生体外研究における 3 D のようなプラットフォームとして胎児と成人の心筋組織を外植体の対等な Decellularization
Summary
心臓の細胞外マトリックス (ECM) は、人生を通して生理学的な改造に耐えながら組織や臓器における主要なプロセスを調整する分子の複雑なネットワークです。胎児と大人の心の標準化された decellularization 3 D コンテキスト ネイティブ アーキテクチャと力学的特性をキャプチャすることにより両方の組織の比較実験が可能です。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) の現在のナレッジ-携帯通信は表面コーティングとして ECM コンポーネントを提示する、大規模な二次元 (2 D) 体外培養研究に変換します。これらの文化のシステムは、組織の生化学的組成、構造、および機械的性質を包含する ECM の複雑な性質の単純化を構成します。良い心臓の微小環境を形成 ECM 携帯通信をエミュレートする、我々 は全体胎児心臓の decellularization を可能にするプロトコルを開発した、大人の左心室の組織は同時に比較研究外植片します。プロトコルは、専門的なスキルや機器、洗剤は陰イオン界面活性剤と DNase 処理を必要とせず、低張バッファーの使用を組み合わせたものです。様々 な年齢の被験者から組織サンプルの間で同じ decellularization 戦略の応用は、比較研究を実行する別の方法です。この議定書は、胎児と成人心臓 ECM メッシュと生物細胞応答の間でユニークな構造的な違いの識別を許します。さらに、本方法論が人間の腸生検のマウス肺のなど他の組織のマイナーな調整と種正常に適用されて広範なアプリケーションを示します。
Introduction
細胞外マトリックス (ECM) は、すなわち運命決定、増殖と分化の1,2の重要な細胞プロセスを調整する分子の動的ネットワークです。細胞外マトリクスの相互作用の調査を行った二次元 (2 D) ECM 成分でコーティングされた生体外の文化で、主に生体内で検出されたネイティブの ECM プロパティの単純化を構成します。Decellularization は、主細胞アーキテクチャとネイティブの組織と臓器3,4の構成を保持する無細胞の 3 D のような ECM bioscaffolds を生成します。組織工学用生理活性足場として機能に加えて、3 D ECM 生体材料の脱は並列体内環境セル ECM 生物学を評価する新しいプラットフォームとして新たな。
明確な組織・器官・年齢の ECM 成分の差分の役割の評価でお越しの際にもネイティブの bioscaffolds を生成するのと同様のプロトコルを用いる。中心部に臓器微小環境の比較研究を実行する別の方法として胎児と大人由来サンプルの decellularization のための汎用プロトコルを開発した我々。この方法論を使用して、我々 はネイティブ心臓微小環境をキャプチャし、胎児の ECM が歩留まり心筋細胞5の再作成を促進することを示した。Decellularization はさらに地下板と細胞性のマトリックス メッシュ配置のレベルで胎児と成人の ECM と繊維組成5居住構造差の識別を提供しました。この作品の前に同じ decellularization アプローチを使用してさまざまな個体発生段階での組織の頭に頭の比較は、アカゲザルの腎臓および齧歯動物の心の報告されています。また、研究の限られた数は、胎児の組織・臓器 decellularization自体5,6,7を報告します。これは、ユニークな decellularization エージェントとして SDS を使用して達成されています。ただし、個別の SDS の濃度は胎児と成人の心臓組織7,8decellularization の使用されました。SDS は細胞質と核物質のクリアランスのための最も効果的な界面活性剤の一つと広く異なる組織と標本9,10の decellularization で。タンパク質変性、グリコサミノグリカン (Gag) の損失とコラーゲン線維の10、11の中断に関連したソリューション高 SDS 濃度と曝露の長期間を含むため、ECM の保全と細胞の除去のバランスが必要です。胎児と成人の心臓組織に、同じ手順を適用する記載プロトコルは 3 つの連続したステップに分けられる: 高浸透圧刺激 (低張バッファー) を用いた細胞の換散脂質タンパク質、DNA 蛋白質および蛋白質蛋白質の相互作用 (0.2 %sds); の可溶化・原子力材料除去 (DNase 処理)。
我々 のプロトコルは、いくつかの利点を示しています: 私) 同じ decellularization 戦略のアプリケーションによる年齢固有心筋組織の等価 decellularization の可能性特殊な方法または装置; ii) の要件iii) 人間の腸生検12マウス肺13; のマイナーな変化と正常が適用されて、他の組織および種への適応を準備します。重要なは、iv) 3 D のような切片文化詳細は密接にネイティブの組織微小環境の分子の機能を模倣のアセンブリを可能にしながら ECM の力学的特性に対応できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞外マトリックス (ECM) は多数の生理活性ペプチドと成長因子の内包された貯留層から成る繊維と接着剤の糖蛋白質の非常に動的かつ複雑な網目です。細胞接着、細胞骨格のダイナミクス、運動/移行、増殖、分化、アポトーシスの重要な変調器として ECM は積極的に細胞機能および行動を調整します。2 D と 3 D の文化で細胞挙動が異なることを知ること、自然な組織環境を正確に複製するこ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ピントは Ó 研究室関連の重要な議論のためのすべてのメンバーにお世話になった。この作業はプログラム MIT カルースト パラ Ciência 電子技術 (FCT) プロジェクト「CARDIOSTEM 設計された心臓ティッシュと心血管用幹細胞ベースの治療」の下で支えられた (MITP-TB/ECE/0013/2013)。A.C.S. FCT フェローシップ [SFRH/BD/88780/2012] の受信者であるし、M.J.O. は FCT 仲間 (FCT 捜査官 2012 年)。
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
References
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