Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Celle aggregering analyser evaluere bindingen Drosophila hakket med Trans-ligander og dens hemming av Cis-ligander

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

Kompleksiteten i vivo systemer gjør det vanskelig å skille mellom aktivering og hemming hakk reseptoren av trans- og cis-ligander, henholdsvis. Her presenterer vi en protokoll basert på i vitro celle-aggregering analyser for kvalitativ og kvantitativ semi evaluering av binding av Drosophila hakk til trans-ligander vs cis-ligander.

Abstract

Hakk signalnettverk er et evolusjonært bevarte celle-celle kommunikasjonssystem brukes bredt i animalske utvikling og voksen vedlikehold. Samspillet av hakk reseptoren med ligander fra nabokommunene cellene induserer aktivering av signalveien (trans-aktivisering), mens interaksjon med ligander fra samme celle hemmer signalering (cis-hemming). Riktig balanse mellom trans-aktivering og cis-hemming bidrar til å etablere optimale nivåer av hakk signalering i noen sammenhenger under utviklingen av dyr. På grunn av overlappende uttrykk domenene hakk og dens ligander i mange celletyper og eksistensen av tilbakemelding mekanismer, studerer effekten av en gitt post-translasjonell modifikasjon på trans- versus cis-interaksjoner av hakk og sin ligander i vivo er vanskelig. Her beskriver vi en protokoll for bruk Drosophila S2 celler i celle-aggregering analyser for å vurdere effekten av banket ned et hakk veien modifikator på binding av hakk for hver ligand trans og cis. S2 celler stabilt eller transiently transfekterte med et hakk-uttrykke vektor er blandet med celler som uttrykker hvert hakk ligand (S2-Delta eller S2-Serrate). Trans-bindingen mellom reseptor og ligander resulterer i dannelsen av heterotypic celle aggregater og måles i antall aggregater per mL består av > 6 celler. Undersøke den hemmende effekten av cis-ligander, S2 celler uttrykke co hakk og hver ligand er blandet med S2-Delta eller S2-Serrate og antall aggregater er kvantifisert som beskrevet ovenfor. Relative reduksjonen i antall aggregater av cis-ligander gir et mål på cis-ligand-mediert hemming av trans-binding. Disse enkle analyser kan gi semi kvantitative data om virkningene av genetiske eller farmakologiske manipulasjoner på bindingen av hakk til sin ligander, og kan bidra til å tyde de molekylære mekanismene underliggende i vivo virkningene av slike manipulasjoner i hakk signalering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanoniske hakk signalnettverk er en kort rekkevidde celle til celle kommunikasjon mekanisme som krever fysisk kontakt i nabolandet celler for å gjøre interaksjon mellom hakk reseptorer og deres ligander1. Samspillet av hakk reseptor (finnes på overflaten av signal-mottak celler) med ligander (på overflaten av signal-sende celler) starter hakk signalering og er kjent som trans-aktivisering2. På den annen side, samspillet mellom hakk og dens ligander i samme celle fører til hemming av hakk veien og er kjent som cis-hemming3. Balansen mellom trans- og cis-interaksjoner er nødvendig for å sikre optimal ligand-avhengige hakk signalering4. Drosophila har ett hakk reseptoren og to ligander (Delta og Serrate) i motsetning til pattedyr, som har fire hakk reseptorer og fem ligander [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-lignende 1 (DLL1), DLL3 og DLL4]5. Har dette enkelhet, gir Drosophila modellen enkel å dissekere/studie effekten av veien modifikatorer hakk-ligand interaksjoner og senere på hakk signalering. I enkelte sammenhenger under dyr utvikling (inkludert fløyen utvikling i Drosophila), både cis- og trans-interaksjoner er involvert for å oppnå riktig hakk signalering og celle skjebne1,6 . Det er viktig å skille effekten av hakk veien modifikatorer i disse sammenhenger på cis- versus trans-interaksjoner av hakk med sin ligander.

Vår gruppe tidligere rapportert at tillegg av et karbohydrat rester kalt xylose til Drosophila hakk negativt regulerer hakk signalering i visse sammenhenger, inkludert fløyen utvikling7. Tap av shams (enzymet som xylosylates hakk) fører til en "tap av vingen venen" fenotypen7. Nylig ble genet dosering eksperimenter og klonal analyse brukt til å vise at tap av shams forbedrer Delta-mediert hakk singling. Å skille om den forbedrede hakk signalering i shams mutanter er et resultat av redusert cis-hemming eller økt trans-aktivisering, ektopisk overuttrykte studier av hakk ligander i larver fløyen imaginal plater med dpp-GAL4 driveren ble utført. Disse eksperimentene gitt bevis antyder at Shams regulerer trans-aktivering av hakk ved å Delta uten å påvirke hakk cis-hemming av ligander8. Imidlertid, mate-rygg forskrifter og virkningene av endogene ligander kan komplisere tolkningen av ektopisk overuttrykte studier1,6,9.

Du løser dette problemet, Drosophila S2 celler10 ble brukt, som gir en enkel i vitro system for hakk-ligand samhandling studier11,12. S2 celler ikke uttrykke endogene hakk reseptor og Delta ligand11 og uttrykke lave Serrate13, hvilke ikke påvirker hakk-ligand aggregering eksperimenter8. Derfor kan S2 celler være stabilt eller transiently transfected hakk og/eller personlige ligander (Delta eller Serrate) for å generere celler som uttrykker utelukkende hakk reseptoren eller en av dens ligander eller en kombinasjon. Blanding av hakket-uttrykke S2 celler med ligand-uttrykke S2 celler resultater i dannelsen av heterotypic aggregater formidlet av reseptor-ligand binding11,12,14. Kvantifisering av samlet formasjonen gir et mål på trans-binding mellom hakk og dens ligander15 (figur 1). Tilsvarende S2 celler kan co transfekterte med hakk og Delta eller Serrate ligander (i.e. cis-ligander). CIS-ligander i disse hakk-uttrykke S2 cellene oppheve binding av hakk med trans-ligander og resultere i redusert samlede formasjon8,12,14. Relativ nedgangen i samlet dannelse forårsaket av cis-ligander gir et mål på den hemmende effekten av cis-ligander bindingen mellom hakk og trans-ligander (figur 2). Følgelig celle aggregering analyser ble brukt for å undersøke effekten av tap av xylosylation på trans- og cis-interaksjoner mellom hakk og dens ligander.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for cellen aggregering analyser rettet å evaluere binding av hakk med trans-ligander og dens hemming av cis-ligander bruke Drosophila S2 celler. Som et eksempel, tilbyr vi data som tillot oss å fastslå effekten av hakk xylosylation bindingen mellom hakk og trans-deltaet8. Disse enkle analyser gir en semi kvantitativ vurdering av hakk-ligand interaksjoner i vitro og avgjøre molekylære mekanismer underliggende i vivo effekten av hakk veien modifikatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. utarbeidelse av dobbel strandet RNA (dsRNA) for Shams Knockdown

  1. PCR forsterkning av produkter
    1. Bruk vill-type gul hvit (y w) genomisk DNA og pAc5.1-EGFP som mal og følgende primer parene til å forsterke DNA fragmenter i dsRNA syntese. Bruk følgende PCR termisk profil: rødsprit (95 ° C, 30 s), Annealing (58 ° C, 30 s) og forlengelse (72 ° C, 1 min).
      Forbedret grønne fluorescerende Protein (EGFP) dsRNA primere (5 - 3')-
      Fremover primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Omvendt primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA primere (5 - 3')-
      Fremover primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Omvendt primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Merk: EGFP dsRNA brukes som negativ kontroll.
  2. Gel-rense polymerase kjedereaksjon (PCR) produkter med en kommersiell gel rensing kit i henhold til produsentens protokollen.
  3. Utføre i vitro transkripsjon bruker et kommersielt produkt kan transkribere fra en T7 selskapet etter produsentens protokollen.
  4. Rense dsRNA bruker en RNA rensing kit i henhold til produsentens protokollen og lagre på-80 ° C.
  5. Vurdere effektiviteten av shams knockdown ved hjelp av følgende (1.5.1-1.5.5).
    1. Teller cellene manuelt med et hemocytometer og plate 5 x 105 S2 celler i hver brønn en 6 vel plate 1 mL/vel av Schneider's medium supplert med 10% fosterets Bovine Serum (FBS) og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Legg 7,5 µg EGFP- eller shams dsRNA i hver brønn og ruge ved 25 ° C i 24 timer.
    3. Harvest kontrollen (EGFP dsRNA-behandlet) og shams dsRNA-behandlet S2 celler av mild pipettering etterfulgt av pelleting ned med sentrifugering på 1000 x g i 5 minutter ved 25 ° C og prosessen RNA isolering bruker en RNA utvinning kit i henhold til produsentens protokollen.
    4. Kvantifisere RNA med et spektrofotometer og prosessen 100 ng av for 1-trinns qRT PCR bruke kommersielle qPCR reagenser og primer/sonder og følgende PCR termisk profil: rødsprit (95 ° C, 15 s) og Annealing/Extension (60 ° C, 1 min).
      Merk: Se Tabell for materiale for informasjon om primer/sonde settene og instrumentet brukes for shams og kontroll qRT PCR eksperimenter i disse studiene.
    5. Beregne relative shams mRNA nivåer ved hjelp av 2-ΔΔCT metoden16.

2. vurdering av bindingen mellom hakk reseptor og Trans-ligander

  1. Forberede signal-mottak celler (S2 celler uttrykke hakk reseptoren).
    1. Telle celler manuelt ved hjelp av en hemocytometer og plate 5 x 105 S2 og stabil S2-hakk celler i hver brønn av en 6-vel plate i 1 mL/vel av Schneider's medium supplert med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Merk: For S2-hakk celler, som er tilgjengelig fra Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), kan du legge til 200 nM methotrexate i media. For å forberede en 0,5 mM methotrexate lagerløsning, først forberede en 20 mM methotrexate løsning i 250 µL av 1 M NaOH. Deretter fortynne denne løsningen til 0,5 mM 1 M fosfat buffer saltvann og butikk på 20 ° C. I S2-hakk celler er uttrykket av hakk protein under kontroll av Drosophila metallothionein selskapet i avdrag vektoren.
    2. Legg 7,5 µg av dsRNA i hver brønn og ruge ved 25 ° C i 24 timer.
    3. Legge til 0,7 mM CuSO4 induserer uttrykk for hakk og ruge ved 25 ° C i 3 dager.
      Merk: CuSO4 brukes til induserer uttrykk for proteiner kontrollert av metallothionein selskapet.
  2. Forbered sending av signal celler (S2 celler uttrykke Delta eller Serrate ligander).
    1. Telle celler manuelt ved hjelp av en hemocytometer og plate ~ 5 x 106 stabile S2-Delta eller S2-SerrateTom celler i hver brønn av en 6-vel plate i 1 mL/vel av Schneider's medium supplert med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Merk: Legg 200 nM methotrexate for S2-Delta celler og 100 µg/mL hygromycin for S2-SerrateTom celler i media. Uttrykk for Delta og SerrateTom-en tomat-merket, funksjonell versjon av Serrate12-under Drosophila metallothionein arrangøren i avdrag vektoren.
    2. Legge til 0,7 mM CuSO4 induserer uttrykk for ligander og ruge ved 25 ° C 3 h.
  3. Utføre aggregasjonen mellom cellene signal-sende og signal-mottak.
    1. Høste dsRNA-behandlet S2 (kontroll) og S2-hakk celler av mild pipettering og plate 2.5 x 105 celler/godt i en 24-vel plate etter manuell telling av hemocytometer.
    2. Legge til 5 x 105 stabil S2-Delta eller S2-SerrateTom celler i et totalt volum på 200 µL av Schneider's medium (supplert med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin).
      Merk: Alle S2 celler håndtering (inkludert plating, induksjon og dsRNA behandling) ble gjort under en biosafety kabinett.
    3. Plass platen på en orbital shaker på 150 rpm (942.48 rad/min).
    4. Etter 1 min, bland innholdet i hver brønn og ta 20 µL ut for å telle antall aggregat.
      1. Samtidig ta et representativt bilde under invertert satt mikroskop med 10 x forstørrelse (PLL 10/0,25 objektiv).
      2. Manuelt teller aggregatene (> 6 celler) ved hjelp av en hemocytometer.
    5. Plass platen på en shaker.
    6. Gjenta bilde oppkjøpet og telling etter 5 min og 15 min av aggregering.
  4. Utføre kvantifisering av trans-binding.
    1. Beregne antall aggregater per mL mellom S2 cellene og S2-Delta eller S2-SerrateTom som en bakgrunn.
    2. Beregne antall aggregater per mL mellom S2-hakk og S2-Delta eller S2-SerrateTom (omfanget av trans-binding).

3.Evaluering av hemming av Binding mellom hakk og Trans-ligander av Cis-ligander

  1. Forberede signal-mottak celler.
    1. Plate 5 x 105 S2 celler i hver brønn av en 6-vel plate i 1 mL/vel av Schneider's medium supplert med 10% FBS og 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Legg 7,5 µg av dsRNA i hver brønn og ruge ved 25 ° C i 24 timer.
    3. Co transfect dsRNA-behandlet cellene med pBluescript og Avdrag-hakk11 (DGRC) alene eller med Avdrag-hakk og Avdrag-deltaet11 (DGRC) eller Avdrag-Serrate17 totalt DNA konsentrasjon av 2 µg/godt med en kommersiell transfection reagens i henhold til produsentens protokollen.
      Merk: pBluescript er brukt som en kontroll. Co transfekterte cellene kalles S2-hakk & Deltaforbigående eller S2-hakk & Serrateforbigående celler heretter.
    4. Inkuber transiently transfekterte S2 cellene ved 25 ° C i 24 timer.
    5. Legge til 0,7 mM CuSO4 induserer uttrykk for hakk og ligander og ruge ved 25 ° C i 3 dager.
  2. Forbered sending av signal celler som beskrevet i 2.2.
  3. Utføre aggregasjonen mellom signal-sende og signal-mottak celler som beskrevet i Seksjon 2.3.
  4. Kvantifisere hemming av trans-binding av cis-ligander.
    1. Beregne antall aggregater per mL mellom S2 cellene og S2-Delta eller S2-Serrate som en bakgrunn.
    2. Kvantifisere omfanget av hemming av cis-ligander som følger.
      1. Definere A som antall aggregater mellom S2-hakkforbigående og S2-Delta celler.
      2. Definere B som antall aggregater mellom S2 celler transiently med transfekterte hakk og Delta (S2-hakk & Deltaforbigående) og S2-Delta celler.
      3. Beregne relative aggregering C = (B x 100) /A
      4. Beregne omfanget av hemming av cis- ligand (Delta eller Serrate) som 100- C.
        Merk: som et eksempel, hvis relative aggregering er 45%, så cis-ligander anses å hemme trans-binding med 55%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Våre i vivo observasjoner foreslo at tap av xylosyltransferase genet shams resulterer i vinning hakk signalnettverk skyldes økt Delta-mediert trans-aktivering av hakk uten å påvirke cis-hemming av Hakk av ligander8. For å teste dette begrepet, ble i vitro celle aggregering analyser utført. Først ble shams uttrykk i S2 celler slått ned med shams dsRNA. EGFP dsRNA ble brukt som kontroll. Effektiviteten av knockdown (KD) ble undersøkt av sanntids PCR og viste seg å være større enn 80%8. Deretter bindingen hakk reseptoren med trans-Delta på shams KD ble undersøkt ved hjelp av aggregering analyser. Aggregering mellom S2-hakk og S2-deltaet celler ble undersøkt på ulike tidspunkt etter blande dem. Aggregasjonen mellom vanlig S2 cellene og S2-Delta ble tatt som bakgrunn. Figur 3 viser grafen indikerer antall aggregater dannet på ulike tid poeng (1, 5, 15 og 30 min) etter blanding. En kraftig økning ble observert av aggregater mellom 1 og 5 min. etterpå antall aggregater fortsatte å øke til 30 min med en langsommere hastighet. Derfor samlet formasjon ble avbildet på 1, 5 og 15 min og antall aggregater ble kvantifisert etter 5 min blanding.

Figur 4A viser representant bilder av cellen aggregering analyser mellom stabil S2-hakk og S2-deltaet celler å vurdere effekten av shams KD på bindingen mellom hakk reseptor og trans-deltaet. Bildene viser samlingen på tre punkter (1, 5 og 15 min). Bakgrunn-kontroll ble vanlig S2 celler (behandlet med shams dsRNA) blandet med S2-Delta celler. EGFP dsRNA-behandlet S2-hakk celler dannet aggregat med S2-Delta celler som økning med tid. I kontrast, shams dsRNA-behandlet S2-hakk celler dannet aggregater raskere, og aggregatene var større og større i antall enn kontrollen de (figur 4B). Dette indikerte at redusere Shams nivåer forbedrer trans-binding av hakk med Delta8.

Undersøke om Shams regulerer den hemmende effekten av cis-ligander bindingen mellom hakk og trans-deltaet, vi først etablert co uttrykket hakk og Delta i signal-mottak cellen kan redusere celle aggregering formidlet av hakk og trans-deltaet. Figur 5A viser grafen indikerer antall aggregater dannet mellom S2-Delta og S2-hakk & Deltaforbigående celler med ulike mengder av cis-deltaet. Transfecting lik mengde hakk - og Delta-uttrykk konstruksjoner i S2 celler dramatisk reduserer antall aggregater dannet mellom disse cellene og S2-deltaet. Dessuten, redusere mengden av cis-Delta resulterer i en økning i antall aggregater, som angir at i området av hakket /cis-deltaet prosenter brukes i disse analyser, cis-Delta kan hemme bindingen mellom hakk og trans-Delta i en dose-avhengige måte. Siden S2-hakket & Deltaforbigående celler uttrykke både hakk og Delta, de kan danne homotypic aggregater uavhengig S2-Delta cellene. Å undersøke om dannelsen av homotypic samler blant S2-hakk & Deltaforbigående celler kan være en forvirrende faktor i cis-hemming analyser vist i figur 5A, vi blandet disse cellene med S2 celler og kvantifisert den samler. Figur 5B viser antall aggregater dannet etter blande S2 celler med S2-hakk & Deltaforbigående celler uttrykke ulike hakk /cis-deltaet prosenter. Et ganske lite antall homotypic aggregater sammenlignet heterotypic aggregater som vist i figur 5A ble observert. Vi konkludere med at disse aggregering analyser trofast måle effekten av cis-deltaet bindingen mellom hakk og trans-deltaet.

Vi neste undersøkte effekten av shams KD på hemmende evnen til cis-deltaet. Til denne slutten, aggregering mellom S2-Delta og S2-hakk & Deltaforbigående celler ble undersøkt. Figur 6A viser representant bilder av aggregering mellom S2-Delta celler og S2-hakkforbigående (kontroll) eller S2-hakk & Deltaforbigående celler. S2-Delta og EGFP dsRNA-behandlet S2-hakkforbigående celler dannet aggregater, som økning med tid, ligner aggregasjonen mellom S2-Delta og stabil S2-hakk celler (Figur 4). Spesielt, blande S2-Delta og S2-hakk & Deltaforbigående celler co transfekterte med like mengder hakk - og Delta-uttrykk plasmider dannet mindre aggregater både EGFP KD og shams KD, antyder at synkende nivået av Shams påvirker ikke evne til cis-deltaet blokkere hakk /trans-deltaet bindende. Å bedre vurdere virkningene av shams KD på aktiviteten i cis-deltaet, omfanget av hemming av cis-deltaet ble målt ved å beregne relative aggregering prosent over et utvalg av hakk /cis-deltaet prosenter som forklart i delen 3.4.2. Kvantifisering av relativ aggregering viste en sammenlignbare hemming av aggregering på EGFP og shams dsRNA behandling (figur 6B). Sammen disse observasjonene sterkt foreslår at tap av xylosylation fremmer trans-binding uten å påvirke cis-hemming8, og molekylær mekanisme for vinge blodåre tap fenotypen observert i shams mutanter.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av cellen aggregering analysen for Trans-binding. Diagram som viser induksjon av reseptor (S2-hakk) og ligand (S2-Delta eller S2-Serrate) uttrykke S2 celler med 0,7 mM CuSO4. Induksjon av begge S2 cellene etterfølges av miksing, som pleier å gjøre aggregat. Disse aggregater (> 6 celler) er fotografert og kvantifisert.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk fremstilling av cellen aggregering analysen å vurdere Cis-hemming. S2 celler var transiently transfekterte med Avdrag-hakk (S2-Nforbigående), Avdrag-hakk og Avdrag-deltaet (S2-hakk & Deltaforbigående), eller Avdrag-hakk og Avdrag-Serrate (S2-hakk & Serrateforbigående). Etter innledningen av 0,7 mM CuSO4 og blande med S2-Delta celler, samler (> 6 celler) er kvantifisert. Hemming av cis-ligander er målt i relativ aggregering prosent i tilstedeværelse og fravær av hver cis-ligand. Effekten av cis-ligander bindingen mellom hakk og trans-Serrate kan bestemmes ved å blande transiently transfekterte cellene med S2-SerrateTom celler (vises ikke). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: aggregasjonen mellom S2-hakk og S2 eller S2-Delta cellene på ulike tidspunkt. Diagrammet viser antall aggregater per mL på ulike tidspunkt (1, 5, 15 og 30 min) mellom de angitte celler. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt (SEM) av tre replikat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Celle aggregering mediert av hakk og trans-deltaet. (A) bilder viser samling på ulike tidspunkt (1, 5 og 15 min). Aggregasjonen mellom shams dsRNA-behandlet vanlig S2 cellene og S2-Delta ble tatt som bakgrunn. Shams- dsRNA behandlet S2-hakk celler viser en økning i antall og størrelsen på aggregater sammenlignet EGFP dsRNA-behandlet (kontroll) S2-hakk celler etter blanding med S2-Delta celler. Skala bar = 100 µm. (B) kvantifisering av cellen samler større enn 6 celler etter 5 min av aggregering. Feilfelt viser SEM. * P < 0,01 (enveis variansanalyse (ANOVA)). Tre gjentak med tre uavhengige gjentar ble utført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Cis-deltaet hemmer i celle samlet formasjon mediert av hakk og trans-Delta i en dose-avhengige måte. (A) grafen viser aggregering (i antall aggregater/mL) mellom S2-Delta cellene og S2 transiently transfekterte med ulike forhold av uttrykket vektorer for hakk og cis-deltaet (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 og 1:0. 1). Feilfelt viser SEM. * P < 0,01 (enveis ANOVA). Tre gjentak med tre uavhengige gjentar ble utført. Merk at redusere nivået av cis-deltaet resulterer i en økning i aggregering, sannsynligvis på grunn av redusert cis-hemming. (B) graf som viser homotypic samling (i antall aggregater per mL) i S2 celler transiently transfekterte med forskjellige prosenter av hakk og Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 og 1:0. 1) og blandes med vanlig S2 celler. Feilfelt viser SEM. antall aggregater er mye mindre enn heterotypic aggregater dannet mellom S2-Delta og S2-hakk & Deltaforbigående celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Knockdown for shams påvirker ikke hemmende aktiviteten av cis-deltaet. (A) vist er representativt bilder av effekten av shams KD på cis-Delta-mediert hemming av cellen aggregering formidlet av hakk /trans-deltaet bindende. Bildene viser samling på ulike tidspunkt (1, 5 og 15 min). Aggregasjonen mellom shams dsRNA-behandlet vanlig S2 cellene og S2-Delta ble tatt som bakgrunn. Lik stabilt transfekterte S2-hakk celler, shams KD økt antall aggregater mellom S2-Delta og S2-hakkforbigående celler i forhold til kontroll (EGFP dsRNA-behandlet). Co uttrykk for cis-Delta med hakket i en 1:1 ratio resulterte i en tilsvarende reduksjon i antall aggregater kontroll (EGFP dsRNA-behandlet) så vel som shams dsRNA behandlet celler. Skala bar = 100 µm. (B) grafen viser relativ aggregasjonen mellom S2-Delta cellene og S2 transiently co transfekterte med angitte forhold (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 og 1:0. 1) hakk og cis-deltaet. EGFP og shams dsRNA behandling viser en tilsvarende reduksjon i aggregering for hvert hakk /cis-Delta forholdet. Dataene som presenteres her er tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanoniske hakk signalering, avhenger av samspillet mellom hakk reseptoren og dens ligander5. Selv om de fleste studier hakk veien vurdere primært binding av hakk og ligander i nærliggende celler (trans), samhandler hakk og samme celle ligander, og disse såkalte cis-interaksjoner kan spille en hemmende rolle i hakk signalering3,4. Følgelig dechiffrere mekanismene bak effekten av en modifikator på kanonisk hakk signalering, er det ofte relevant å undersøke begge typer hakk-ligand samhandlinger (trans og cis). Men i mange sammenhenger i animalske utvikling kompliserer involvering av begge disse interaksjoner og deres tilbakemelding regulering i vivo studier1,6. I stede protokollen gir vi en detaljert metodikk for i vitro celle aggregering analyser bruke Drosophila S2 celler for å evaluere binding av hakk reseptor med trans- ligander og dens hemming av cis- ligander. Vi har presentert utnyttelse av denne metodikken å vurdere effekten av en genetisk modifikator av hakk signalisering (xylosyltransferase Shams7,8) på reseptor-ligand binding.

Først aggregering analyser ble utført mellom stabil S2-Delta og EGFP eller shams dsRNA-behandlet stabil S2-hakk å undersøke effekten av shams KD på trans-binding. Samling av S2-Delta celler med shams dsRNA-behandlet vanlig S2 celler ble tatt som bakgrunn. Shams KD forbedret aggregasjonen mellom S2-hakk og S2-Delta celler i forhold til kontrollen. Det er viktig å utføre bakgrunn eksperimentelle kontroll samlinger mellom vanlig S2 cellene og ligand-bærer S2 parallelt med trans-bindende eksperimenter. Selv om Drosophila S2 celler ikke uttrykke endogene hakk reseptor og Delta ligand11, rapporteres uttrykk for lave nivåer av Serrate i S2 celler13. Vurderer dette, vanlig S2 celler ble brukt i cellen aggregering analyser som bakgrunn kontroll; disse cellene viste ikke noen sammendragsnivåer (figur 5B). Aggregater telles manuelt ved hjelp av en hemocytometer. For å sikre konsekvent samlede kvantifisering, kan 10-20 µL av mikset-celle befolkningen være pipetted ut fra tre forskjellige områder per brønn for opptelling. Disse analyser krever friske voksende S2 celler. Vurderer semi tilhenger innholdet i S2 celler, milde pipettering mens samle cellene og konstant riste under aggregasjon analysen er viktig.

Tidligere har vi og andre brukt veletablerte, løselig ligand-reseptor bindende analyser for en kvantitativ vurdering av reseptor-ligand binding i trans17,18,19, 20. siden aggregering analyser semi kvantitativ, løselig ligand binding analyser ble også utført for å undersøke effekten av shams KD på hakk-ligand trans-binding. Observerte resultatene var lignende trend med de fra aggregering analyser8. Dette attestert trofaste evalueringen av binding av hakk med trans-ligander bruker celle aggregering analyser. Selv om samlet dannelsen er en presentasjon av reseptor-ligand binding, kan det være intrikate hvis overflaten uttrykk for hakk reseptoren eller dens ligander påvirkes av de angitte modifikatorer. Dette understreker begrensning av cellen aggregering analyser, som det ikke kan skilles hvis endring i samlede formasjon på grunn av endrede reseptor-ligand binding eller forandret overflate uttrykk. Derfor parallelt aggregering analyser, effektene av hver modifikator på overflaten uttrykk for hakk og ligander må testes i S2 celler. I forbindelse med våre studier, var overflate nivåer av hakk og deltaet ikke berørt i shams dsRNA-behandlet S2 celler8.

Undersøke hemming av trans-binding av tillegg av cis-ligander, aggregering analyser ble utført mellom S2-Delta celler og EGFP eller shams dsRNA-behandlet S2-hakk & Deltaforbigående celler . Antall aggregater dannet mellom disse cellene ble sammenlignet med antall aggregater dannet mellom S2-Delta cellene og S2-hakkforbigående . Relativ reduksjon av aggregater ble beregnet og brukes som en indikator for omfanget av hemming av cis-deltaet. De kontroll viste at cis-ligander Vis en robust og dosering-avhengige hemming av hakk /trans-deltaet bindende over et ganske bredt spekter av hakk til cis-ligand forhold (1:1 til 1:0. 1) (figur 5A)8 . En 1:1 ratio resulterte i sterkeste graden av cis-hemming, og redusere de relative nivået i cis-deltaet svekket cis-hemming. Følgelig KD eksperimenter over denne rekke prosenter ble utført. Av notatet, ble mengden hakk reseptor og den totale mengden transfekterte DNA holdt konstant i alle eksperimentene. Dette vil sikre at samlet formasjon er hovedsakelig påvirket av aktiviteten av cis-ligander og ikke av endret nivåer av hakk uttrykk av cellene.

Det ble tidligere vist co uttrykket hakk og cis-ligander i S2 celler kan føre til dannelse av homotypic samlinger14. Undersøke om lignende homotypic samlinger blant S2-hakk & Deltaforbigående eller S2-hakk & Serrateforbigående celler kan kompromittere våre tolkninger av de samlede quantifications i cis-ligand studier, en kontroll aggregering analysen ble utført mellom S2-hakk & Deltaforbigående og vanlig S2 celler. Antall S2 celler brukes i disse eksperimentene var den samme som S2-Delta celler brukes i cis-deltaet eksperimenter. Noen homotypic aggregering ble observert, men kvantifisering viste at de resulterende aggregatene bidra en lav brøkdel av de totale aggregatene sammenlignet med de heterotypic aggregatene mellom S2-hakk & Deltaforbigående og S2-deltaet celler () Figur 5B).Vi konkludere med at endringene observert av mengdefunksjoner i cis-ligand analyser er hovedsakelig på grunn av den hemmende effekten av cis-ligander bindingen mellom hakk og trans-deltaet.

I sammendraget, aggregering analyser presentert i denne protokollen gir en enkel og grei metode for semi kvantitativ vurdering av trans- og cis-interaksjoner hakk reseptoren og dens ligander. Disse analyser kan brukes til å undersøke effekten av genetiske eller farmakologiske hakk veien modifikatorer på hakk-ligand binding i vitro og derfor kan bidra belyse mekanismene bak i vivo effekten av disse modifiers på hakk signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter støtte fra NIH/NIGMS (R01GM084135 til HJN) og Mizutani grunnlag for Glycoscience (grant #110071 til HJN), og er takknemlige for Tom V. Lee for diskusjoner og forslag på analyser, og Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine og Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) for plasmider og linjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124, (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16, (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21, (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465, (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137, (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124, (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9, (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13, (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125, (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61, (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140, (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18, (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239, (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167, (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278, (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132, (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406, (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338, (6111), 1229-1232 (2012).
Celle aggregering analyser evaluere bindingen <em>Drosophila</em> hakket med <em>Trans</em>-ligander og dens hemming av <em>Cis</em>-ligander
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter