを利用した DNA の効果的な内訳 (すなわち、せん断注射器) は数分をかかることがあり、ライセート DNA 汚染物質が残っていると、試料の不均質のための代替方法に比較サンプルあたり 5-30 秒かかります。ライセートの事前・事後 blastR フィルタ リングの広範な解析を行ったとターゲット固有西部、または合計とターゲット固有の PTM 解析; Coomassie によりタンパク質プロファイルで観察可能な差は認められなかったしたがって、タンパク質プロファイルの整合性がない影響されているゲノム DNA をフィルタ リングによって。最終的には、このフィルター システムは西部か IP アプリケーション ゲノム DNA が存在し、タンパク質解析の解釈に影響を与える可能性がありますのため有益です。
アフィニティ ビーズ彩度、結合サイトの干渉、PTM マスキングする部分でありますこの手法を利用した偽否定的な検出の可能性があることに注意してくださいすることが重要です。たとえば、特定のターゲット蛋白質の非常に低レベルの Ac によって変更されます。したがって、それはないより豊富な Ac 変更ターゲット蛋白質によって飽和されてパン アセチル リジン アフィニティ ビーズによって分離する場合があります。進行中の研究は、このプロトコルで利用される親和性試薬の検出限界を評価するために実行されているが、最近の出版物は、非常に堅牢な検出限界を示唆しています。この手法が識別できるセル31あたり 17 のアセチル化の標的タンパク質分子として数をデータに示した。まだ、セルなどの特定の状況を入力特異性、特定の刺激への応答の一時的な Ptm や Ptm のタンパク質間相互作用のためのマスキングは、偽否定的な結果のすべての結果を可能性があります。これらは、ほとんどの PTM IP メソッドと同様に、この技術の潜在的な落とし穴です。したがって、複数のアプローチを使用して結果を確認することをお勧めします。
類似アミノ酸39,40, と他の Ptm のユビキチン化とリン酸化蛋白質を規制する順番に動作するように示されているような競合する糖とリン酸化のような変更が示されています。17,41を機能します。神経病理学的タンパク タウの最近の仕事は、PTM のクロストーク、リン酸化タウ ハイパー - とタウ sumo 化がお互い42を強化の重要性を強調しました。また、このグループは、タウの sumo 化防止ポリ Ub と後続のタウ劣化集約につながる可能性を示した。これは規制の PTM クロストークの多くの例の 1 つ、Ptm と健康と病気の主要なタンパク質を調節する、クロストークの重要性を照らすこの手法の有用性が役立ちます。
Disclosures
H.H. とアダムローリーは、骨格 (株) キロの従業員は骨格株式会社の創設者です。
Acknowledgments
彼らの重要なレビュー、編集、および原稿の有意義な議論の骨格株式会社研究者、博士ブライアン ・ フーバー、アシュリー デイビスをありがとうございます。さらに、博士ロバート ・紅は、ビデオ原稿の生産の間に彼の貢献を感謝いたします。この作品は、骨格 (株) からの資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. Quantifying ubiquitin signaling. Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
