Undersökt flera, kan endogena post-translationella modifieringar för ett målprotein vara mycket utmanande. Tekniker som beskrivs här utnyttja en optimerad lysis buffert och filter system utvecklats med specifika PTM-targeting, affinitet matriser att upptäcka de acetylering, ubikvitinering, SUMOylation 2/3 och tyrosin fosforylering ändringarna för ett mål protein med en enda, strömlinjeformad system.
Det är nu väl uppskattat att post-translationella modifieringar (PTMs) spelar en viktig roll i regleringen av en Proteinets struktur och funktion, som kan vara väsentliga för en given proteinets roll både fysiologiskt och sjukligt. Anrikning av PTMs är ofta nödvändigt när du undersöker ett målprotein PTM status, eftersom PTMs är ofta övergående och relativt låg i överflöd. Många fallgropar påträffas när berikande för en PTM av ett målprotein, såsom buffert oförenlighet, mål protein antikroppen är inte IP-kompatibla, PTM signalförlust, m.fl. Svårighetsgraden förstoras när du undersöker flera PTMs som acetylering, ubikvitinering, SUMOylation 2/3 och tyrosin fosforylering för ett visst målprotein. Studera en kombination av dessa PTMs kan vara nödvändigt, som överhörning mellan PTMs är utbrett och kritisk till protein förordning. Ofta, studeras dessa PTMs i olika lysis buffertar och med unika hämmare kompositioner. För att förenkla processen, ett unikt denatureringen lysis system utvecklades som effektivt isolerar och bevarar dessa fyra PTMs; Således gör det möjligt för utredning av potentiella överhörning i en enda Lys-systemet. Ett unikt filtersystem var konstruerad för att ta bort kontaminerande genomiskt DNA från den lysate, som är en problematisk biprodukt denaturera buffertar. Robust affinitet matriser inriktning var och en av de fyra PTMs har utvecklats i konsert med buffert för att maximera anrikning och detektion av endogena påstår av dessa fyra PTMs. Denna omfattande PTM upptäckt verktygsuppsättning effektiviserar processen för att erhålla kritisk information om huruvida ett protein ändras genom en eller flera av dessa PTMs.
Post-translationella modifieringar (PTMs) är starkt reglerade ändringar av ett protein, varvid ändringen läggs till eller tas bort på ett särskilt sätt. PTMs är ofta dynamiska, övergående förändringar som avsevärt förändrar Proteinets struktur, interaktioner med partner proteiner, rumsliga lokalisering och slutligen aktivera proteinet att utföra olika funktioner1,2 , 3 , 4. PTMs är så rikligt att de ökar antalet unika protein former (eller proteoforms) från omkring 30.000 genprodukter till över en miljon proteoforms5,6. Att identifiera PTMs och definiera deras effekt på ett målprotein är kritisk mot att förstå proteinets funktioner fysiologiska och patologiska7,8,9,10, 11,12,13,14. Arbeta på Välj proteiner som tubulin, p53 och epidermal tillväxtfaktor (EGFR) har klarlagts rollerna reglerande PTMs15,16,17. Dessa studier avslöjat att regleringen av dessa proteiner sker genom flera PTMs, och i många fall dessa ändringar arbetar i samförstånd för att främja en specifik funktion. Nya studier har visat att både kooperativa och negativa PTM överhörning kan uppstå på flera olika proteiner18,19,20,21,22, 23,24,25. PTM profiler av majoriteten av proteiner byggs dock från flera studier som har använt olika modeller och unika förutsättningar. Med ett optimerat system att undersöka flera PTMs i ett system skulle vara mycket fördelaktigt att få insikt i potentiella PTM överhörning för ett målprotein.
En utmaning med att utreda PTMs i ett enda system är att specifika PTMs utreds med distinkta lysis buffertar. Till exempel kan utnyttjandet av buffertar som RIPA eller NP-40 som vanligen används för fosforylering eller ubikvitinering utredningar vara otillräcklig för att studera en labila PTM som små ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) ylation26. Dessutom icke-denatureringen buffertar är otillräckliga för att separera proteininteraktioner, och kan leda till falskt positiva PTM identifiering27. Undersöka PTMs i en denatureringen lysisbuffert kan vara att föredra, eftersom det är betydligt bättre isolera proteiner från alla cellulära fack28, kommer att separera de flesta proteininteraktioner, och kommer att hämma proteaser som förändrar PTM stater, såsom deSUMOylases 26. men kan denatureringen buffertar äventyra integriteten i specifika affinitet reagens såsom ubiquitin bindande domän-baserade verktyg27. Utveckla ett denatureringen-liknande lysis system för att studera flera PTMs av ett protein i en affinitet reagens-kompatibla system skulle vara mycket fördelaktigt för PTM överhörning utredningar.
Även om denatureringen buffertar har viktiga fördelar jämfört med icke-denatureringen buffertar för att undersöka PTMs, de används mindre ofta på grund av sin betydande nackdelar, såsom oförenlighet med konventionell protein-analyser, betydande genomisk deoxiribonukleinsyra (DNA) kontaminering, och störningar till immunoprecipitation (IP) reagens29. Dessa nackdelar kan resultera i längre förberedelsetid och potentiella skador till målprotein när klippning genomiskt DNA. Två vanliga metoder för att klippa DNA inkluderar spruta lysis och ultraljudsbehandling29. Båda metoderna kräver omfattande optimering och ofta saknar exakta reproducerbarhet. Alternativa metoder för att ta bort genomiskt DNA inkluderar tillägg av DNAses; Detta kan dock kräva ytterligare optimering och förändringar i buffert sammansättning. En enkel och reproducerbar metod att avlägsna genomisk DNA nedsmutsning skulle i slutändan vara fördelaktigt när du arbetar med denatureringen lysis buffertar för PTM utredningar.
Målet med denna teknik är att utveckla ett system för att isolera och undersöka ubikvitinering (Ub), tyrosin fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) och acetylering (Ac) PTMs i ett enda system för att bättre undersöka PTM överhörning för ett målprotein. Detta system för upptäckt av PTM utnyttjades för att snabbt undersöka flera målproteiner endogena PTM profil i ett enda system. Ny insikt i eventuella överhörning var identifierade30,31. Övergripande, den teknik som beskrivs här förbättrar befintliga metoder för att undersöka PTMs och PTM överhörning på tre olika sätt: 1) en unik denatureringen buffert utvecklades som isolerar proteiner från alla cellulära fack, medan det fortfarande är kompatibel med PTM affinitet reagenser, 2) ett unikt filtersystem utvecklades som snabbt avlägsnar genomisk DNA kontaminering från denaturerat lysates med hög reproducerbarhet och kräver ingen specialutrustning och 3) den robusta affinitet pärlor, Lys-systemet, och hämmande Reagenserna är kompatibla. Således, förenkla isolering av dessa fyra PTMs för ett målprotein maximera PTM anrikning och effektivt undersöka potentiella överhörning.
Ursprungliga metoder används för att bestämma om ett målprotein ändras genom en PTM kan utföras med mål protein specifika antikroppen för IP, följt av western blot med en PTM-antikropp (t.ex., anti acetyl lysin), eller genom att använda en PTM antikropp för IP, följt av western blot med de mål protein specifika antikropp30,31,33. Båda metoderna fungerar teoretiskt, har utnyttja en mål-protein-specifika antikropp fler potentiella fallgropar, som antikroppen kan inte IP kompatibel, eller stora PTM ändringar kan blockera webbplatsen antikropp erkännande på målproteinet34 ,35. Fördelen med PTM affinitet pärlorna är att antikroppen eller bindande domänerna specifikt känna igen PTM av intresse. ändringar i målproteinet bör således inte ändra erkännande av affinitet pärlorna. PD-L1 Ub identifierades med den teknik som beskrivs här som ett exempel, och båda endogena mono – och poly-Ub observerades (figur 4). En ny publikation av Lim et al. utnyttjas i vitro Ub tekniker för att undersöka PD-L1 Ub, och resultatet var mycket likt de resultat som visas i figur 436. Intressant, utförde de också IP med en PD-L1-antikropp att berika PD-L1 från cell lysate, där Ub var i ökad utsträckning och MG-132 lades till förbättra signalen. Ub mönstret var inte robust och mycket distinkt från in vitro- Ub mönstret. Utredning av endogena PD-L1 Ub i cell kultur modeller utfördes inte i Lim et al. rapport att klargöra skillnaden mellan deras kultur och in vitro- data i cellen.
Utreda huruvida ett protein ändras genom en PTM kan vara en utmaning på grund av dess låga överflöd och övergående natur37,38, och kräver ofta berikning via IP. Effektiva IP av PTMs kräver optimering av flera viktiga steg och reagens, såsom lysis buffertar och affinitet reagenser. När du undersöker flera PTMs av ett målprotein, ökar krävs optimering sannolikt. Utnyttja blastR lysis systemet är ett viktigt steg i detta protokoll, eftersom det upprätthåller robusta IP-kapacitet, medan aktivera PTM identifiering av pY, SUMO 2/3, Ub och Ac PTMs i ett enda system. Denna teknik optimerar tid och resurser som krävs för att avgöra om ett visst målprotein ändras genom dessa fyra PTMs, och potentiellt ger en bättre bild av PTM överhörning i förhållande till jämföra PTM resultat utförs med flera lysis system. Utredning av blastR lysis systemets kompatibilitet med alternativa PTMs, som glycosylation, utfördes; men har det inte undersökts uttömmande för alla typer av PTMs.
Rikliga genomiskt DNA kan störa protein mätningar med antingen kolorimetrisk eller nanodrop metoder, påverkar migrationen av proteiner i en SDS akrylamid gel och förhindra protein och affinitet matrix interaktion under IP-analyser. Metoden beskrivs här utnyttjar ett specialiserade filter för att effektivt ta bort genomisk DNA-kontaminering, som är ett annat viktigt steg i detta protokoll. För att belysa denna punkt, viskositet tester utfördes före och efter blastR filter behandling och resultaten visade en minskning från en hög viskositet att viskositeten av vatten (inga data anges). Denna förändring i viskositet stöddes av resultaten i figur 3visar nästan alla genomisk DNA hade tagits bort. Allt är DNA inte klippt med denna metod, som någon klippt DNA inte kommer att fångas av filtret (inga data anges). Detta verktyg är överlägsen konventionella metoder, som ultraljudsbehandling eller spruta-DNA-klippning, eftersom det kräver ingen specialutrustning, är mycket reproducerbara och tar bort DNA i stället för klippning det. Dessutom kommer det inte försämra protein i den lysate, vilket kan ske med konventionella metoder29. Använda filtret tar 5-30 sekunder per prov jämfört med alternativa metoder där effektiv uppdelning av DNA kan ta flera minuter (dvssprutan klippning) och kan resultera i provet heterogenitet som DNA föroreningar kvar i den lysate. Omfattande analys av lysat före och efter blastR filtrering utfördes, och ingen observerbara skillnad i protein profil observerades av Coomassie, target-specifika västra, eller totalt och target-specifika PTM analyser; Således, integriteten av den protein-profilen kan inte ha påverkats genom att filtrera bort genomisk DNA. Ytterst, detta filtersystem är fördelaktigt för alla western eller IP-program där genomiskt DNA är närvarande och kan påverka tolkningen av den protein-analysen.
Det är viktigt att notera att det finns risk för falskt negativa upptäckt utnyttja denna teknik, vilket kan bero delvis på affinitet pärla mättnad, bindande webbplats störningar eller PTM maskering. Exempelvis kan ett visst målprotein ändras av Ac på mycket låga nivåer. Det kan således inte isoleras av pan-acetyl lysin affinitet pärlor som har mättats av rikligare Ac-modifierade målproteiner. Pågående studier utförs för att bedöma detektionsgränserna för affinitet reagenserna utnyttjas i detta protokoll, men en ny publikation antyder en mycket robust detektionsgränsen. Data visade att denna teknik kunde identifiera så få som 17 acetylerade mål proteinmolekyler per cell31. Fortfarande, särskilda omständigheter såsom cell skriver specificitet, övergående PTMs svar på specifika stimuli, eller maskering av PTMs på grund av protein interaktion kan alla resultera i falska negativa resultat. Detta är potentiella fallgropar av denna teknik, liksom de flesta PTM IP metoder. Således, det rekommenderas att bekräfta resultat med hjälp av flera metoder.
Ändringar som glycosylation och fosforylering har visat att konkurrera om liknande aminosyror39,40, och andra PTMs som ubikvitinering och fosforylering har visat att arbeta sekventiellt för att reglera en proteinets funktion17,41. Senaste arbete på neuropatologiska proteinet Tau betonade vikten av PTM överhörning, där hyper Tau-fosforylering och Tau SUMOylation förstärkt varandra42. Dessutom, denna grupp visade att SUMOylation av Tau hindrade poly-Ub och efterföljande Tau nedbrytning, möjligen leder till aggregering. Detta är bara ett av många exempel på föreskrivande PTM överhörning och nyttan av denna teknik kommer att hjälpa för att belysa vikten av PTMs och deras överhörning i regleringen av viktiga proteiner i hälsa och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar cytoskelettet Inc. forskare och Drs. Brian Hoover och Ashley Davis för deras kritisk granskning, redigering och givande diskussioner på manuskriptet. Dessutom, tackar vi Dr. Robert Hom för hans bidrag under produktionen video manuskriptet. Detta arbete stöds av finansiering från cytoskelettet Inc.
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
cell scrapers | Costar | 3008 | |
BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
PTM Immunoprecipitation | |||
Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
Cell growth and treatment | |||
Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |