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Bioengineering

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Abstract

Conhecimento atual da matriz extracelular (ECM)-célula comunicação se traduz em estudos de grande bidimensional (2D) cultura in vitro, onde os componentes de ECM são apresentados como um revestimento de superfície. Estes sistemas de cultura constituam uma simplificação da natureza complexa do tecido ECM que engloba a composição bioquímica, estrutura e propriedades mecânicas. Para melhor emular a ECM-célula comunicação moldar o microambiente cardíaca, desenvolvemos um protocolo que permite a decellularization do coração fetal toda e tecido adulto ventrículo esquerdo explants simultaneamente para estudos comparativos. O protocolo combina a utilização de um buffer hipotônica, um detergente de surfactante aniônico Propriedades e tratamento de DNase sem qualquer exigência de habilidades especializadas ou equipamento. A aplicação da estratégia de decellularization da mesma através de amostras de tecido de indivíduos de idade diferentes é uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos. O presente protocolo permite a identificação das únicas diferenças estruturais entre fetais e adultas cardíaca ECM malha e biológicas respostas celulares. Além disso, a aqui a metodologia demonstra uma aplicação mais vasta, sendo aplicada com sucesso em outros tecidos e espécies com pequenos ajustes, tais como em biópsias de intestino humanas e pulmão do rato.

Introduction

A matriz extracelular (ECM) é uma rede dinâmica de moléculas que regulam processos celulares importantes, nomeadamente o destino-decisão, proliferação e diferenciação de1,2. A investigação de interacções célula-ECM foi realizada principalmente em duas dimensões (2D) em vitro culturas revestido com componentes de ECM, que constituem uma simplificação das propriedades nativas de ECM encontrado na vivo. Decellularization gera bioscaffolds de ECM 3D-como acelular que preservam em grande parte a arquitetura extracelular e composição de tecidos nativos e órgãos3,4. Além de servir como andaimes bioativos para a engenharia de tecidos, biomateriais de ECM decellularized 3D estão emergindo como plataformas de romance para avaliar biologia celular-ECM desse paralelo o ambiente em que vivo.

Avaliação da função diferencial dos componentes de diferentes tecidos, órgãos e idade ECM serão beneficiados com o uso de protocolos semelhantes de gerar bioscaffolds nativo. No coração, temos desenvolvido um protocolo versátil para decellularization de amostras fetais e adulto-derivado, como uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos com o microambiente do órgão. Usando esta metodologia, capturamos o microambiente cardíaca nativa e mostrou que o ECM fetal promove maior rendimento de repovoamento de células cardíacas5. Decellularization ainda mais desde a identificação de residentes diferenças estruturais entre ECM fetal e adulto ao nível da cave lamina e pericelular matriz malha o arranjo e composição de fibra5. Antes deste trabalho, Head-to-comparação de tecidos em diferentes estágios de ontogenic, usando a mesma abordagem de decellularization só tem sido relatado para roedores corações e rins de macaco rhesus. Além disso, um número limitado de estudos relatam o tecido fetal/órgão decellularization por si5,6,7. Isto foi conseguido usando SDS como agente exclusivo de decellularization; no entanto, distintas concentrações de SDS foram usadas para o decellularization do tecido cardíaco fetal e adulto7,8. SDS é um dos detergentes iônicos mais eficazes para o apuramento de material citoplasmático e nuclear e amplamente utilizado na decellularization de diferentes tecidos e espécimes9,10. Soluções contendo altas concentrações de SDS e longos períodos de exposição tem sido correlacionadas com a desnaturação da proteína, a perda de glicosaminoglicano (GAGs) e a ruptura do colágeno fibrilas10,11e, portanto, um equilíbrio entre preservação e célula remoção de ECM é necessário. Para aplicar o mesmo procedimento para o tecido cardíaco fetal e adulto, o protocolo descrito neste documento é dividido em três etapas sequenciais: lise de células por choque osmotic (hipotônica tampão); solubilização dos lipídios-proteínas, ADN-proteína e proteína-proteína interações (0,2% SDS); e remoção de material nuclear (tratamento de DNase).

Nosso protocolo mostra várias vantagens: eu) a possibilidade de decellularization equivalente dos tecidos cardíacos de idade específica aplicando a mesma estratégia de decellularization; II) sem requisitos para métodos especializados ou equipamento; III) pronta adaptação para outros tecidos e espécies como foi aplicado com sucesso com pequenas alterações em biópsias de intestino humano12 e mouse pulmão13; e, importante, iv) pode resolver propriedades biomecânicas de ECM, permitindo a montagem de organotypic 3D-como as culturas que mais estreitamente imitam as características moleculares do microambiente do tecido nativo.

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Protocol

Todas as metodologias descritas foram aprovadas pelo i3S Comitê de ética Animal e Direção Geral de Veterinária (DGAV) e estão em conformidade com a europeias Parlamento Directiva 2010/63/CE.

1. preparação das soluções decellularization

Nota: Decellularization todas as soluções devem ser filtradas através de um filtro de membrana de 0,22 μm e armazenadas por um período máximo de 3 meses, exceto especificado o contrário.

  1. Para 1X PBS: misturar 8 g de NaCl, 1,01 g de Na2HPO4 200 mg de KCl e 200 mg de KH2PO4 com 900 mL de água deionizada (água DI). Ajuste o pH da solução de 7,5 e o volume de solução final para 1 filtro de L., autoclave e armazenar a solução à temperatura ambiente (RT).
  2. Para Buffer hipotônica (10 mM Tris, 0,1% EDTA): dissolver 1,21 g de TrisBASE e 1 g de EDTA em 900 mL de água desionizada. Ajustar o pH da solução para 7,8 com NaOH/HCl e o volume de solução final para 1 L. filtro, esterilize em autoclave e armazenar no RT
  3. Para solução de SDS de 0,2% (0,2% SDS, 10mm Tris): Adicionar 0,6 g de TrisBASE e 1 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) em 400 mL de água Desionizada e mexa a 60 ° C até a dissolução completa de soluto. Deixe a solução arrefecer a pH de solução RT. Adjust para 7,8 e o volume da solução final de 500 mL. Esterilize a solução por filtração.
    Nota: A solução de SDS deve ser preparada antes de usar. Solução de filtro só depois completar a dissolução do SDS, caso contrário as partículas insolúveis SDS ficarão saturados o filtro, mudando a concentração final de SDS e, consequentemente, afetando a eficiência de decellularization de tecido.
  4. Para tampão de lavagem hipotônica (10 mM Tris): misturar 1,21 g de TrisBASE em 900 mL de DI água. Ajustar o pH da solução para 7,8 e o volume final para 1 L. filtro, esterilize em autoclave e armazenar no RT
  5. Para o tratamento de DNase (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 DNase U/mL): dissolver 2,42 g de TrisBASE e 2 mL de 1m MgCl2 em 900 mL de água Desionizada. Ajustar o pH a 7,8 e o volume de solução final para 1 L. filtro e esterilizar a solução por autoclave. Armazenar a solução no RT. Adicionar DNase eu (50 U/mL) antes de usar.
  6. Para DNase armazeno solução: preparar uma reserva de DNase contendo 50% de glicerol, pH 7,5, 1 mM MgCl2, do Tris-HCl de 20mm e ajustar para um volume de solução final de 10 mL com água. Em uma capa de fluxo laminar, adicione o DNase I do pó para o buffer de DNase e misture suavemente até dissolução completa. Esterilize a solução através de filtro de 0,22 μm. Alíquotas de 1ml de preparar e armazenar a-20 ° C.

2. tecido colheita e criopreservação

  1. Eutanásia em fêmeas grávidas adultas em 18 dias de gestação (fetos E18) através do CO2 asfixia. Realizar uma cesariana em fêmeas com uma tesoura cirúrgica e coletar os cornos uterinos, tendo os ratos fetais para uma placa de Petri com PBS 1x gelada usando duas pinças serrilhadas com pontas curvadas (uma pinça para cada extremidade do chifre).
    1. Abra os cornos uterinos e o saco amniótico para isolar os fetos. Transferi os fetos para uma nova placa de Petri com PBS 1x gelada para anestesia e decapitar com uma tesoura.
    2. Eutanásia em camundongos C57BL/6 machos 7-8 semanas de idade, usando CO2 asfixia. Realizar uma incisão no peito cada rato e recolher o coração.
    3. Brevemente enxague o coração fetal e adulta com gelo frio 1X PBS.
  2. Remova os átrios do coração adulto com a ajuda de um bisturi. Realizar uma incisão no ventrículo direito e removê-lo usando tesouras pequenas em linha reta. Expor a parede interna do ventrículo esquerdo através da remoção do septo. Em uma nova placa de Petri, dividir o ventrículo esquerdo livre-parede em tiras longitudinais com espessura de 2 mm e remover o músculo papilar usando um bisturi e uma pinça serrilhada com pontas curvadas.
    1. Impostos especiais de consumo pequeno tecido explantes com a ajuda de um bisturi, usando uma grade de 2 x 2 mm (descrição detalhada na complementar 1 da figura5). Brevemente enxague o tecido explantes com PBS 1x.
  3. Adicione ~ 250 µ l da temperatura de corte ideal (OCT) composta para tubos de microcentrifuga autoclavado 1,5 mL. Transferir todo fetais corações e explantes cardíacas adultos para os tubos com 250 µ l de PTU e congelá-los com gelo seco refrigerado isopentano e loja a-80 ° C (até um máximo de 6 meses).
    Nota: O uso de tecido cardíaco explantes criopreservado por mais de 6 meses irá reduzir significativamente a eficiência de decellularization, especialmente em explantes de tecido do coração adulto.

3. decellularization de tecido

Nota: Decellularization de tecido cardíaco é executada em uma placa de cultura de tecido de 24-poço com uma amostra por bem. Bem, 1 mL de cada solução de decellularization é adicionado para cada indivíduo. Todos os decellularization de etapas devem ser executadas com agitação a 165 rpm (agitador incubadora orbital de 20 mm de diâmetro) e a 25 ° C, a menos que especificado em contrário. Para mais detalhes, consulte o esquema na figura 1A. Anfotericina B (fungizone, por exemplo ) e gentamicina são recém adicionados a todas as soluções de decellularization antes do uso para uma concentração final de 2,5 μg/mL e 0,01 μg/mL, respectivamente. Para quantificar a quantidade de DNA mantida dentro de tecidos decellularized, a amostra massa precisa ser determinada antes de iniciar o protocolo decellularization. O protocolo de quantificação de DNA é mais detalhadas na seção 5.1.

  1. DIA 1
    1. Retire amostras de tecido do freezer-80 ° C. Deixe a 1,5 mL microcentrifuge tubos em RT até OCT torna-se parcialmente derretido. Transferi o bloco de tecido cardíaco da OCT ainda congelado para uma placa de Petri com PBS 1x.
    2. Depois derrete a OCT, mova o tecido cardíaco para uma nova placa de Petri com PBS 1x. Amostras de lavagens em 1 x PBS e a 60 rpm com um misturador de 10-15 min. repetir pelo menos duas vezes.
    3. Adicione 1 mL de trabalhar hipotônica Buffer por alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço estéril. Transferi uma amostra por poço com a ajuda de pinças.
    4. Mova a placa de cultura de tecidos de 24-bem com as amostras de um agitador de incubadora a 25 ° C e iniciar a incubação de 18 h com Buffer hipotônica.
  2. DIA 2
    1. Prepare a solução de SDS de 0,2%, conforme descrito na seção 1.3.
    2. Aspirar o Buffer hipotônica e lavar as amostras com PBS 1x por vezes de 1 h. repetir 3.
      Nota: Ponto de pausa: tecido sob decellularization pode ser mantido em 1X PBS a 4 ° C por 18 h em condições estáticas.
    3. Remover a PBS 1x, adicionar 1 mL da solução de SDS recém-feitos (etapa 1.3) por bem e incubar as amostras por 24 h.
      Nota: Incubação SDS de Post (CHECK POINT), certifique-se de que as amostras apresentam um branco a aparência translúcida. Neste passo, SDS tratadas amostras são encharcadas de DNA, apresentando uma consistência de gelatina. Remova a solução de SDS lentamente para evitar aderência de amostra para a ponta da pipeta.
  3. DIA 3
    1. Lave as amostras com amortecedor da lavagem hipotônica (1 mL por bem) por 20 min. repetir 3 vezes.
      Nota: Neste passo, é normal observar uma diminuição do tamanho da amostra devido à remoção de restos celulares. PONTO de pausa: Tecido sob decellularization pode ser mantido no tampão de lavagem hipotônica a 4 ° C por 18 h em condições estáticas.
    2. Adicionar 1 mL da solução de tratamento de DNase por bem e incubar as amostras por 3 h a 37 ° C.
    3. Aspirar a solução de tratamento de DNase e lavar as amostras com PBS 1x (1 mL por bem) por 20 min. repetir 3 vezes. Realize uma lavagem final com PBS 1x (1 mL por bem) durante a noite no RT e sacudindo a 60 rpm.
    4. (Ponto de verificação) Após o tratamento de DNase, certifique-se de que as amostras decellularized perderam a consistência de gelatina.
      Nota: Após o tratamento de DNase, retire e adicione 1X PBS suavemente, desde que as amostras podem ser facilmente aprisionadas e anexadas a ponta da pipeta.

4. avaliação da remoção de células do tecido decellularized

  1. Corrigir as amostras em uma placa de cultura de tecido de 24-poço, 1 amostra por alvéolo, adicionando 1 mL de recém-feitos tampão neutro de formalina 10% com eosina aquosa de 0,03% para 2,5-3 h no RT
    Nota: Eosina é adicionada para o fixador para manchar o tecido decellularized e para facilitar a visualização da amostra durante o corte e a coloração histológica. A adição da eosina que nem interfere com as manchas histológicas, nem com as técnicas de imunofluorescência. Alternativamente, a fixação pode ser realizada durante a noite a 4 ° C.
  2. Remover a solução fixador e adicione 1 mL de 1X PBS para lavar a amostra.
  3. Encapsule o bioscaffolds fixo no processamento de histologia gel usando um molde de amostra de vinil descartáveis de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Remova o gel histologia com a amostra incorporada do molde e transferência para fitas de processamento/incorporação de biópsia com tampa.
    Nota: Uma alternativa ao tecido incorporação em histologia e processamento gel é para processar cada amostra em duas esponjas de biópsia com pequenos poros. As amostras devem ser localizadas ao centro das esponjas para habilitar a detecção de biópsia. Digno de nota, algumas amostras podem ser difíceis de localizar usando esta abordagem.
  5. Processar as amostras para parafina incorporação através da incubação do sucessivas (30 min por solução) em série de concentrações de álcool (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solução de Hidrocarboneto alifático ISO-parafínicos (2 estações de incubação) e parafina (incubação 2 estações) a 56 ° C.
  6. Monte as amostras em um bloco de parafina.
  7. Corte 3 seções de parafina μm de espessura em um micrótomo e recolher as seções sobre lâminas de microscópio.
  8. Cortes de parafina secar durante a noite a 37 ° C.
    Nota: Cortes de parafina (pausa ponto) são armazenadas a 4 ° C até utilização posterior.
  9. Para verificar a eficiência do protocolo, execute hematoxilina e eosina (H & E) e Trichrome de Masson coloração (MT) das secções de amostra decellularized e secções de tecido não-manipulada de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: H & E mancha manchas cela núcleos azul/roxo, citoplasma rosa/vermelho escuro e rosa pálido de colágeno e MT manchas núcleos pretos, vermelha, citoplasma e colágeno e mucina azul. Decellularization eficiente é alcançada quando uma luz rosa porosa (H & E, MT) e azul rede (MT) é observada, na ausência de uma mancha nuclear.

5. avaliação da remoção de material nuclear de tecido decellularized

Nota: A quantificação do teor de DNA no tecido decellularized deve ser realizada em comparação com o respectivo tecido não-manipulada.

  1. Antes decellularization, pese um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL em uma balança digital de alta precisão. O tecido cardíaco de transferência para o tubo, remover a quantidade extra de 1X PBS e pesar o tubo com as amostras. Calcule o peso molhado das amostras:
    Peso úmido da amostra = peso tubo com amostras – peso tubo vazio
  2. Decellularize as amostras conforme descrito na etapa 3.
  3. Após decellularization, colete os tecidos decellularized em um tubo de microcentrifugadora.
    1. Devido às pequenas dimensões e massa das amostras cardíacas individuais e as especificações do kit, piscina decellularized tecidos de cada condição de amostra (coração fetal: 5 corações toda; adulto LV explantes: 15 explantes). Execute o mesmo procedimento com o tecido não-manipulado.
      Nota: (Ponto de pausa) as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até a extração de DNA e quantificação são executadas.
  4. Cortar o não-manipulada e decellularized tecidos em pequenas explantes com a ajuda de um bisturi em um tubo de ensaio limpo.
    Nota: Utilize um bisturi individual e placa de Petri para cada amostra. Ruptura mecânica das amostras com um bisturi facilita sua posterior digestão enzimática e posterior extração de DNA.
  5. Para a extração de DNA, use um método de extração de DNA de rotação-coluna com base de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Colete as amostras dissociadas mecanicamente da placa de Petri com o buffer de mestre digestão (digestão buffer e proteinase K) de acordo com as instruções do fabricante usando uma ponta de pipeta de orifício largo.
      Nota: Lise de tecido com Proteinase K digestão é mais rápida em decellularized amostras. Para processar amostras distintas ao mesmo tempo, manter amostras lisadas no gelo, até que todas as amostras lysed para minimizar a degradação. Lise de amostras completa é alcançada entre 4-6 h.
    2. Prossiga com o protocolo de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Para aumentar o rendimento de DNA extraído de amostras de tecido decellularized e não decellularized, Eluir o DNA em 25-50 μL e 100 μL de tampão de eluição, respectivamente. Coletar o DNA eluted e carregar a rotação-coluna. Incube durante 1 min no RT. Centrifugar as amostras de acordo com as instruções do fabricante.
      Nota: (Pausa ponto) o ADN extraído das amostras pode ser loja a-20 ° C até utilização posterior.
  6. Quantificar o DNA extraído de amostras com um kit de deteção fluorescente dsDNA seguindo as instruções do fabricante.
  7. Normalize o conteúdo de DNA como nanogramas de DNA por miligrama de massa úmida da amostra inicial (antes decellularization).

6. célula decellularized andaimes semeadura

Nota: Todas as soluções/reagentes precisam ser esterilizadas e todo o procedimento realizado em condições estéreis.

  1. Preparar 1 x DPBS com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 1% P/S (penicilina, 100 UI; estreptomicina 100 µ g/mL).
  2. Retire a última etapa de lavagem de decellularization (etapa 3.3.3) a 1 x solução de PBS e adicionar 500 μL por poço do recentemente preparada 1 x DPBS/2,5 μg/mL de solução B/1% P/S anfotericina. Armazenar as amostras em 4 ° C, de 1-7 dias.
    Nota: O armazenamento de amostras a 4 ° C é importante para manter a esterilidade.
  3. Adicione P/S a célula basal mídia (sem FBS e suplementos) a uma concentração final de 1%.
  4. Aspire 1 x DPBS/2.5 μg/mL de solução B/1% P/S anfotericina das amostras decellularized. Adicionar 500 μL por poço de célula basal media/1% P/S e deixe amostras equilibrar durante 1 h a 37 ° C, ou a 4 ° C por mais de 1h.
  5. Dividir as células de interesse e preparar pequenas alíquotas de células para a densidade da célula desejada.
    Nota: O tecido decellularized semeadura deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico e em condições estéreis. Meios de cultura de célula deve conter 1% P/S.
  6. Adicionar 3-4 μL de DPBS ao centro de um poço de uma placa de 96 poços. Usando uma pinça fina e reta, transferir os andaimes decellularized para a queda DPBS, remover o DPBS extra por aspiração e certifique-se que a amostra não é dobrada ou amassada. Deixá-lo a tornar-se seca nas bordas para aderir à superfície bem.
    Nota: Andaimes destacados tem baixa eficiência de semeadura.
  7. Adicione células para o cadafalso pipetando a célula única solução lentamente contra as bordas do poço.
    Nota: por exemplo, rato neonatal cardiomyocytes são semeadas com em uma densidade de 7.500 células/mm2 e rato imortalizado Lin− Sca-1+ cardíaca células progenitoras (iCPCSca-1) com uma densidade de 60-1.500 células/mm2. Ajuste a densidade da célula de acordo com a lógica experimental.
  8. Adicione DPBS nos poços vizinhos para evitar a evaporação rápida da mídia.
  9. 24 horas pós semeadura de célula, se o tipo de célula usado aderiu para as placas de poliestireno de cultura de tecidos (PFC), transferência de bioscaffolds para um novo poço. Caso contrário, substitua o meio para remover as células não-aderentes.
  10. Mude-se cuidadosamente os meios de comunicação de acordo com exigências específicas do tipo de célula.

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Representative Results

A eficiência de decellularization deve ser avaliada através de três principais técnicas: observação macroscópica, histologia e quantificação de DNA. A aparência macroscópica de tratamento de amostras post-SDS indiretamente afeta a eficácia da remoção da célula. Após a incubação do SDS, amostras devem aparecer como translúcidas para esbranquiçado (Figura 1). Fetal (E18) decellularized tecidos são caracterizados por uma estrutura altamente translúcida enquanto explantes adultos têm um translúcido de aparência branca. Geralmente, uma aparência mais branca está correlacionada a uma rede de ECM exibindo fibra superior e conteúdo de colágeno, por exemplo, os adultos ventriculares e vasculares vasos ECM malha (Figura 1). Hematoxilina e eosina (H & E) e/ou manchas de (MT) corante tricromo de Masson são realizadas para confirmar a remoção eficiente de célula pela observação de uma malha porosa (rosa claro, H & E; luz rosa e azul, MT) (Figura 1). Além disso, a mancha de MT destaca a malha de colágeno em azul5. Autorização de material nuclear, depois de decellularization é acessado pela quantificação de DNA e uma redução de aproximadamente 99.8% geralmente são obtidos, quando comparados aos tecidos não-manipulada (Figura 1). A presença de material nuclear em andaimes decellularized tem sido descrita como um gatilho de resposta inflamatória indesejável mediante a implantação de14. Por esta razão, a confirmação de decellularization eficiente é essencial antes experimentos de repovoamento de andaime 3D nativo. Decellularized andaimes podem ser armazenados em condições estéreis até a semeadura com as células de interesse. Viabilidade celular é monitorada em toda cultura in vitro de calceína coloração (Figura 2A). Não obstante, mancha de calceína pode ser citotóxica para tipos de células sensíveis. Terminal análise de repovoamento celular e distribuição através de andaimes é realizada pós-parafina processamento; um instantâneo do repovoamento de bioscaffold avaliado por H & E mancha em uma seção central de bioscaffolds é mostrado (Fig. 2B, 2C).

Figure 1
Figura 1. Fetal (E18) e procedimento de decellularization de tecido cardíaco adulto e confirmação da eficiência do decellularization. Visão geral de protocolo (A) . (B) protocolo de Decellularization detalhado. (C) análise macroscópica do tecido cardíaco fetal e adulto, antes e depois decellularization. Barra de escala: 2 mm. (D) quantificação dos materiais nucleares em decellularized contra o tecido não-manipulado. Dados expressados como média ± de t-Student SEM., bicaudal * p < 0,05. (E) H & E e de Masson tricromo análise histológica do tecido cardíaco fetal e adulto, antes e depois decellularization. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Análise de repovoamento de andaimes decellularized semeado com linha de células progenitoras cardíacas Lin - Sca-1+ (iCPCSca-1). (A) viabilidade celular alta observada na superfície de andaimes durante a cultura in vitro pela mancha de calceína (verde). Barra de escala: 100 μm. (B) número do celular e distribuição através de andaimes avaliados através de coloração H & E. Barra de escala: 100 μm. (C) vista ortogonal de células decellularized ECM. Imagem confocal de seção de parafina 50μm espessura. Barra de escala: 10 μm (ortogonal vista XZ, YZ) e 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Passo Observação Possível motivo Problema Solução
3.1.2. Tecido com uma cor acastanhada Cryofixation de amostra; instável temperatura de congelamento Amostra cryofixation levará a remoção ineficiente de proteínas citoplasmáticas Loja tecido congelado durante períodos mais curtos. Verificar a estabilidade e a temperatura do congelador
3.2.4. Rosa-de-branco opacas amostras Solução de SDS não estava bem preparada; explantes de LV adultos muito grande Ineficaz remoção de proteínas citoplasmáticas Certifique-se de dissolução completa do SDS. Decellularize amostras de tamanho menor.
3.3.4. Amostras com uma aparência semelhante a gelatina Remoção de DNA ineficiente Autorização de material nuclear ineficiente Aumente o tempo de concentração e/ou incubação de DNase.
4.6. Compactação de gel de histologia Longo tempo de espera em PBS1X/etanol antes do processamento de parafina Alteração da estrutura do tecido decellularized Comece histológica de processamento o mais rápido possível
6.6. Amostras secas decellularized As amostras foram deixadas para secar por muito tempo Colapso permanente do tecido decellularized. Célula ineficiente semeadura Permitir que as amostras de ligeiramente seco apenas na periferia, a fim de tornar-se ligado ao fundo do poço durante a semeadura
6.7. Destacamento de amostra decellularized durante a semeadura Amostras não foram suficientes secos antes da semeadura Célula ineficiente semeadura Aumentar o tempo de secagem de ECM para permitir melhor aderência antes da semeadura de célula

Tabela 1. Solucionando problemas de tabela para decellularization paralela de fetal (E18) e tecido cardíaco de rato adulto.

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Discussion

A matriz extracelular (ECM) é uma malha altamente dinâmica e complexa de glicoproteínas fibrosas e adesivas, consistindo de um reservatório de inúmeros peptídeos bioativos e fatores de crescimento aprisionados. Como o principal modulador de adesão celular, dinâmica do citoesqueleto, mobilidade/migração, proliferação, diferenciação e apoptose, ECM ativamente regula o comportamento e a função celular. Sabendo que o diferente comportamento celular em culturas 2D e 3D, tem havido esforços para desenvolver modelos de romance organotypic com precisão podem replicar ambientes de tecido natural. Nos últimos anos, decellularization de tecido tem emergido como uma técnica alternativa para a medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Assim, decellularization de tecidos e órgãos é atualmente a ferramenta de escolha para melhor dissecar o tecido-específica microenvironmental parâmetros (bioquímicos, estruturais e mecânicos) e atividade biológica in vitro e in vivo.

Desenvolvemos um protocolo que combina a utilização de um buffer hipotônica com um detergente de propriedades de surfactante aniônico, seguido por uma DNase tratamento5,12,13. O presente protocolo constitui um método simples e reprodutível para executar análise comparativa entre o tecido cardíaco decellularized rato fetal e adulto. Nossa experiência com outros tecidos, ou seja, com amostras de tumor derivados de ressecções cirúrgicas dos pacientes de câncer e o tecido do pulmão do rato, mostra que este protocolo é facilmente adaptável e bem sucedido em outras condições e modelos de12,13. A aplicação do processo de decellularization mesmo em amostras diferentes permite estudos comparativos da ECM composição, propriedades biomecânicas, arquitetura e propriedades moduladora celulares em um contexto 3D.

Um dos desafios mais difíceis de decellularization de tecido é o equilíbrio entre a preservação de malhas de ECM, remoção de células definitivas e biocompatibilidade do tecido. Portanto, várias etapas críticas precisam ser cuidadosamente considerados, tais como o tempo de criopreservação de tecido antes de decellularization, o tamanho do explante correta, o uso de soluções novas e a manipulação do tecido decellularized final. Durante nossos estudos, observamos uma correlação direta entre o tempo de armazenamento longo de tecido criopreservado e o uso de soluções de SDS de longa data com ineficiência de decellularization. Armazenamento a longo prazo tecido leva a restos de processamento ineficaz remoção de conteúdo celular das áreas celulares espessas (sem núcleos) entre a complexa malha de ECM. Um efeito indesejável semelhante é atingido quando muito tempo armazenadas soluções de SDS são utilizadas para decellularization de tecido, provavelmente porque SDS soluções têm uma estabilidade curta devido a alterações de pH, hidrólise e solubilidade reduzida ao longo do tempo15,16 . O uso de explantes do tamanho correto (~1.5 x 1,5 x 1,5 mm) também é essencial para decellularization de tecido adulto bem sucedido, desde grandes ressecções de tecido são mais difíceis de decellularize, exibir os restos celulares aprisionado na superfície e preso entre a densa rede de ECM. Embora este protocolo fornece um método eficiente de decellularization de tecido cardíaco, uma menor fração de explantes adultos pode apresentar restos de células, em particular aqueles de um tamanho maior. A análise histológica destas amostras facilita sua identificação e posterior exclusão do estudo. Em última análise, o protocolo aqui é versátil e facilmente aplicável para amostras distintas com pequenos ajustes para o tamanho do explante tecido, concentração de SDS (0.1-0.2% SDS) ou solução incubação tempo5,12,13 .

A principal limitação do presente método é que a manipulação de amostras de tamanho pequeno, ou seja, batimentos cardíacos fetais murino e coração adulta explants, requer algumas habilidades de manipulação. Na verdade, tecidos decellularized fetais e adultos são estruturas delicadas que podem ser permanentemente deformadas quando secas durante o procedimento ou aprisionado pela ponta da pipeta fina ou durante o tratamento com fórceps5.

A grande novidade do presente protocolo, além do paralelo decellularization de coração de rato fetal e adulto do ventrículo esquerdo explantes para avaliação comparativa da composição de ECM (análises biomecânicas) e função biológica associada, é a sua simples Tradução de diferentes modelos e tecidos5,12,13. A decellularization dos tecidos de distintas idades, aplicando a metodologia padronizada foi descrita apenas sobre o rim de macaco rhesus e as seções transversais de tecidos fetais, Neonatais e adultos, que foram submetidas a um tratamento de SDS 1% para 10 dias6 . Em uma configuração cardíaca, fetal, Neonatais e adultos tecidos têm sido decellularized, apesar dos métodos diferem no grau de mecânico desalojar, concentrações de SDS e tempo de aplicação7,8. Como cada procedimento decellularization afeta o ECM de forma exclusiva, a comparação de decellularized amostras obtidas em protocolos diferentes pode levar a conclusões enganosas. Portanto, aplicar o mesmo procedimento de decellularization através de diferentes amostras permite análise comparativa fiável.

A grande maioria dos tecidos decellularized disponíveis comercialmente deriva de espécimes adultos17. Apesar do crescente reconhecimento para uma habilidade aumentada de microambiente fetal em fornecer sinais pro-regenerativo, em comparação com suas contrapartes adultas, decellularization de tecidos fetais só foi relatado em alguns estudos5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. dinâmica de compreensão ECM durante o processo de envelhecimento será crucial para identificar as características únicas do microambiente pro-regenerativo, que, por sua vez, terá impacto sobre o desenvolvimento de maior eficiência biomimetic-materiais.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores estão em dívida para todos os membros do laboratório de Pinto--Ó para discussão crítica relevante. Este trabalho foi financiado pelo Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) no âmbito do projecto "CARDIOSTEM-engenharia de tecidos cardíacos e terapias baseadas em células-tronco para aplicações cardiovasculares" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. é um destinatário de uma bolsa da FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. é um companheiro da FCT (FCT-investigador 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

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References

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Bioengenharia edição 145 Decellularization matriz extracelular andaimes 3D coração fetal coração adulta engenharia de tecido cardíaco

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro
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Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

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