Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sammenlignbare Decellularization av Fetal og voksen hjerte vev Explants som 3D-lignende plattformer for i Vitro studier

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

Cardiac ekstracellulær matrix (EFM) er et kompleks nettverk av molekyler som arrangerer nøkkelprosesser i vev og organer mens varig fysiologiske remodeling gjennom hele livet. Standardiserte decellularization fosterets og voksen hjerter tillater komparative eksperimentelle studier av både vev i en 3D kontekst ved å fange opprinnelige arkitektur og biomekaniske egenskaper.

Abstract

Nåværende kunnskap om ekstracellulær matrix (EFM)-celle-kommunikasjon betyr store todimensjonal (2D) i vitro kultur studiene der ECM komponenter presenteres som en overflate belegg. Systemene kultur utgjør en forenkling av den komplekse naturen av vev ECM som omfatter biokjemisk komposisjon, struktur og mekaniske egenskaper. Bedre emulere ECM-celle kommunikasjonen utformingen av cardiac microenvironment, vi utviklet en protokoll som tillater decellularization av hele fosterets hjerte og voksen venstre ventrikkel vev explants samtidig for komparative studier. Protokollen kombinerer bruk av en hypotonisk buffer, et vaskemiddel anionic surfactant egenskaper og DNase behandling uten noen som helst krav for spesialiserte ferdigheter eller utstyr. Bruk av samme decellularization strategi over vevsprøver fra fag av ulike alder er en alternativ tilnærming til å utføre komparative studier. Nåværende protokollen tillater identifikasjon av unike strukturelle forskjeller over fosterets og voksen cardiac ECM mesh og biologiske mobilnettet svar. Videre den her metodikk demonstrerer en bredere anvendelse som blir brukt i andre vev og arter med mindre justeringer, som menneskelige tarmen biopsier og mus lunge.

Introduction

Den ekstracellulære matrisen (EFM) er et dynamisk nettverk av molekyler som regulerer viktig cellulære prosesser, nemlig skjebne avgjørelse, spredning og differensiering1,2. Etterforskningen av celle-ECM interaksjoner blitt utført hovedsakelig i todimensjonale (2D) i vitro kulturer belagt med ECM komponenter, som utgjør en forenkling av innfødte ECM egenskaper i vivo. Decellularization genererer acellular 3D-lignende ECM bioscaffolds som i stor grad bevarer ekstracellulære arkitektur og sammensetningen av innfødte vev og organer3,4. I tillegg bioaktive stillaser tissue engineering, er decellularized 3D ECM biologisk materiale fremstår som roman plattformer for å vurdere celle-ECM biologi som tilsvarer i vivo miljøet.

Vurdering av rollen annerledes ECM komponentene i forskjellige vev, organer og alder fordelen med bruk av lignende protokoller generere innfødte bioscaffolds. På hjertet, har vi utviklet en allsidig protokoll for decellularization av fetal og voksen-avledet prøver, som en alternativ tilnærming til å utføre komparative studier av orgel-microenvironment. Med denne metoden, vi fanget den opprinnelige hjerte microenvironment og viste at fosterets ECM fremmer høyere repopulation gir cardiac celler5. Decellularization gitt ytterligere identifikasjon av bosatt strukturelle forskjeller mellom fosterets og voksen ECM nivået av kjelleren lamina og pericellular matrix nettet arrangement og fiber komposisjon5. Før dette arbeidet, er head-to-head sammenligning av vev på ulike ontogenic stadier ved hjelp av samme decellularization tilnærming bare rapportert for rhesus monkey nyrer og gnager hjerter. I tillegg rapporterer et begrenset antall studier fosterets vev/orgel decellularization sådan5,6,7. Dette er oppnådd ved hjelp av SDS som unike decellularization agent; Imidlertid ble forskjellige SDS konsentrasjoner brukt til decellularization av fetal og voksen hjerte vev7,8. SDS er en av de mest effektive ioniske vaskemidler for klarering av cytoplasmatiske og kjernefysisk materiale, og brukt mye i decellularization av ulike vev og prøver9,10. Løsninger som inneholder høye konsentrasjoner av SDS og lengre eksponering har vært korrelert med protein rødsprit, glycosaminoglycan (GAGs) tap og forstyrrelse av kollagen fibrils10,11, og derfor en balanse mellom ECM bevaring og celle fjerning er nødvendig. Du kan bruke samme fremgangsmåte til fosterets og voksen hjertet vev ved protokollen beskrevet her er delt i tre sekvensielle trinn: celle lysis av osmotisk sjokk (hypotonisk buffer); solubilization av lipid-protein, DNA-protein og protein-protein interaksjoner (0,2% SDS); og kjernefysisk materiale fjerning (DNase behandling).

Våre Protokoll viser flere fordeler: jeg) at tilsvarende decellularization Aldersavhengige hjerte vev ved bruk av samme decellularization strategi; II) ingen krav til spesialiserte eller utstyr; III) klar tilpasning til andre vev og arter som det har vært anvendt med mindre endringer i menneskelige tarmen biopsier12 og mus lunge13; og viktigst, iv) kan ta ECM biomekaniske egenskaper samtidig som den muliggjør montering av 3D-lignende organotypic kulturer at mer tett etterligne molekylær funksjonene i den opprinnelige vev microenvironment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodikkene som beskrevet ble godkjent av i3S dyr etikk og Direção Geral de Veterinária (DGAV) og er i samsvar med det europeiske parlamentet direktivet 2010/63/EU.

1. forberedelse av decellularization løsninger

Merk: Alle decellularization løsninger skal være filtrert gjennom et 0.22 μm membran filter og lagret for maksimum 3 måneder, bortsett fra angitt.

  1. For 1 x PBS: Bland 8 g NaCl, 1.01 g Na2HPO4 200 mg KCl, og 200 mg KH2PO4 med 900 mL deionisert vann (DI vann). Justere løsningen pH 7.5 og endelig løsning volumet opp 1 L. Filter, autoklav og store løsningen ved romtemperatur (RT).
  2. Hypotonisk bufferen (10 mM Tris, 0,1% EDTA): oppløse 1.21 g av TrisBASE og 1 g av EDTA i 900 mL deionisert vann. Justere løsningen pH til 7,8 med NaOH/HCl og det endelige løsningen volumet 1 L. filter, sterilisere av autoklav og lagre på RT.
  3. 0,2% SDS løsning (0,2% SDS, 10 mM Tris): Legg 0,6 g av TrisBASE og 1 g av natrium dodecyl sulfate (SDS) i 400 mL DI vann og rør på 60 ° C til fullstendig stoff oppløsning. La løsning avkjølt RT. Juster løsningen pH til 7,8 og endelig løsning volumet til 500 mL. Sterilisere løsning av filtrering.
    Merk: SDS løsningen bør være forberedt før bruk. Filteret løsningen bare etter fullføre SDS oppløsning, ellers SDS uløselig partikler vil mette filteret, endre siste SDS konsentrasjonen og dermed påvirker vev decellularization effektivitet.
  4. For hypotonisk vaskebuffer (10 mM Tris): blande 1.21 g TrisBASE i 900 mL av DI vann. Justere løsningen pH til 7,8 og det siste bindet 1 L. filter, sterilisere av autoklav og lagre på RT.
  5. DNase behandling (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): oppløse 2.42 g TrisBASE og 2 mL 1 M MgCl2 i 900 mL DI vann. Justere pH til 7,8 og det endelige løsningen volumet 1 L. filter og sterilisere løsning av autoclave. Lagre løsning på RT. legge DNase jeg (50 U/mL) før å bruke.
  6. For DNase jeg lager løsning: forberede en DNase buffer inneholder 50% glyserol, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2, og justere til en endelig løsning volumet av 10 mL med DI vann. I laminær strømning hette, Legg DNase jeg pulver til DNase bufferen og bland forsiktig til fullstendig oppløsning. Sterilisere løsning gjennom 0.22 μm. Forberede 1 mL dele og lagre på 20 ° C.

2. vev høsting og kryonisk bevaring

  1. Euthanize voksen gravide kvinner 18 dager av svangerskapet (E18 fostre) via CO2 kvelning. Utføre et keisersnitt på kvinner med en kirurgisk saks og samle livmor hornene bærer fosterets mus til en Petriskål med iskald 1 x PBS med to taggete pinsett med bøyde ender (en tweezer hver horn slutten).
    1. Åpne livmor horn og amniotic sac å isolere fostre. Overføre fostre til en ny Petriskål med iskald 1 x PBS bedøve dem og halshugge med en saks.
    2. Euthanize 7-8 uker gammel mann C57BL/6 mus ved hjelp av CO2 kvelning. Utføre et snitt på hver musen brystet og samle hjertet.
    3. Kort skyll fosterets og voksen hjerter med isen kalde 1 x PBS.
  2. Fjerne atria voksen hjerte ved hjelp av en skalpell. Utføre et snitt på høyre ventrikkel og fjerne den benytter rett liten saks. Utsett venstre ventrikkel indre veggen ved å fjerne septum. I en ny Petriskål, dele venstre ventrikkel gratis-vegg i langsgående strimler med 2 mm tykkelse og fjerne papillary muskelen ved hjelp av en skalpell og taggete pinsett med bøyde ender.
    1. Avgiftsdirektoratet liten vev explants ved hjelp av en skalpell ved hjelp av et 2 x 2 mm rutenett (detaljert beskrivelse i supplerende figur 15). Kort skyll vev explants med 1 x PBS.
  3. Legge til ~ 250 µL av optimal kutte temperaturen (OCT) sammensatte autoklaveres 1,5 mL microcentrifuge rør. Overføre hele fosterets hjerte og voksen cardiac explants til rør med 250 µL av OCT og fryse dem med tørris-avkjølt isopentane og butikk på-80 ° C (maksimum 6 måneder).
    Merk: Bruk av hjertevev explants cryopreserved i mer enn 6 måneder vil redusere decellularization effektivitet, spesielt i voksen hjertet vev explants.

3. vev decellularization

Merk: Hjerte vev decellularization utføres i en 24-og vev kultur plate med ett utvalg per brønn. 1 mL av hver decellularization løsning lagt til hver enkelt også. Alle decellularization trinn skal utføres med agitering på 165 rpm (inkubator shaker med en orbital diameter 20 mm) og ved 25 ° C, med mindre annet er angitt. For mer informasjon, kan du se oppsettet på figur 1A. Amfotericin B (f.eks fungizone) og gentamicin er nylig lagt til alle decellularization løsninger før bruk for å en final konsentrasjon av 2,5 μg/mL og 0,01 μg/mL, henholdsvis. Å kvantifisere mengden DNA beholdt i decellularized vev, må prøve masse bestemmes før du starter decellularization protokollen. DNA kvantifisering protokollen er nærmere beskrevet i delen 5.1.

  1. DAG 1
    1. Fjern vevsprøver fra-80 ° C fryseren. La det 1,5 mL microcentrifuge rør på RT til OCT blir delvis smeltet. Overføre hjerte vev blokken i fortsatt frosset Tilpasningsverktøy for Office til en Petriskål med 1 x PBS.
    2. Etter Tilpasningsverktøy smelter, flytte hjerte vev til en ny Petriskål med 1 x PBS. Vask prøver 1 x PBS og 60 rpm med en shaker i 10-15 min. Gjenta minst to ganger.
    3. Legg 1 mL av arbeider hypotonisk Buffer per brønn av et sterilt 24-og vev kultur plate. Overføre ett utvalg per brønn ved hjelp av pinsett.
    4. Flytte 24-og vev kultur plate med prøvene til en inkubator shaker ved 25 ° C og starte den 18 h inkubering med hypotonisk Buffer.
  2. DAG 2
    1. Forberede 0,2% SDS løsningen som beskrives i delen 1.3.
    2. Sug opp hypotonisk bufferen og vask prøvene med 1 x PBS for 1 h. Gjenta 3 ganger.
      Merk: PAUSE poeng: vev under decellularization kan holdes i 1 x PBS på 4 ° C 18 h i statisk forhold.
    3. Fjerne 1 x PBS, Legg 1 mL av nystekte SDS stoppløsningen (trinn 1.3) per brønn og ruge prøver for 24 timer.
      Merk: (Se punkt) innlegget SDS inkubering, sikre at eksempler viser en hvit til gjennomskinnelig utseende. På dette trinnet SDS behandlet prøver er dynket i DNA, viser en gelatin konsistens. Fjerne SDS løsningen sakte for å unngå eksempel vedheft til pipette spissen.
  3. DAG 3
    1. Vask prøvene med hypotonisk vaskebuffer (1 mL per brønn) for 20 min. Gjenta 3 ganger.
      Merk: På dette trinnet er det vanlig å observere en nedgang i utvalgsstørrelsen på grunn av fjerning av cellen restene. PAUSE POINT: Vev under decellularization kan holdes i hypotonisk vaskebuffer ved 4 ° C i 18 h i statisk forhold.
    2. Legg 1 mL av DNase behandling løsning per brønn og ruge prøvene for 3t på 37 ° C.
    3. Sug opp DNase behandling løsningen og vask prøvene med 1 x PBS (1 mL per brønn) for 20 min. Gjenta 3 ganger. Utfør en siste vask med 1 x PBS (1 mL per brønn) over natten ved RT og rister på 60 rpm.
    4. (Sjekkpunkt) Etter DNase behandling, sikre at de decellularized prøvene har mistet den gelatin konsistensen.
      Merk: Etter DNase behandling, fjerne og legge til 1 x PBS forsiktig siden eksempler kan være lett fanget og festet til pipette tuppen.

4. vurdering av decellularized vev fjerne

  1. Fikse prøvene i en 24-og vev kultur plate, 1 vareprøve per Vel, ved å legge 1 mL av nystekte 10% formalin nøytral buffer med 0,03% vandig eosin 2,5-3 h på RT.
    Merk: Eosin er lagt til bindemiddel stain decellularized vev og å lette eksempel visualisering under snitting og histologiske flekker. Tillegg av eosin verken interfererer med histologiske flekker eller immunofluorescence teknikker. Alternativt, fiksering kan utføres over natten på 4 ° C.
  2. Fjern etappe, den stabiliserende løsningen og tilsett 1 mL 1 x PBS å vaske prøven.
  3. Innkapsle det faste bioscaffolds i histology behandling gel bruker en engangs vinyl prøven mold i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Fjerne histology gel med prøven inn fra mold og overføre biopsi behandling/Embedding kassetter med lokk.
    Merk: Et alternativ til vev innebygging i histology og behandling gel er å behandle hvert utvalg i to biopsi svamper med små porer. Prøvene skal lokaliseres til midten av biopsi aktivere gjenkjenning. Av notatet, kan eksempler være vanskelig å lokalisere bruker denne tilnærmingen.
  5. Behandle prøvene for parafin innebygging gjennom etterfølgende incubations (30 minutter per løsning) i serien for alkohol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), isoparaffinic alifatisk hydrokarboner løsning (2 inkubasjon stasjoner) og parafin (2 inkubasjon stasjoner) på 56 ° C.
  6. Montere prøvene i en parafin blokk.
  7. Skjær 3 μm tykke parafinsnitt på en mikrotom og samle delene på glass objektglass.
  8. Tørr parafinsnitt overnatting på 37 ° C.
    Merk: (PAUSE poeng) parafinsnitt lagres på 4 ° C til fremme bruk.
  9. For å bekrefte protokollen effektivitet, utføre Hematoxilin og Eosin (H & E) og Masson's Trichrome flekker (MT) av decellularized utvalg og deler av ikke-manipulert vev i henhold til produsentens instruksjoner.
    Merk: H & E flekker flekker celle kjerner blålilla, cytoplasma mørk rosa/rød og kollagen blek rosa og MT flekker kjerner svart, cytoplasma rød, og kollagen og mucin blå. Effektiv decellularization oppnås når en porøs lys rosa (H & E, MT) og blå (MT) nettverk er observert, i fravær av en kjernefysisk flekk.

5. vurdering av decellularized vev kjernefysisk materiale fjerning

Merk: Kvantifisering av DNA innholdet på decellularized vev må utføres i forhold til de respektive ikke-manipulert vev.

  1. Før decellularization, veie en 1,5 mL microcentrifuge rør i høy presisjon digital skala. Overføre hjerte vev til røret, fjerne ekstra mengden 1 x PBS og veie røret med prøvene. Beregne våt vekten av eksemplene:
    Prøvevåt vekt = vekt rør med eksempler -vekt tom rør
  2. Decellularize prøvene som beskrevet i trinn 3.
  3. Etter decellularization, samle decellularized vev i et microcentrifuge rør.
    1. Små og masse personlige cardiac prøver og kit spesifikasjoner, basseng decellularized vev i hvert eksempel vilkår (fosterets hjerte: 5 hele hjerter; voksen LV explants: 15 explants). Utføre den samme prosedyren med ikke-manipulert vevet.
      Merk: (PAUSE poeng) eksemplene kan være lagret på 20 ° C til DNA utvinning og kvantifisering utføres.
  4. Klipp den ikke-manipulert og decellularized vev i små explants en hjelp av en skalpell i en ren Petriskål.
    Merk: Bruk en personlige skalpell og Petriskål for hvert utvalg. Mekanisk avbrudd av prøvene med skalpell forenkler deres bakre enzymatisk fordøyelsen og påfølgende DNA utvinning.
  5. DNA utvinning, bruke en spin-kolonne basert DNA utvinning metoden i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Samle mekanisk dissosiert prøvene fra Petriskål med master fordøyelsen bufferen (fordøyelsen buffer og proteinasen K) i henhold til produsentens instruksjoner med et bredt orifice pipette tips.
      Merk: Vev lysis proteinasen K fordøyelsen er raskere i decellularized prøver. Behandle forskjellige eksempler på samme tid, holde lysed prøvene på is, til alle prøvene er lysed for å minimere degradering. Komplett prøver lysis oppnås mellom 4-6 h.
    2. Fortsett med protokollen i henhold til instruksjonene fra produsenten.
    3. For å øke avkastningen av utdraget DNA av decellularized og ikke-decellularized, elute DNA på 25-50 μL og 100 μL elueringsbufferen, henholdsvis. Samle eluted DNA og laste spin-kolonnen. Inkuber for 1 min på RT. sentrifuge prøvene i henhold til produsentens instruksjoner.
      Merk: (PAUSE poeng) The DNA utdraget fra prøvene kan være store på 20 ° C til videre bruk.
  6. Kvantifisere utdraget DNA fra prøvene med et fluorescerende dsDNA oppdagelsen utstyr følger produsentens instruksjoner.
  7. Normalisere DNA innholdet som nanograms av DNA per mg av første eksempel våt vekt (før decellularization).

6. decellularized stillaser celle såing

Merk: Alle løsninger/reagenser må være sterile og hele prosedyren utføres på sterile forhold.

  1. Forberede 1 x DPBS med 2,5 μg/mL amfotericin B og 1% P/S (penicillin, 100 IE, streptomycin 100 µg/mL).
  2. Fjerne 1 x PBS løsning fra siste decellularization vask trinn (trinn 3.3.3) og tilsett 500 μL per brønn av nylagde 1 x DPBS/2.5 μg/mL av amfotericin B/1% P/S løsning. Lagre prøver på 4 ° C fra 1-7 dager.
    Merk: Utvalg lagring på 4 ° C er viktig å opprettholde sterilitet.
  3. Legge til P/S celle basale medier (uten FBS og kosttilskudd) til en siste konsentrasjon av 1%.
  4. Sug opp 1 x DPBS/2.5 μg/mL av amfotericin B/1% P/S løsning fra decellularized prøvene. Legg 500 μL per brønn av cellen basale media/1% P/S og la prøver equilibrate 1t på 37 ° C eller på 4 ° C for mer enn 1 time.
  5. Dele cellene rundt og forberede liten dele cellene på cellen tetthet ønsket.
    Merk: Decellularized vev seeding må utføres under stereoskopisk mikroskop og sterile forhold. Celle kultur medier skal inneholde 1% P/S.
  6. Pipetter 3-4 μL DPBS til midten av en godt av en 96-brønns plate. Ved hjelp av tynne og rett pinsett, overføre decellularized stillasene til DPBS drop, fjerne den ekstra DPBS av aspirasjon og sikre at prøven ikke er kastet eller rynkete. La det bli tørr på kantene å følge godt overflaten.
    Merk: Frittliggende stillaser har lavere seeding effektivitet.
  7. Legge celler til stillaset ved pipettering encellede løsningen sakte mot kantene av brønnen.
    Merk: For eksempel neonatal rotte cardiomyocytes er plantet med på en tetthet av 7500 celler/mm2 og udødeliggjort mus Lin− Sca-1+ hjerte progenitor celler (iCPCSca-1) på en tetthet av 60-1500 celler/mm2. Justere celle tetthet ifølge eksperimentelle begrunnelsen.
  8. Legge til DPBS i nabolandet brønnene å unngå raske media fordampning.
  9. 24 timer post celle seeding, hvis samme celle type overholdt vev kultur polystyren plater (TCPS), overføre bioscaffolds til en ny brønn. Ellers Erstatt medium for å fjerne ikke-tilhenger celler.
  10. Endre nøye media etter behov av celle type.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Decellularization effektiviteten bør vurderes gjennom tre viktigste teknikker: makroskopisk observasjon, histology og DNA kvantifisering. Makroskopisk utseende prøver post-SDS behandling påvirker indirekte effekten av fjerne. Etter SDS inkubasjon vises prøver som gjennomsiktig til hvitaktig (figur 1 c). Fetal (E18) decellularized vev er preget av en svært gjennomsiktig struktur mens voksen explants har en gjennomskinnelig hvit utseendet. En hvitere utseende er generelt korrelert til et ECM nettverk viser høyere fiber og kollagen innhold, f.eks voksen ventrikkel og vaskulær fartøyene ECM mesh (figur 1 c). Hematoxylin & Eosin (H & E) og/eller Masson's Trichrome (MT) flekker utføres for å bekrefte effektivt fjerne av observasjon av en porøs mesh (lys rosa, H & E, lys rosa og blått, MT) (figur 1 c). I tillegg høydepunkter MT flekken kollagen meshwork i blå5. Rydding av kjernefysisk materiale etter at decellularization er tilgjengelig for DNA kvantifisering og en reduksjon av ca 99.8% oppnås vanligvis, sammenlignet med ikke-manipulert vev (figur 1 c). Tilstedeværelsen av kjernefysisk materiale på decellularized stillaser har blitt beskrevet som en utløser av uønskede inflammatorisk respons på implantasjon14. Derfor er bekreftelse av effektiv decellularization viktig før innfødte 3D stillaset repopulation eksperimenter. Decellularized stillaser lagres i sterile forhold til såing med celler av interesse. Cellen levedyktighet overvåkes gjennom i vitro kultur av calcein flekker (figur 2A). Calcein flekk kan likevel være cytotoksiske til sensitive celletyper. Terminal analyse for celle repopulation og distribusjon over stillaser er utført etter parafin behandling. et øyeblikksbilde av bioscaffold repopulation vurdert av H & E flekker på en sentral del av bioscaffolds vises (figur 2B, 2 C).

Figure 1
Figur 1. Fetal (E18) og voksne hjerte vev decellularization prosedyre og bekreftelse av decellularization effektiviteten. (A) protokoll oversikt. (B) Decellularization protokollen detaljert. (C) makroskopisk analyse av cardiac fosterets og voksen vev før og etter decellularization. Skala bar: 2 mm. (D) kvantifisering av kjernefysisk materiale i decellularized versus ikke-manipulert vev. Data uttrykt som betyr ± SEM. Student t-test, tosidige * p < 0,05. (E) H & E og Masson's Trichrome histologiske analyse av cardiac fosterets og voksen vev før og etter decellularization. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Repopulation analyse av decellularized stillaser seeded med Lin - Sca-1+ hjerte stamfar cellen linje (iCPCSca-1). (A) høyt levedyktighet observert stillaser overflaten under i vitro kultur av calcein flekk (grønn). Skala bar: 100 μm. (B) celle nummer og distribusjon over stillaser vurdert via H & E flekker. Skala bar: 100 μm. (C) ortogonale visning av celler i decellularized ECM. AC confocal bilde av 50μm-tykk parafin delen. Skala bar: 10 μm (ortogonale visning XZ, YZ) og 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Trinn Observasjon Mulig årsak Problem Løsning
3.1.2. Vev med en brunlig farge Eksempel cryofixation; ustabil frysing temperatur Eksempel cryofixation fører til ineffektiv fjerning av cytoplasmatiske proteiner Lagre frossent i kortere perioder. Når fryser temperatur og stabilitet
3.2.4. Rosa-til-hvite ugjennomsiktig prøver SDS løsning var ikke godt forberedt; voksen LV explants for stor Ineffektiv fjerning av cytoplasmatiske proteiner Sikre komplett SDS oppløsning. Decellularize prøver av mindre størrelse.
3.3.4. Prøver med en gelatin utseende Ineffektiv DNA fjerning Ineffektiv kjernefysisk materiale klaring Øke DNase konsentrasjon og/eller inkubasjon.
4.6. Histology gel komprimering Lang ventetid i PBS1X/etanol før parafin behandling Endring av decellularized vevet struktur Starte histologiske behandling så snart som mulig
6.6. Tørket decellularized prøver Prøvene ble overlatt til tørr for lenge Permanent sammenbruddet av decellularized vev. Ineffektiv celle såing Tillate prøver litt tørr bare i periferien for å bli knyttet til bunnen av brønnen under såing
6.7. Decellularized prøven avdeling under såing Prøvene var ikke tilstrekkelig tørket før såing Ineffektiv celle såing Øke ECM tørketid tillate bedre etterlevelse før cellen såing

Tabell 1. Feilsøking tabell for parallell decellularization fosterets (E18) og voksne mus hjerte vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den ekstracellulære matrisen (EFM) er en meget dynamisk og komplekse meshwork av fibrøs og lim glykoproteiner, bestående av et reservoar av rekke bioaktive peptider og fanget vekstfaktorer. Som store modulator celle vedheft, cytoskjelett dynamics, motilitet/overføring, spredning, differensiering og apoptose regulerer ECM aktivt cellulære funksjoner og atferd. Å vite at mobilnettet atferd avviker i 2D og 3D kulturer, har det vært innsatsen for å utvikle romanen organotypic modeller som replikeres nøyaktig naturlige vev miljøer. I de siste årene, har vev decellularization framstått som en alternativ teknikk for tissue engineering og regenerativ medisin. Dermed vev og organ decellularization er verktøyet til valg å bedre analysere vev-spesifikke microenvironmental parametere (biokjemiske, strukturelle og mekanisk) og biologisk aktivitet i vitro og in vivo.

Vi utviklet en protokoll som kombinerer bruk av en hypotonisk buffer med vaskemiddel anionic surfactant egenskaper etterfulgt av en DNase behandling5,12,13. Nåværende protokollen utgjør en enkel og reproduserbar metode for å utføre komparativ analyse mellom decellularized fosterets og voksen mus hjerte vev. Vår erfaring med andre vev, nemlig med svulst prøver pasienter kirurgisk resections og mus lungevev, viser at denne protokollen er lett tilpasses og vellykket i andre forhold og modeller12,13. Bruk av samme decellularization fremgangsmåte på ulike prøver kan komparative studier av ECM komposisjon, biomekaniske egenskaper, arkitektur og mobilnettet modulatory egenskaper i en 3D sammenheng.

En av de vanskeligste utfordringene av vev decellularization er balansen mellom direkte fjerne, ECM meshwork bevaring og vev biocompatibility. Derfor må flere kritiske trinn vurderes nøye, som av vev kryonisk bevaring før decellularization, riktig explant størrelsen, bruk av fersk løsninger og manipulering av siste decellularized vev. Under våre studier observerte vi en direkte sammenheng mellom lengre lagring på cryopreserved vev og bruk av langvarig SDS løsninger med decellularization ineffektivitet. Vev langtidslagring fører til ineffektiv mobilnettet innholdet fjerning gjengivelse restene av tykk mobilnettet områder (uten kjerner) blant de komplekse ECM meshwork. En lignende uønsket effekt er oppnådd når lenge lagrede SDS løsninger brukes for vev decellularization, sannsynligvis fordi SDS løsninger har en kort stabilitet grunnet redusert løselighet, hydrolyse og pH endringer over tid15,16 . Bruk av explants av den riktige størrelsen (~1.5 mm x 1,5 x 1,5 mm) er også avgjørende for vellykket voksen vev decellularization, siden større vev resections er vanskeligere å decellularize, vise celle rusk fanget på overflaten og arrestert mellom tett ECM nettverket. Selv om denne protokollen gir en effektiv metode for hjertevev decellularization, kan en liten brøkdel av voksen explants presentere celle rester, spesielt de av større. Histologiske analyse av disse prøvene letter deres identifisering og påfølgende utelukkelse fra studien. Til slutt, protokollen her er allsidig og lett gjelder forskjellige prøver med små justeringer i vev explant størrelsen, SDS konsentrasjon (0,1-0,2% SDS) eller løsning inkubasjon tid5,12,13 .

Stor begrensning av metoden stede er at manipulering av liten størrelse prøver, dvs murine fosterets hjerte og voksen heart explants, krever noen håndtering ferdigheter. Faktisk er både fosterets og voksen decellularized vev delikat strukturer som kan være permanent deformert når tørket under prosedyren eller fanget av tynne pipette spissen eller under behandling med tang5.

Den store nyheten av denne protokollen, foruten den parallelle decellularization fosterets musen hjerte og voksen venstre ventrikkel explants sammenlignende vurdering av ECM sammensetning (biomekaniske analyser) og tilknyttede biologiske funksjonen, er enkelt oversettelse til forskjellige5,12,13-med vev og modeller. Decellularization av vev i forskjellige aldre ved hjelp av standardiserte metoder ble beskrevet på rhesus monkey nyrene og tverrgående delene av fetal, neonatal og voksen vev, som ble utsatt for en 1% SDS behandling for 10 dager6 . I en hjertestans, men fosterets, neonatal og voksen vev har blitt decellularized, forskjellig metodene på graden av mekaniske dislodging, SDS konsentrasjoner og tid programmet7,8. Som hver decellularization prosedyren påvirker ECM på en unik måte, kan sammenligning av decellularized prøver innhentet fra forskjellige protokoller føre til konklusjonene blir misvisende. Dermed kan bruke samme decellularization fremgangsmåte over ulike prøver pålitelig komparativ analyse.

Det store flertallet av kommersielt tilgjengelige decellularized vev avledet fra voksen prøver17. Til tross for den voksende anerkjennelsen for en økt evne til fosterets microenvironments i å tilby pro-regenerativ signaler i forhold til sine voksne kolleger, ble decellularization av fosterets vev bare rapportert i noen studier5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. forståelse ECM dynamics under den aldrende prosessen vil være avgjørende for å identifisere unike funksjoner i pro-regenerativ microenvironments som i sin tur vil påvirke utviklingen av høyere effektivitet biomimetic-materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er gjeld til alle medlemmer av Pinto--Ó laboratorium for relevante kritisk diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) under prosjektet "CARDIOSTEM-konstruert hjerte vev og stilk cellen-basert behandling for hjerte applikasjoner" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. er en mottaker av en FCT fellesskap [SFRH/BD/88780/2012] M.J.O. er en FCT kar (FCT-etterforsker 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Bioteknologi problemet 145 Decellularization ekstracellulær matrix 3D stillaser fosterets hjerte voksen hjertet hjerte vev utvikling

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Sammenlignbare Decellularization av Fetal og voksen hjerte vev Explants som 3D-lignende plattformer for i Vitro studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter