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Developmental Biology

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

Complexité des systèmes de in vivo , il est difficile de distinguer entre l’activation et inhibition du récepteur Notch par trans- et cis-ligands, respectivement. Nous présentons ici un protocole basé sur in vitro tests cellulaires-agrégation pour évaluation qualitative et semi quantitative de la liaison de l’encoche de la drosophile à trans-ligands vs cis-ligands.

Abstract

La signalisation Notch est un système de communication de cellules évolutivement conservés utilisé largement en développement animal et entretien adulte. Interaction des récepteurs Notch avec des ligands de cellules voisines induit l’activation de la voie de signalisation (trans-activation), tandis que l’interaction avec les ligands de la même cellule inhibe la signalisation (cis-inhibition). Juste équilibre entre trans-activation et cis-inhibition permet d’établir des niveaux optimaux de la signalisation Notch dans certains contextes au cours du développement animal. En raison des domaines d’expression qui se chevauchent de Notch et ses ligands dans plusieurs types de cellules et de l’existence de mécanismes de rétroaction, étudier les effets d’une modification post-traductionnelle donnée sur trans- et cis-interaction de la protéine Notch et ses ligands in vivo est difficile. Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation de cellules S2 Drosophila lors d’essais de la cellule-agrégation d’évaluer les effets de faire tomber un modificateur de parcours de Notch sur la liaison de la protéine Notch à chaque ligand dans trans et cis. Cellules S2 stablement ou transitoirement transfectées avec un vecteur exprimant l’encoche sont mélangés avec les cellules exprimant chaque ligand de Notch (S2-Delta ou S2-Serrate). TRANS-liaison entre les récepteurs et ligands se traduit par la formation d’agrégats cellulaires hétérotypiques et est mesurée en termes de nombre d’agrégats par mL composé de > 6 cellules. D’examiner l’effet inhibiteur du cis-ligands, S2 cellules exprimant conjointement Notch et chaque ligand sont mélangées avec des cellules S2-Delta ou S2-Serrate et le nombre d’agrégats est quantifié comme décrit ci-dessus. La diminution relative du nombre d’agrégats en raison de la présence de cis-ligands fournit une mesure de cis-ligand-médiée par l’inhibition de la trans-liaison. Ces tests simples peuvent fournir des données semi-quantitatives sur les effets des manipulations génétiques ou pharmacologiques sur la liaison de la protéine Notch à ses ligands et peuvent aider à déchiffrer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des ces manipulations sur la signalisation Notch.

Introduction

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La signalisation Notch canonique est un mécanisme de communication de cellule à cellule à courte portée qui nécessite un contact physique des cellules pour faciliter l’interaction entre les récepteurs Notch et leurs ligands1voisines. Interaction des récepteurs Notch (présent sur la surface des cellules de récepteur de signal) avec des ligands (présentes à la surface de l’envoi de signal cellules) initie la signalisation Notch et est connu comme trans-activation2. En revanche, l’interaction entre l’encoche et ses ligands dans la même cellule entraîne l’inhibition de la voie Notch et est connue comme cis-inhibition3. L’équilibre entre trans- et cis-interactions est nécessaire pour assurer optimale ligand-dépendants encoche4de signalisation. Drosophile a un récepteur de Notch et deux ligands (Delta et Serrate) par opposition à des mammifères, qui ont quatre récepteurs Notch et cinq ligands [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 et DLL4]5. Cette simplicité, le modèle drosophile offre la facilité pour disséquer/étude des effets de modificateurs de la voie sur les interactions ligand-Notch et par la suite sur la signalisation Notch. Dans certains contextes au cours du développement animal (notamment le développement de l’aile chez la drosophile), les cis- et trans-interactions interviennent pour réaliser la signalisation Notch appropriée et cellule sort1,6 . Il est important de distinguer les effets des modificateurs de parcours de Notch dans ces contextes sur cis- et trans-interaction de la protéine Notch avec ses ligands.

Notre groupe a déjà rapporté qu’addition d’un résidu d’hydrate de carbone appelé xylose Drosophila Notch à négativement régule la signalisation Notch dans certains contextes, y compris le développement aile7. Perte de shams (l’enzyme qui xylosylates Notch) mène à un phénotype de « perte de la veine de l’aile »7. Plus récemment, des expériences de dosage génique et analyse clonale servaient à montrer que perte de shams améliore l’encoche Delta-mediated singulariser. De distinguer si la signalisation d’encoche renforcée chez les mutants shams est le résultat d’une diminution de cis-inhibition ou accru trans-activation, études de surexpression ectopique de ligands Notch dans les disques imaginaux de larves aile l’utilisation du pilote de la dpp-GAL4 ont été effectuées. Ces expériences fourni de preuve suggérant que Shams régule trans-activation de la protéine Notch par Delta sans affecter l’encoche cis-inhibition par des ligands8. Cependant, informations en retour règlement et effets de ligands endogènes pourraient compliquer l’interprétation des études de surexpression ectopique1,6,9.

Pour résoudre ce problème, Drosophila S2 cellules10 ont été utilisées, qui prévoit un système simple en vitro Notch-ligand interaction études11,12. Cellules S2 ne pas exprimer endogène récepteurs Notch et Delta ligand11 et exprimer un faible niveau de Serrate13, qui n’affecte pas l’encoche-ligand agrégation expériences8. Donc, S2 cellules peuvent être stablement ou transitoirement transfectées par encoche et/ou différents ligands (Delta ou Serrate) pour générer des cellules qui expriment exclusivement les récepteurs Notch ou l’un de ses ligands ou une combinaison d'entre eux. Mélange de cellules exprimant l’encoche S2 avec exprimant le ligand S2 cellules entraîne la formation d’agrégats hétérotypiques médiée par le récepteur-ligand liaison11,12,14. Quantification de la formation globale fournit une mesure de trans-liaison entre l’encoche et ses ligands15 (Figure 1). De même, les cellules S2 peuvent être co transfectées avec des ligands Notch et Delta ou Serrate (c.-à-d. cis-ligands). CIS-ligands dans ces cellules exprimant l’encoche S2 abroger la liaison de la protéine Notch avec trans-ligands et résultat dans a diminué de formation total8,12,14. La diminution relative de la formation globale provoquée par cis-ligands fournit une mesure de l’effet inhibiteur du cis-ligands sur la liaison entre l’encoche et trans-ligands (Figure 2). En conséquence, les essais sur l’agrégation des cellules ont été utilisés pour examiner l’effet de la perte de xylosylation sur trans- et cis-interactions entre l’encoche et ses ligands.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour essais sur l’agrégation des cellules dans le but d’évaluer la liaison de la protéine Notch avec trans-ligands et son inhibition par cis-ligands à l’aide de cellules S2 de drosophile . À titre d’exemple, nous fournissons les données qui nous ont permis de déterminer l’effet d’entaille xylosylation sur la liaison entre l’encoche et trans-Delta8. Ces tests simples fournissent une évaluation semi-quantitative de l’encoche-ligand interactions in vitro et aident à déterminer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des modificateurs de parcours de Notch.

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Protocol

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1. préparation d’ARN Double brin (dsRNA) pour Shams Knockdown

  1. Amplification par PCR des produits
    1. Utiliser l’ADN génomique sauvage jaune blanc (o y) et pAc5.1-EGFP comme gabarit, les paires d’amorces suivant pour amplifier les fragments d’ADN utilisés dans la synthèse de l’ARNdb. Utiliser le profil thermique de PCR suivant : dénaturation (95 ° C, 30 s), recuit (58 ° C, 30 s) et Extension (72 ° C, 1 min).
      Amélioré la protéine fluorescente verte Amorces de dsRNA (EGFP) (5' - 3')-
      Avant apprêt-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Inverser l’apprêt-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Amorces de dsRNA Shams (5' - 3')-
      Avant apprêt-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Inverser l’apprêt-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      NOTE : EGFP dsRNA est utilisée comme contrôle négatif.
  2. Gel-purifier les produits de réaction en chaîne (PCR) polymérase en utilisant un kit de purification de gel commercial selon le protocole du fabricant.
  3. Effectuer la transcription d’in vitro à l’aide d’un produit commercial capable de la retranscription d’un instigateur T7 selon le protocole du fabricant.
  4. Purifier l’ARNdb en utilisant un kit de purification d’ARN selon le protocole du fabricant et conserver à-80 ° C.
  5. Évaluer l’efficacité de knockdown shams en utilisant les étapes suivantes (1.5.1-1.5.5).
    1. Compter les cellules manuellement en utilisant un hémocytomètre et plaque 5 x 105 S2 des cellules dans chaque puits d’un 6 bien plaque dans 1 mL/puits de milieu de Schneider complétée avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
    2. Ajouter 7,5 µg d' EGFP- ou shams ARNdb dans chaque puits et incuber à 25 ° C pendant 24 h.
    3. Récolte du contrôle (EGFP imprégnées de dsRNA) et couvre-oreillers dsRNA S2 les cellules traitées par pipetage douce suivie d’enrobage vers le bas par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à 25 ° C et le processus d’isolement à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN conformément à Protocole du fabricant.
    4. Quantifier l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et processus 100 ng d’ARN pour 1 étape qRT-PCR à l’aide de réactifs commerciaux qPCR et apprêt/sondes et le profil thermique de PCR suivant : dénaturation (95 ° C, 15 s) et recuit/Extension (60 ° C, 1 min).
      Remarque : Consultez la Table des matières pour plus d’informations sur les ensembles d’apprêt/sonde et l’instrument utilisé pour des expériences de qRT-PCR shams et de contrôle dans ces études.
    5. Calculer les niveaux d’ARNm relative shams en utilisant les 2ΔΔCT méthode16.

2. évaluation de la liaison entre le récepteur Notch et Trans-ligands

  1. Préparer le récepteur de signal (cellules S2 exprimant le récepteur de l’encoche).
    1. Compter les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre et plaque 5 x 105 S2 et cellules S2-encoche stables dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 1 mL/puits de milieu de Schneider additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
      Remarque : Pour les cellules S2-Notch, qui sont disponibles de Drosophila génomique Resource Center (DGRC), ajouter 200 méthotrexate nM dans les médias. Pour préparer une solution mère de méthotrexate de 0,5 mM, d’abord préparer une solution de méthotrexate 20 mM pour 250 µL de 1 NaOH M. Ensuite, diluer cette solution à 0,5 mM à 1 M saline de tampon phosphate et conserver à-20 ° C. Dans les cellules S2-Notch, expression de la protéine Notch est sous le contrôle du promoteur dans le vecteur de pMT métallothionéine drosophile .
    2. Ajouter 7,5 µg d’ARNdb dans chaque puits et incuber à 25 ° C pendant 24 h.
    3. Ajouter 0,7 mM CuSO4 pour induire l’expression de la protéine Notch et incuber à 25 ° C pendant 3 jours.
      NOTE : CuSO4 est utilisé pour induire l’expression des protéines contrôlée par le promoteur de la métallothionéine.
  2. Préparer un envoi de signal de cellules (cellule de S2 exprimant des ligands Delta ou Serrate).
    1. Compter les cellules manuellement en utilisant un hémocytomètre et plaque ~ 5 x 106 S2-Delta ou S2-SerrateTom cellules stables dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 1 mL/puits de milieu de Schneider additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
      NOTE : Ajouter 200 méthotrexate nM pour cellules S2-Delta et 100 µg/mL hygromycine pour cellules S2-SerrateTom dans les médias. Expression de Delta et SerrateTom— une version fonctionnelle de Serrate12tomates-tag — relève de la drosophile métallothionéine promoteur dans le vecteur de la pMT .
    2. Ajouter 0,7 mM CuSO4 pour induire l’expression de ligands et incuber à 25 ° C pendant 3 h.
  3. Effectuer l’agrégation entre cellules-envoi de signal et le récepteur de signal.
    1. Récolter le S2 dsRNA-traités (contrôle) et les cellules S2-encoche de pipetage doux et plaque 2,5 x 105 cellules/puits dans une plaque 24 puits après comptage manuel par hémocytomètre.
    2. Ajouter 5 x 105 stable S2-Delta ou S2-SerrateTom cellules dans un volume total de 200 µL de milieu de Schneider (additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine).
      Remarque : Toutes les cellules de S2 de manutention (y compris traitement de placage, induction et dsRNA) a été fait sous une armoire de sécurité biologique.
    3. Placer la plaque dans un agitateur orbital à 150 tr/min (942,48 rad/min).
    4. Après 1 min, mélanger le contenu de chaque puits et retirer 20 µL pour compter le nombre d’agrégats.
      1. En même temps prendre une image représentative sous microscope inversé de composé à l’aide de grossissement de 10 x (objectif de 10/0.25 PLL).
      2. Compter manuellement les agrégats (> 6 cellules) à l’aide d’un hémocytomètre.
    5. Placer la plaque sur un agitateur.
    6. Répétez l’acquisition d’images et de comptage après 5 min et 15 min d’agrégation.
  4. Effectuer la quantification des trans-liaison.
    1. Calculer le nombre d’agrégats / mL entre cellules S2 et S2-Delta ou S2-SerrateTom comme un contrôle de fond.
    2. Calculer le nombre d’agrégats / mL entre l’entaille en S2 et S2-Delta ou S2-SerrateTom cellules (magnitude de trans-liaison).

3.Évaluation de l’Inhibition de la liaison entre l’encoche et Trans-ligands par Cis-ligands

  1. Préparer les cellules de récepteur de signal.
    1. Cellules de5 S2 plaque 5 x 10 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 1 mL/puits de milieu de Schneider additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
    2. Ajouter 7,5 µg d’ARNdb dans chaque puits et incuber à 25 ° C pendant 24 h.
    3. Transfecter conjointement les cellules dsRNA-Traité avec pBluescript et pMT-Notch11 (DGRC) seul ou avec l’Entaille en pMT et pMT-Delta11 (DGRC) ou pMT-Serrate17 au total Concentration d’ADN de 2 µg/puits à l’aide d’un réactif de transfection commerciale selon le protocole du fabricant.
      Remarque : pBluescript est utilisé comme un contrôle. Les cellules transfectées Co s’appellera S2-encoche & Deltatransitoire ou S2-encoche & Serrate cellulestransitoires ci-après.
    4. Incuber les cellules transfectées de manière transitoire de S2 à 25 ° C pendant 24 h.
    5. Ajouter 0,7 mM CuSO4 pour induire l’expression de l’encoche et les ligands et incuber à 25 ° C pendant 3 jours.
  2. Préparer l’envoi de signal de cellules tel que décrit au point 2.2.
  3. Effectuer l’agrégation entre l’envoi de signal et le récepteur de signal de cellules tel que décrit à la section 2.3.
  4. Quantifier l’inhibition de la trans-liant en cis-ligands.
    1. Calculer le nombre d’agrégats / mL entre cellules S2 et S2-Delta ou S2-Serrate comme un contrôle de fond.
    2. Quantifier l’importance de l’inhibition par la CEI-ligands comme suit.
      1. Décrivez A comme nombre d’agrégats entre les cellules de Delta-S2 et S2-encochetransitoire .
      2. Définir B comme nombre d’agrégats entre les cellules S2 transfectées transitoirement conjointement avec encoche et Delta (S2-encoche & Deltatransitoire) et cellules S2-Delta.
      3. Calculer l’agrégation relative C = (B -x 100) /A
      4. Calculer l’ampleur de l’inhibition par cis- ligand (Delta ou Serrate) 100 – C.
        Remarque : ainsi, si l’agrégation relative est 45 %, cis-sont considérés comme des ligands inhibent la trans-contraignant de 55 %.

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Representative Results

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Nos observations in vivo suggèrent que manque les résultats de shams de gène de xylosyltransferase gain de Notch signalisation due à surcroît Delta-mediated trans-activation de la protéine Notch sans affecter la cis-inhibition de la Encoche de ligands8. Pour tester cette notion, en vitro cell agrégation analyses ont été effectuées. Tout d’abord, shams expression dans les cellules S2 a été renversée à l’aide de dsRNA shams . DsRNA EGFP a été utilisé comme témoin. Efficacité de précipitation (KD) a été examinée par PCR en temps réel et s’est avérée supérieur à 80 %8. Ensuite, la liaison du récepteur Notch avec trans-Delta sur shams KD a été étudiée à l’aide de tests d’agrégation. L’agrégation entre cellules entaille en S2 et S2-Delta a été examinée à divers moments après les mélangeant. L’agrégation entre plaines cellules S2 et S2-Delta a été prise en tant que contrôle de fond. La figure 3 montre le graphique indiquant le nombre d’agrégats formé à différentes fois points (1, 5, 15 et 30 min) après le mélange. Une forte augmentation a été observée dans le nombre d’agrégats entre 1 et 5 min. par la suite, le nombre d’agrégats a continué d’augmenter jusqu’en 30 min à un rythme plus lent. Par conséquent, la formation globale a été photographiée à 1, 5 et 15 min et le nombre d’agrégats a été quantifié après 5 min de mélange.

Figure 4 a montre des images représentatives de cellule tests d’agrégation entre cellules stables d’entaille en S2 et S2-Delta pour évaluer les effets de shams KD sur la liaison entre le récepteur Notch et trans-Delta. Les images montrent l’agrégation à trois reprises des points (1, 5 et 15 min). Pour un contrôle de fond, plaines cellules S2 (traitées avec shams dsRNA) ont été mélangés avec cellules S2-Delta. EGFP dsRNA-traités S2-encoche cellules forment des agrégats de cellules S2-Delta, qui augmentent en nombre avec le temps. En revanche, shams dsRNA-traités S2-encoche cellules forment des agrégats plus rapidement, et les agrégats sont plus gros et plus grand nombre que les témoins (Figure 4 b). Ceci indique que Shams niveaux décroissants améliore la trans-liaison de la protéine Notch avec Delta8.

D’examiner si Shams régule l’effet inhibiteur du cis-ligands sur la liaison entre l’encoche et trans-Delta, nous avons tout d’abord établi que la co-expression de Notch et Delta dans le récepteur de signal cellulaire peut diminuer l’agrégation cellulaire médiée par l’encoche et trans-Delta. Figure 5 a montre le graphique indiquant le nombre d’agrégats formés entre Delta-S2 et S2-encoche & cellulestransitoires Delta avec différentes quantités de cis-Delta. Transfectants égales de constructions de Notch - et Delta-expression en cellules S2 dramatiquement diminue le nombre d’agrégats formés entre ces cellules et les cellules S2-Delta. En outre, diminuant la quantité de cis-Delta se traduit par une augmentation du nombre d’agrégats, indiquant que, selon la gamme de Notch /cis-ratios de Delta utilisés dans ces essais, cis-Delta peut inhiber la liaison entre l’encoche et TRANS-Delta de manière dose-dépendante. Depuis l’entaille en S2 & cellulestransitoires Delta expriment fois Notch et Delta, ils pourraient former homotypique agrégats indépendamment les cellules S2-Delta. D’examiner si la formation de homotypique regroupe parmi S2-encoche & Delta cellulestransitoires peuvent être un facteur de confusion dans le cis-tests d’inhibition illustrés à la Figure 5 a, nous avons mélangé ces cellules avec des cellules S2 et quantifié les agrégats. Figure 5 b indique le nombre d’agrégats formés après le mélange des cellules S2 S2-encoche & cellulestransitoires Delta exprimant diverses Notch /cis-ratios de Delta. Un petit nombre de homotypique agrégats par rapport aux agrégats hétérotypiques comme illustré à la Figure 5 a a été observé. Nous concluons que ces tests d’agrégation mesurent fidèlement l’effet du cis-Delta sur la liaison entre l’encoche et trans-Delta.

Nous avons ensuite examiné l’effet de shams KD la capacité inhibitrice du cis-Delta. À cette fin, l’agrégation entre Delta-S2 et S2-encoche & cellulestransitoires de Delta a été examinée. Figure 6 a montre des images représentatives d’agrégation entre cellules Delta-S2 et S2-encochetransitoire (contrôle) ou S2-encoche & cellulestransitoires de Delta. S2-Delta et EGFP dsRNA-traités S2-encochetransitoire des cellules forment des agrégats, qui augmentent en nombre avec le temps, semblable à l’agrégation entre S2-Delta et cellules S2-encoche stables (Figure 4). Notamment, mixage Delta-S2 et S2-encoche & Deltatransitoire cellules transfectées conjointement avec une quantité égale de plasmides de Notch - et Delta-expression forment moins d’agrégats à la fois EGFP KD et shams KD, ce qui suggère que la diminution le niveau de Shams n’affecte pas la capacité de cis-Delta pour bloquer l’encoche /trans-liaison de Delta. Afin de mieux évaluer les effets de shams KD sur l’activité du cis-Delta, l’ampleur de l’inhibition par le cis-Delta a été mesurée en calculant le pourcentage relatif de l’agrégation sur une gamme de rainure /cis-Delta ratios comme expliqué à la Section 3.4.2. Quantification d’agrégation relative a montré une inhibition comparable d’agrégation sur un traitement dsRNA EGFP et couvre-oreillers (Figure 6 b). Ensemble, ces observations suggèrent fortement que la perte de xylosylation favorise trans-liaison sans affecter les cis-inhibition8et fournissent un mécanisme moléculaire du phénotype de perte de veine aile observé à shams des mutants.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique des cellules agrégation Assay for Trans-liaison. Schéma montrant induction des récepteurs (S2-Notch) et ligand (S2-Delta ou S2-Serrate) cellules S2 exprimant par 0,7 mM CuSO4. Induction de deux cellules S2 est suivie en mélangeant, qui tend à rendre les agrégats. Ces agrégats (> 6 cellules) sont imagés et quantifiés.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique du dosage agrégation cellulaire afin d’évaluer les Cis-inhibition. S2 cellules ont été transfectées de manière transitoire avec Entaille en pMT (S2-Ntransitoire), pMT-Notch et pMT-Delta (S2-encoche & Deltatransitoire), ou pMT-Notch et pMT-Serrate (S2-cran & Serratetransitoire). Après l’induction de 0,7 mM CuSO4 et mélange avec cellules S2-Delta, agrégats (> 6 cellules) sont quantifiés. L’inhibition par le cis-ligands est mesurée en termes de pourcentage relatif d’agrégation en présence et en absence de chaque cis-ligand. Les effets de la cis-ligands sur la liaison entre l’encoche et trans-Serrate peut être déterminé en mélangeant les cellules transfectées de manière transitoire avec cellules S2-SerrateTom (non illustrés). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : agrégation entre l’entaille en S2 et S2 ou cellules S2-Delta à différents Points dans le temps. Graphique indique le nombre d’agrégats / mL à des moments différents (1, 5, 15 et 30 min) entre les types indiqués des cellules. Barres d’erreur indiquent erreur-type de la moyenne (SEM) des trois répétitions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Cellule agrégation médiée par Notch et trans-Delta. (A) Images montrent l’agrégation à des moments différents (1, 5 et 15 min). L’agrégation entre shams dsRNA-Traité de plaines cellules S2 et S2-Delta a été prise dans le contrôle arrière-plan. Shams- dsRNA Traité S2-encoche cellules montrent une augmentation du nombre et taille des agrégats contre EGFP dsRNA (témoin) cellules S2-Notch après mélange avec cellules S2-Delta. Echelle = 100 µm. Quantification (B) du nombre de cellules regroupe plue de 6 cellules après 5 min d’agrégation. Barres d’erreur indiquent SEM. * P < 0,01 (unidirectionnel analyse de Variance (ANOVA)). Trois répétitions avec trois répétitions indépendantes ont été réalisées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Cis-Delta inhibe l’agrégation Formation à médiation cellulaire par Notch et trans-Delta de manière dose-dépendante. (A) graphique présente l’agrégation (en termes de nombre d’agrégats/mL) entre les cellules Delta-S2 et S2 les cellules transfectées de manière transitoire avec différentes proportions de vecteurs d’expression pour l’encoche et CEI-Delta (1:0, 1:1, 1 : 0. 5, 1:0.2 et 1 : 0. 1). Barres d’erreur indiquent SEM. * P < 0,01 (ANOVA unidirectionnel). Trois répétitions avec trois répétitions indépendantes ont été réalisées. Notez que diminue le niveau de cis-Delta se traduit par une augmentation de l’agrégation, probablement en raison de la réduction cis-inhibition. (B) graphique montrant l’agrégation homotypiques (en termes de nombre d’agrégats par mL) dans les cellules de S2 transitoirement transfectées avec différentes proportions de Notch et Delta (1:0, 1:1, 1 : 0. 5, 1:0.2 et 1 : 0. 1) et mélangé à simples cellules S2. Barres d’erreur indiquent SEM. nombre d’agrégats est beaucoup plus petit que le nombre d’agrégats hétérotypiques formés entre Delta-S2 et S2-encoche & cellulestransitoires de Delta. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Knockdown de shams n’affecte pas l’activité inhibitrice du cis-Delta. Illustré (A) sont des images représentatives de l’effet de shams KD sur cis-Delta-médiée par l’inhibition de l’agrégation cellulaire médiée par Notch /trans-liaison de Delta. Les images montrent l’agrégation à des moments différents (1, 5 et 15 min). L’agrégation entre shams dsRNA-Traité de plaines cellules S2 et S2-Delta a été prise dans le contrôle arrière-plan. Semblable à stablement transfectées cellules S2-Notch, shams KD a augmenté le nombre d’agrégats entre Delta-S2 et S2-Notch les cellulestransitoire par rapport au contrôle (EGFP imprégnées de dsRNA). La co-expression de cis-Delta avec encoche dans un rapport 1:1 a entraîné une diminution comparable du nombre d’agrégats en contrôle (EGFP imprégnées de dsRNA) ainsi comme cellules de dsRNA Traité shams . Echelle = 100 µm. (B) graphique présente l’agrégation relative entre les cellules Delta-S2 et S2 les cellules transfectées de manière transitoire conjointement avec des ratios indiqués (1:0, 1:1, 1 : 0. 5, 1:0.2 et 1 : 0. 1) du cran et de la CEI-Delta. Traitement de dsRNA EGFP et shams montrent une diminution comparable agrégation à chaque encoche /cis-ratio de Delta. Les données présentées ici sont représentatives de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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La signalisation Notch canonique dépend des interactions entre le récepteur de Notch et ses ligands5. Bien que la plupart des études sur la voie de l’encoche considèrent surtout la fixation de ligands dans les cellules voisines (trans) et Notch, entaille et même cellule ligands interagissent-elles et ces soi-disant cis-interactions peuvent jouer un rôle inhibiteur dans l’encoche signalisation de3,4. En conséquence, pour décrypter les mécanismes qui sous-tendent les effets d’un modificateur sur signalisation notch canonique, il est souvent pertinent pour examiner les deux types d’interactions ligand-Notch ( cisettrans ). Toutefois, dans de nombreux contextes au cours du développement animal, implication des deux de ces interactions et leur règlement de rétroaction complique l’in vivo études1,6. Dans le présent protocole, nous fournissons une méthodologie détaillée pour in vitro analyses agrégation de cellules à l’aide de cellules S2 de drosophile pour évaluer la liaison du récepteur Notch avec trans- ligands et son inhibition par cis- ligands. Nous avons présenté l’utilisation de cette méthodologie pour évaluer l’effet d’un modificateur génétique de la protéine Notch (le xylosyltransferase Shams7,8) de signalisation sur la liaison récepteur-ligand.

Tout d’abord, agrégation analyses ont été effectuées entre stable S2-Delta et EGFP ou shams dsRNA stable S2-encoche cellules traitées pour examiner l’effet de shams KD sur trans-liaison. Agrégation des cellules S2-Delta avec shams dsRNA plaine S2 les cellules traitées a été prise dans le contrôle arrière-plan. Shams KD a facilité l’agrégation entre S2-cran et cellules S2-Delta par rapport au témoin. Il est important d’effectuer des agrégations de contrôle expérimental de fond entre plaine S2 cellules et transport de ligand S2 en parallèle à la trans-expériences de liaison. Bien que la drosophile S2 cellules n’expriment pas de récepteur de Notch endogène et Delta ligand11, expression de faibles niveaux de Serrate est rapportée en S2 cellules13. Considérant cela, plaine S2 cellules ont été utilisés dans les analyses de l’agrégation des cellules comme contrôle de fond ; ces cellules ne montrent aucune agrégation (Figure 5 b). Agrégats sont comptés manuellement à l’aide d’un hémocytomètre. Pour assurer l’uniformité dans la quantification globale, 10-20 µL de population cellulaire mixte peut être reversé sur depuis au moins trois différents domaines / puits pour le comptage. Ces tests requièrent des cellules saines à S2 croissants. Compte tenu de la nature semi adhérente de S2 cellules, douce pipetage alors qu’elles ramassaient les cellules et constante agitation pendant le test d’agrégation est important.

Auparavant, nous et autres avons utilisé des essais de liaison ligand-récepteur bien établie, soluble pour une évaluation quantitative de la liaison récepteur-ligand dans trans17,18,19, 20. épreuves d’agrégation étant semiquantitative, essais de liaison de ligand soluble ont également été effectuées pour examiner l’effet de shams KD sur cran-ligand trans-liaison. Les résultats observés ressemblaient à tendance avec ceux obtenus par agrégation des essais8. Ceci atteste l’évaluation fidèle de liaison de la protéine Notch avec trans-ligands à l’aide d’essais sur l’agrégation des cellules. Bien que la formation globale est une lecture de liaison récepteur-ligand, il peut être compliqué si l’expression en surface de ses ligands ou le récepteur de Notch est affectée par les modificateurs donnés. Cela met en évidence la limitation des essais sur l’agrégation des cellules, comme on ne peut pas distinguer si le changement dans la formation globale est en raison de la liaison récepteur-ligand altérée ou altération de l’expression de surface. Parallèlement aux épreuves de l’agrégation, les effets de chaque modificateur sur expression superficielle de ligands et encoche doit donc être testé dans les cellules de S2. Dans le cadre de nos études, niveaux surfaces de Notch et Delta ne sont pas affectées dans shams dsRNA-traités S2 cellules8.

D’examiner l’inhibition de la trans-liaison par addition de cis-ligands, agrégation des essais ont été effectués entre cellules S2-Delta et EGFP ou shams dsRNA-traités S2-encoche & cellulestransitoires Delta . Le nombre d’agrégats formés entre ces cellules a été comparé avec celui des agrégats formés entre cellules Delta-S2 et S2-encochetransitoire . La diminution relative du nombre d’agrégats a été calculée et utilisée comme indicateur de l’ampleur de l’inhibition par la CEI-Delta. Les expériences de contrôle ont montré que cis-ligands montrent une inhibition robuste et dose-dépendante de la protéine Notch /trans-liaison Delta sur une gamme assez large de Notch à cis-ratios de ligand (1:1 à 1 : 0. 1) (Figure 5 a),8 . Un ratio 1:1 a entraîné le plus fort degré de cis-inhibition et en diminuant le niveau relatif de cis-Delta affaibli cis-inhibition. En conséquence, les expériences de KD sur cette plage de rapports a été réalisée. À noter la quantité de récepteurs Notch et la quantité totale d’ADN transfectée sont maintenus constants dans toutes les expériences. Cela fera en sorte que la formation globale est principalement affectée par l’activité du cis-ligands et inchangée par niveaux d’expression de Notch par les cellules.

Il a été démontré précédemment que la co-expression de Notch et cis-ligands dans les cellules de S2 peuvent entraîner la formation de homotypique agrégations14. D’examiner si semblables homotypique agrégations parmi S2-encoche & Deltatransitoire ou S2-encoche & Serratetransitoire de cellules peuvent compromettre nos interprétations de l’agrégats quantifications dans CEI-études de ligand, un dosage d’agrégation de contrôle a été effectué entre S2-encoche & Deltatransitoire et plaines cellules S2. Le nombre de cellules S2 utilisé dans ces expériences était identique à cellules S2-Delta utilisées en cis-expériences de Delta. Certains homotypique agrégation a été observée, mais quantification a montré que les agrégats résultantes contribuent à une faible fraction des agrégats totales comparé avec les agrégats hétérotypiques entre S2-encoche & Deltatransitoire et S2-Delta cellules () Figure 5 b).Nous concluons que les changements observés dans le nombre d’agrégats en cis-ligand assays sont principalement en raison de l’effet inhibiteur du cis-ligands sur la liaison entre l’encoche et trans-Delta.

En résumé, les dosages d’agrégation présentées dans le présent protocole fournissent une méthode simple et directe pour évaluation semi-quantitative de la trans- et cis-interactions entre le récepteur de Notch et ses ligands. Ces tests peuvent servir à examiner les effets des modificateurs de voie Notch génétiques ou pharmacologiques sur l’encoche-ligand binding in vitro et donc peuvent aider à élucider les mécanismes qui sous-tendent les effets in vivo de ces modificateurs au cran de signalisation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent l’appui de la NIH/NIGM (R01GM084135 à HJN) et la Fondation Mizutani pour Glycoscience (subvention #110071 à HJN) et sont reconnaissant envers Tom V. Lee pour discussions et suggestions sur les dosages et Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine et la drosophile génomique Resource Center (DGRC) de plasmides et de lignées cellulaires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

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References

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Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la <em>drosophile</em> avec <em>Trans</em>-Ligands et son Inhibition par <em>Cis</em>-Ligands
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Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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