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Summary
심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.
Abstract
세포 외 기질 (ECM)의 현재 정보-셀 통신 변환 큰 2 차원 (2D) 생체 외에서 문화 연구 ECM 구성 요소 표면 코팅으로 표시 됩니다. 이러한 문화 시스템 구성 조직 구조, 생 화 확 적인 구성과 기계적 특성을 포함 하는 ECM의 복잡 한 자연의 단순화. 더 나은 심장 microenvironment를 형성 하는 ECM 셀 통신 에뮬레이션, 우리 전체 태아 심장의 decellularization에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 하 고 성인 좌 심 실 조직 explants 비교 연구에 대 한 동시에. 프로토콜 전문된 기술 이나 장비에 대 한 소형 버퍼, 음이온 계면 활성 제 속성, 그리고 어떤 요구 사항 없이 DNase 처리의 세제를 사용 하 여를 결합합니다. 다양 한 나이의 과목에서 조직 샘플에서 동일한 decellularization 전략의 응용 프로그램은 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 이다. 현재 의정서 태아 및 성인 심장 ECM 메쉬 및 생물 세포 응답에 걸쳐 독특한 구조 차이 식별을 허용 한다. 또한,는 여기 방법론 성공적으로 적용 되 다른 조직 및 사소한 조정 종에와 같은 인간의 내장 biopsies을 마우스 폐에 광범위 한 응용 프로그램을 보여 줍니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 중요 한 세포질 과정, 즉 운명 결정, 확산 및 감 별 법1,2를 조절 하는 분자의 동적 네트워크입니다. 세포-ECM 상호 작용의 조사는 비보에네이티브 ECM 속성의 단순화 구성 2 차원 (2D) ECM 구성 요소와 코팅 생체 외 문화에서에서 주로 수행 되었습니다. Decellularization 세포 외 건축과 네이티브 조직 및 장기3,4의 크게 보존 acellular 3D 같은 ECM bioscaffolds를 생성 합니다. 조직 공학에 대 한 생리 활성 공중 발판으로 봉사 이외에 decellularized 3D ECM 생체는 그 병렬 vivo에서 환경 생물학 세포-ECM을 평가 하기 위해 새로운 플랫폼으로 등장 하고있다.
뚜렷한 조직, 기관 및 나이의 ECM 구성 요소의 차동 역할의 평가 네이티브 bioscaffolds 생성의 유사한 프로토콜의 사용으로 도움이 됩니다. 마음에 우리 기관 microenvironment의 비교 연구를 수행 하는 대체 접근 방식으로 태아와 성인 파생 된 샘플의 decellularization에 대 한 다양 한 프로토콜을 개발 했습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 우리는 네이티브 심장 microenvironment를 점령 하 고 태아 ECM 심장 세포5의 더 높은 repopulation 수익률을 촉진 했다. Decellularization는 더 거주 구조와의 차이점 지하실 lamina 및 pericellular 매트릭스 메쉬 배열 수준에서 태아 및 성인 ECM 섬유 구성5식별 제공. 이 작품 전에 동일한 decellularization 접근을 사용 하 여 다른 ontogenic 단계에서 조직의 머리 비교만 붉은 털 원숭이 신장 및 설치류 마음 보고 되었습니다. 또한, 제한 된 수의 연구 보고서 태아 조직/기관 decellularization se 당5,,67. 이 독특한 decellularization 에이전트로; SDS를 사용 하 여 달성 되었습니다. 그러나, 뚜렷한 SDS 농도 태아와 성인 심장 조직7,8decellularization 위해 사용 되었다. SDS 세포질 및 핵 자료의 정리에 대 한 가장 효과적인 이온 세제 중 하나 이며 다른 조직 및 표본9,10decellularization에서 널리 이용 된다. 높은 SDS 농도 노출의 연장된 기간을 포함 하는 솔루션은 단백질 변성, glycosaminoglycan (개 그) 감소와 콜라겐 소10,11의 상관 되었다 있다 따라서는 ECM 보존 및 셀 제거 사이의 균형은 필요 합니다. 태아 및 성인 심장 조직에 동일한 절차를 적용 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 3 순차적 단계에서 나누어져: 삼투성 충격 (소형 버퍼); 세포를 세포 지질 단백질, DNA-단백질 및 단백질 단백질 상호 작용 (0.2 %SDS);의 가용 화 그리고 핵 재료 제거 (DNase 치료)입니다.
우리의 프로토콜 몇 가지 장점을 보여줍니다: 내가) 나이 특정 심장 조직의 동일한 decellularization 전략; 응용 프로그램에 의해 동등한 decellularization의 가능성 특수 방법이 나 장비에 대 한 ii) 요구 사항 iii)로 인간의 내장 biopsies12 와 마우스 폐13;에서 사소한 변경으로 성공적으로 적용 된 다른 조직 및 종 적응 준비 그리고, 중요 한 것은, iv) 더 밀접 하 게 기본 조직 microenvironment의 분자 기능을 모방 하는 3D와 같은 organotypic 문화의 어셈블리를 사용 하는 동안 ECM biomechanical 속성을 해결할 수 있습니다.
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Protocol
I3S 동물 윤리 위원회 및 Direção Geral 드에 의해 설명 하는 모든 방법론 승인 했다 Veterinária (DGAV)와 따라 유럽 의회 지침 2010/63/유럽 연합.
1입니다. decellularization 솔루션의 준비
참고: 모든 decellularization 솔루션 0.22 μ m 멤브레인 필터를 통해 필터링 해야 하 고 제외 하 고 3 개월의 최대 저장 지정 그렇지 않으면.
- 1 x pbs: NaCl, 나2HPO4 KCl, 200 밀리 그램의 1.01 g 8 g을 혼합 및 이온된 물 (디)의 900 mL와 함께 KH2포4 의 200 밀리 그램. 1 나 필터, 압력솥, 그리고 게 실 온 (RT)에서 솔루션에 최대 해결책 pH 7.5 및 최종 솔루션 볼륨을 조정 합니다.
- 소형 버퍼 (10 mM Tris, 0.1 %EDTA)에 대 한: 1.21 g의 TrisBASE와 이온된 물 900 mL에 EDTA의 1 g을 분해. 솔루션에 pH 7.8 NaOH/HCl와를 및 1 나 필터를 최종 솔루션 볼륨 조정, 압력솥에 의해 소독 하 고 실시간 저장
- 0.2 %SDS 솔루션 (0.2 %SDS, 10 mM Tris): 디 물 400 mL에 0.6 g의 TrisBASE와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 1 g을 추가 하 고 60 ° C에서 완전 한 용 질 해산 때까지 저 어. 솔루션 실시간 조정 솔루션 pH 7.8 하 고 최종 솔루션 볼륨 500 mL을 진정 하자. 여과 하 여 솔루션을 소독.
참고: SDS 솔루션 사용 하기 전에 준비 되어야 한다. 필터 솔루션만 후 SDS 해산 완료, 그렇지 않으면 SDS 불용 성 입자 필터, 최종 SDS 농도 변경 하 고 따라서 조직 decellularization 효율성에 영향을 미치는 포화 됩니다. - 침투성 워시 버퍼 (10 mM Tris): 믹스 디 900 mL에 TrisBASE의 1.21 g 물. 솔루션에 pH 7.8 및 1 나 필터를 최종 볼륨 조정, 오토 클레이 브에서 소독 하 고 실시간 저장
- DNase 치료 (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): 2.42 g TrisBASE의와 디 물 900 mL에 1 M MgCl2 의 2 개 mL를 분해. 7.8 pH와 최종 솔루션 볼륨 1 나 필터를 조정 하 고 압력솥에 의해 솔루션을 소독. 실시간 추가 DNase에서 솔루션을 저장 나 (50 U/mL)을 사용 하기 전에.
- DNase 대 나 재고 솔루션: 50% 글리세롤, 20 mM Tris HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2를 포함 하는 DNase 버퍼를 준비 하 고 디 물 10 mL의 최종 솔루션 볼륨 조정. 층 류 두건에서 DNase 버퍼에 파우더와 섞어 부드럽게 완전 한 해체까지 DNase를 추가 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 소독. 1 mL aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장
2. 조직의 채취 및 cryopreservation
- CO2 질을 통해 임신 (E18 태아)의 18 일 성인 임신 여성을 안락사. 수술 시저와 함께 여성에 제왕 섹션을 수행 하 고 곡선된 팁 (경적 양끝을 한 트위터)와 두 개의 톱니 모양의 핀셋을 사용 하 여 차가운 1 x PBS와 페 트리 접시에 태아 쥐 베어링 자 궁 뿔을 수집 합니다.
- 자 궁 뿔 및 분리는 태아를 양수 sac를 엽니다. 그들을 anesthetize 하는 시저와 함께 목을 벨 얼음 1 x PBS 가진 새로운 배양 접시에는 태아를 전송.
- 7-8 주 오래 된 남성 C57BL/6 마우스 사용 하 여 CO2 질 안락사 각 마우스 가슴에 절 개를 수행 하 고 마음을 수집 합니다.
- 짧게 씻어 얼음 감기 1 x PBS 가진 태아 및 성인 마음.
- 메스의 도움으로 성인 심장의 심 방 제거 합니다. 우 심 실에 절 개를 수행 하 고 바로 작은 위를 사용 하 여 그것을 제거. 심장 제거 하 여 좌 심 실 내부 벽을 노출 합니다. 새로운 페 트리 접시에 2 m m 두께와 좌 심 실 무료-벽에 경도 스트립을 분할 하 고 젖꼭지 근육 곡선 팁 메스와 톱니 모양의 핀셋을 사용 하 여 제거.
- 소비 세 작은 조직 explants 2mm x 2mm 눈금 (자세한 설명 보충 그림 15에)를 사용 하 여 메스의 도움으로. 간단히 1 x PBS 가진 조직 explants 린스.
- 압력가 1.5 mL microcentrifuge 튜브 복합 최적의 절삭 온도 (10 월)의 ~ 250 µ L를 추가 합니다. 10 월의 250 µ L 튜브를 전체 태아 심 혼 그리고 성인 심장 explants 전송 및 드라이 아이스 냉각 isopentane 그리고-80 ° C (최대 6 개월)에 게 그들을 동결.
참고: 심장 조직 explants 6 개월 이상 cryopreserved를 사용 하 여 decellularization 효율성, 특히 성인 심장 조직 explants 줄일 것 이다.
3. 조직 decellularization
참고: 심장 조직 decellularization 잘 당 하나의 샘플 24-잘 조직 배양 접시에서 수행 됩니다. 각 decellularization 솔루션의 1 mL는 잘 각 개인에 추가 됩니다. 그렇지 않으면 지정 하지 않으면 모든 decellularization 단계 165 rpm (20 m m의 궤도 직경 인큐베이터 통)와 25 ° C에서 동요와 함께 수행 되어야 한다. 자세한 내용은 그림 1A에 구성표를 참조 하십시오. 암포 B (예: fungizone) 및 gentamicin은 갓에 추가 2.5 μ g/mL, 0.01 μ g/mL의 최종 농도를 사용 하기 전에 모든 decellularization 솔루션 각각. Decellularized 조직, decellularization 프로토콜을 시작 하기 전에 결정 될 샘플 대량 요구 내에서 유지 하는 DNA의 양을 계량 하. DNA 정량화 프로토콜 추가에 대 한 자세한 섹션 5.1입니다.
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제 1 일
- -80 ° C 냉장고에서 조직 샘플을 제거 합니다. 유지 1.5 mL 튜브 microcentrifuge RT 10 월 되 면 부분적으로 녹을 때까지 합니다. 1 x PBS와 페 트리 접시에 여전히 냉동의 심장 조직 블록을 전송 합니다.
- OCT 녹아 심장 조직 1 x PBS 가진 새로운 배양 접시에 이동. 워시 샘플 60 rpm 10-15 분에 대 한 셰이 커와에서 PBS x 1에 두 번 이상 반복합니다.
- 살 균 24-잘 조직 배양 플레이트의 당 소형 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 집게의 도움으로 잘 당 하나의 샘플을 전송 합니다.
- 25 ° C에서 인큐베이터 셰이 커를 예제와 함께 24-잘 조직 배양 플레이트를 이동 하 고 소형 버퍼 18 h 부 화를 시작.
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제 2 일
- 1.3 섹션에 설명 된 대로 0.2 %SDS 솔루션을 준비 합니다.
- 소형 버퍼를 발음 하 고 1 x PBS와 샘플 1 h. 반복 3 번 세척.
참고: 일시 중지 포인트: decellularization에서 조직 18 h 정적 조건에서 4 ° C에서 1 x PBS에 보관 하실 수 있습니다. - 1 x PBS를 제거, 잘 당 갓 만든된 SDS 솔루션 (1.3 단계)의 1 mL을 추가 하 고 24 시간에 대 한 샘플을 품 어.
참고: (체크 포인트) 게시물 SDS 인큐베이션 샘플 반투명 외관 백색 전시를 확인. 이 단계에서 SDS 처리 샘플 젤라틴 모양의 일관성을 보여주는 DNA에 젖어 있다. 피 펫 팁을 샘플 접착 하지 않으려면 천천히 SDS 솔루션을 제거 합니다.
-
제 3 일
- 20 분 반복 3 번 소형 워시 버퍼 (우물 당 1 mL) 샘플을 씻으십시오.
참고:이 단계에서 그것은 정상 세포 잔재의 제거로 인해 샘플 크기 감소를 관찰 하는 것. 일시 중지 포인트: 조직 decellularization에서 보관할 수 있습니다 소형 워시 버퍼에 18 h 정적 조건에서 4 ° C에서. - 잘 당 DNase 치료 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 품 어
- DNase 치료 솔루션을 발음 하 고 20 분 반복 3 번에 대 한 샘플 1 x PBS (우물 당 1 mL)을 씻어. RT와 60 rpm에서 떨고 하룻밤 1 x PBS (우물 당 1 mL)으로 최종 세척을 수행 합니다.
- (체크 포인트) DNase 치료 후 decellularized 샘플 젤라틴 모양의 일관성을 잃 었 확인 합니다.
참고: DNase 치료 후 제거 하 고 추가 1 x PBS 부드럽게 샘플을 쉽게 침투 하 고 피 펫 팁에 연결 된 수 있습니다.
- 20 분 반복 3 번 소형 워시 버퍼 (우물 당 1 mL) 샘플을 씻으십시오.
4입니다. decellularized 조직 세포 제거의 평가
- 실시간에 2.5-3 h에 대 한 0.03% 수성 오신와 갓 만든된 10% 포 르 말린 중립 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 24-잘 조직 문화 접시, 잘, 당 1 샘플에에서는 샘플 수정
참고: 오신 decellularized 조직 얼룩을 단면화 및 조직학 얼룩 동안 샘플 시각화를 쉽게 정착 액에 추가 됩니다. 어느 방해 조직학 얼룩도 면역 형광 검사 기술로 오신의 추가. 또는, 고정에서 수행할 수 있습니다 하룻밤 4 ° c. - 통 솔루션을 제거 하 고 씻어 샘플 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 일회용 비닐 견본 몰드를 사용 하 여 조직학 처리 젤에 고정 된 bioscaffolds를 캡슐화 합니다.
- 뚜껑 생 처리/포함 카세트 형 및 전송에서 포함 된 샘플 조직학 젤을 제거 합니다.
참고: 조직 조직학에서 포함 및 젤 처리 대신 작은 구멍으로 두 생 스폰지에 각 샘플을 처리 하는. 샘플 검색 사용 하려면 생 스폰지의 중심을 지역화 해야 합니다. 메모의 일부 샘플이이 접근을 사용 하 여 지역화 하려면 어려울 수 있습니다. - Isoparaffinic 지방 족 탄화수소 솔루션 (2 화 역) (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), 알코올 농도의 시리즈에 연속 외피 솔루션 마다 (30 분)를 통해 포함 하는 파라핀 파라핀 (2 부 화에 대 한 샘플 처리 56 ° c.에 역)
- 파라핀 블록에 샘플을 탑재 합니다.
- 톰에 3 μ m 두께 파라핀 섹션을 잘라 고 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 수집 합니다.
- 건조 파라핀 섹션 37 ° c.에서 하룻밤
참고: (일시 중지 포인트) 파라핀 섹션 추가 사용 때까지 4 ° C에 저장 됩니다. - 프로토콜의 효율성을 확인 하려면 Hematoxilin 및 오신 (H & E) 및 decellularized 샘플 섹션 및 섹션 제조업체의 지침에 따라 조직의 비 조작 (MT) 얼룩 Masson의 Trichrome 수행 합니다.
참고: h 조 & 전자 얼룩 얼룩 세포 핵 파란색/보라색, 세포질 진한 핑크/레드 고 콜라겐 창백한 핑크와 MT 얼룩 핵 검은색, 빨간색, 세포질 및 콜라겐과 mucin 블루. 효율적인 decellularization 때 다공성 빛 핑크 (H & E, 몬태나) 달성 하 고 블루 (MT) 네트워크는 핵 얼룩의 부재에서 관찰.
5. decellularized 조직 핵 재료 제거의 평가
참고: decellularized 조직에서 DNA 콘텐츠의 정량화는 각각 조작 되지 않은 조직에 비해 수행 되어야 합니다.
- Decellularization, 전에 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 고정밀 디지털 규모에 무게. 튜브를 심장 조직 전송, 1 x PBS의 추가 금액을 제거 하 고 무게는 샘플 튜브. 샘플의 젖은 무게를 계산.
젖은 무게 샘플 무게 샘플 튜브 -무게 빈 관 = - 3 단계에에서 설명 된 대로 샘플을 decellularize.
- 후에 decellularization, decellularized 조직 microcentrifuge 튜브에 수집 합니다.
- 작은 크기와 개별 심장 샘플 및 키트 사양의 질량, 수영장의 각 샘플 상태 decellularized 조직 (태아 심장: 5 전체 마음; 성인 LV explants: 15 explants). 조작 아닌 조직으로 동일한 절차를 수행 합니다.
참고: (일시 중지 포인트) 샘플 수 DNA 추출 및 정량화는 수행 될 때까지-20 ° C에 저장.
- 작은 크기와 개별 심장 샘플 및 키트 사양의 질량, 수영장의 각 샘플 상태 decellularized 조직 (태아 심장: 5 전체 마음; 성인 LV explants: 15 explants). 조작 아닌 조직으로 동일한 절차를 수행 합니다.
- 비 조작 잘라내어 깨끗 한 페 트리 접시에 메스의 도움으로 작은 explants에서 조직 decellularized.
참고: 각 샘플에 대 한 개별 메스와 페 트리 접시를 사용 합니다. 메스와 샘플의 기계적 장애 그들의 후부 효소 소화 및 후속 DNA 추출 용이. - DNA 추출에 대 한 제조업체의 지침에 따라 스핀-열 기반 DNA 추출 메서드를 사용 합니다.
- 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 마스터 소화 버퍼 (소화 버퍼 및 가수분해 K) 페 트리 접시에서 기계적으로 천연된 샘플을 수집 합니다.
참고: 조직 세포 성분을 K 소화는 빨리 decellularized 샘플 에입니다. 동시에 다른 샘플을 처리, 모든 샘플은 성능 저하를 최소화 하기 위해 lysed 때까지 얼음에 lysed 샘플을 유지 합니다. 완전 한 샘플 세포 4-6 h 사이 이루어집니다. - 제조업체 지침에 따라 프로토콜 진행.
- Decellularized 및 decellularized 비 조직 샘플의 추출 된 DNA의 수율을 높이기 위해 25-50 μ 및 차입 버퍼의 100 μ에 DNA를 각각 elute. Eluted DNA를 수집 하 고 스핀 열 로드. 실시간 원심 분리기에서 1 분에 대 한 제조업체의 지침에 따라 샘플을 품 어.
참고: (일시 중지 포인트)는 DNA 샘플에서 추출 된 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
- 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 마스터 소화 버퍼 (소화 버퍼 및 가수분해 K) 페 트리 접시에서 기계적으로 천연된 샘플을 수집 합니다.
- 형광 성 dsDNA 탐지 키트 제조업체의 지침에 따라 샘플에서 추출 된 DNA를 계량.
- (Decellularization) 전에 초기 샘플 젖은 무게의 밀리 그램 당 nanograms의 DNA로 DNA 콘텐츠를 정상화.
6. decellularized 건설 기계 셀 시드
참고: 모든 솔루션/시 약 수 살 균 하 고 메 마른 조건에서 수행 하는 전체 절차.
- 암포 B와 1%의 2.5 μ g/mL로 1 x DPBS 준비 P/S (페니실린, 100 I.U.; 스 100 µ g/mL).
- 마지막 decellularization 세척 단계 (단계 3.3.3)에서 PBS 솔루션 x 1을 제거 하 고 암포 B/1% P/S 솔루션의 DPBS/2.5 μ g/mL x 갓된 1의 당 500 μ를 추가 합니다. 1-7 일에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
참고: 4 ° C에서 샘플 저장소는 불 임을 유지 해야 합니다. - P/S (FBS 보충 없이) 기저 미디어 1%의 최종 농도를 셀에 추가 합니다.
- Decellularized 샘플에서 암포 B/1% P/S 솔루션의 DPBS/2.5 μ g/mL x 1 발음 세포 기저 media/1% P/S의 당 500 μ를 추가 하 고 1 시간 또는 1 시간 이상 4 ° C에서 37 ° C에서 equilibrate 샘플을 보자.
- 관심의 셀 분할 및 원하는 셀 밀도에 셀의 작은 aliquots를 준비.
참고: decellularized 조직 시드 수행 되어야 합니다 입체 현미경 및 메 마른 조건에서. 세포 배양 1%를 포함 한다 P/s. - 3-4 μ DPBS 96 잘 접시의 우물의 센터의 플라스틱 얇고 직선 핀셋을 사용 하 여, decellularized 건설 기계 DPBS 드롭 전송, 포부, 여분의 DPBS 제거 및 샘플 접히거나 주름이 되지 있는지 확인. 그것은 잘 표면에 가장자리에 건조 될 하자.
참고: 분리 된 건설 기계 낮은 시드 효율이 있다. - 천천히 잘의 가장자리에 대 한 단일 셀 솔루션 pipetting으로 발판에 셀을 추가 합니다.
참고: 예를 들어 신생아 쥐 cardiomyocytes는 시드와 7500 셀/m m2 와 불멸 하 게 마우스의 밀도 60-1500 셀/m m2의 조밀도에 린− Sca-1+ 심장 조상 세포 (iCPCSca 1). 실험적 근거를 따라 셀 밀도 조정 합니다. - 빠른 미디어 증발을 피하기 위해 이웃 우물에 DPBS를 추가 합니다.
- 24 시간 사용 하는 셀 형식을 새로운 잘 bioscaffolds 옮겨 조직 문화 폴리스 티 렌 플레이트 (TCPS)을 셀 시드, 게시할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 비 부착 한 세포를 제거 하는 매체를 교체 합니다.
- 세포 종류의 특정 요구에 따라 미디어를 신중 하 게 변경 합니다.
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Representative Results
세 가지 주요 기술을 통해 decellularization 효율성을 평가 합니다: 거시적인 관찰, 조직학 및 DNA 정량화. 샘플 게시물 SDS 처리의 거시적인 모양 세포 제거의 효능 직접적으로 영향을. SDS 인큐베이션, 샘플에 약간 (그림 1C) 흰 반투명으로 표시 됩니다. 태아 (E18) 성인 explants는 반투명 흰색 외관을 하는 동안 decellularized 조직 높은 반투명 구조 특징 이다. 하얀 외관 ECM 네트워크 높은 섬유와 콜라겐 콘텐츠, 예를 들면 성인 심 실 및 혈관 혈관 ECM 메쉬 전시 (그림 1C)에 일반적으로 상관 된다. 되며 & 오신 (H & E) 또는 Masson의 Trichrome (MT) 얼룩 다공성 메쉬 (밝은 분홍색, H & E; 빛 핑크와 블루, MT)의 관찰에 의해 효율적인 세포 제거 확인 수행 됩니다 (그림 1C). 또한, 산 얼룩 블루5콜라겐 채널을 강조 표시합니다. Decellularization DNA 정량화 하 여 액세스 한 후 핵 자료의 정리 및 약 99.8%의 감소는 일반적으로 획득, 조작 비 조직 (그림 1C)에 비해 이식14시 원치 않는 염증 반응의 방 아 쇠 decellularized 건설 기계에 핵 물질의 존재를 설명 하고있다. 이러한 이유로, 효율적인 decellularization의 확인은 네이티브 3D 비 계 repopulation 실험 전에 필수적입니다. Decellularized 건설 기계는 관심사의 세포와 시드까지 메 마른 조건에 저장할 수 있습니다. 세포 생존 능력은 calcein 얼룩 (그림 2A)에 의해 생체 외에서 문화를 통해 모니터링 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, calcein 얼룩 민감한 세포 유형 세포 독성 하실 수 있습니다. 셀 repopulation와 건설 기계 분포의 터미널 분석은 수행된 후 파라핀 처리; H & E bioscaffolds의 중앙 부분에 얼룩이 평가 bioscaffold repopulation의 스냅숏 (그림 2B, 2c) 표시 됩니다.
그림 1입니다. 태아 (E18)와 성인 심장 조직 decellularization 절차 및 decellularization 효율성 확인. (A) 프로토콜 개요입니다. (B) Decellularization 프로토콜 상세입니다. (C) 심장 태아 및 성인 조직 decellularization 전후 거시적인 분석. 눈금 막대: 2. (D) 에서 핵 물질의 정량화 조작 비 조직 대 decellularized. 데이터 표현 ± SEM. 스튜던트 t-검정, 양측을 의미 * p < 0.05. (E) H & E와 Masson의 Trichrome 조직학 분석 심장 태아 및 성인 조직 decellularization 전후. 눈금 막대: 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 린-Sca-1+ 심장 조상 셀 라인 (iCPCSca 1) 시드 decellularized 장비의 repopulation 분석. (A) calcein 얼룩 (녹색)에 의해 생체 외에서 문화 중 건설 기계 표면에서 관찰 하는 높은 세포 생존 능력. 눈금 막대: 100 μ m. ((B)) 셀 숫자와 분포 H & E 염색을 통해 평가 하는 건설 기계. 눈금 막대: 100 μ m. (C) decellularized ECM에 포함 된 셀의 직교 보기. 50 μ m 두께 파라핀 섹션의 공초점 이미지입니다. 눈금 막대: 10 μ m (직교 보기 XZ, YZ) 및 40 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 관찰 | 가능한 이유 | 문제 | 솔루션 |
| 3.1.2입니다. | 갈색 색상으로 조직 | 샘플 cryofixation; 불안정 한 냉동 온도 | 샘플 cryofixation 세포질 단백질의 비효율적인 제거도 이어질 것입니다. | 짧은 기간 동안 냉동된 조직을 저장 합니다. 냉동 실 온도 및 안정성 확인 |
| 3.2.4입니다. | 핑크 백색 불투명 샘플 | SDS 솔루션은 잘 준비; 너무 큰 성인 LV explants | 세포질 단백질의 효과 없는 제거 | 완전 한 SDS 해체를 확인 합니다. 작은 크기의 샘플 decellularize |
| 3.3.4입니다. | 젤라틴 모양의 외관으로 샘플 | 비효율적인 DNA 제거 | 비효율적인 핵 재료 정리 | DNase 농도 및 부 화 시간 증가. |
| 4.6입니다. | 조직학 젤 압축 | 파라핀 처리 하기 전에 PBS1X/에탄올에 긴 대기 시간 | Decellularized 조직 구조의 변경 | 조직학 최대한 빨리 처리 시작 |
| 6.6입니다. | Decellularized 샘플을 건조 | 샘플 너무 오랫동안 건조 남았다 | Decellularized 조직의 영구 붕괴입니다. 비효율적인 셀 시드 | 샘플을 허용 부착 되 고 우물의 바닥에 시드 중 위해 주변에만 약간 건조 |
| 6.7입니다. | 시드 중 decellularized 샘플 분리 | 샘플은 충분 한 시드 전에 건조 | 비효율적인 셀 시드 | ECM 셀 시드 전에 더 나은 부착을 허용을 건조 시간을 증가 |
표 1. 테이블 병렬 decellularization 태아 (E18) 및 성인 마우스 심장 조직에 대 한 문제 해결.
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Discussion
세포 외 기질 (ECM) 수많은 생리 활성 펩 티 드 및 성장 요인 내포의 저수지로 구성 된 섬유와 접착제 glycoproteins의 매우 역동적이 고 복잡 한 채널 이다. 세포 접착, 골격 역학, 운동 성/마이그레이션, 확산, 감 별 법, apoptosis의 주요 변조기로 ECM 적극적으로 세포 기능 및 행동을 통제 한다. 세포질 행동 2D와 3D 문화에서 차이가 알면, 있었다 정확 하 게 자연 조직 환경을 복제할 수 소설 organotypic 모델을 개발 하는 노력. 마지막 년에서 조직 decellularization 조직 공학 및 재생 의학에 대 한 대체 방법으로 떠오르고 있다. 따라서, 조직 및 기관 decellularization은 현재 더 나은 조직 관련 microenvironmental 매개 변수 (생화학, 구조 및 기계)을 해 부를 선택의 도구와 생물 학적 활동 생체 외에서 그리고 vivo에서.
우리는 음이온 계면 활성 제 속성 DNase 치료5,,1213다음 세제로 소형 버퍼의 사용을 결합 하는 프로토콜을 개발. 현재 프로토콜 decellularized 태아 및 성인 마우스 심장 조직 간의 비교 분석을 수행 하는 간단 하 고 재현성 방법을 구성 합니다. 우리의 경험과 다른 조직, 즉 종양 샘플 암 환자의 외과 절제술 및 마우스 폐 조직에서 파생 된이 프로토콜은 쉽게 적응 하 고 다른 조건에서 성공적인 모델12,13보여줍니다. 다른 샘플에 동일한 decellularization 절차의 응용 프로그램 3D 컨텍스트에서 ECM 구성, biomechanical 속성, 건축과 셀룰러 modulatory 속성의 비교 연구를 수 있습니다.
조직 decellularization의 가장 어려운 문제 중 하나는 크게 세포 제거, ECM 채널 보존 및 생체 적합성 조직 사이의 균형 이다. 따라서, 몇 가지 중요 한 단계는 decellularization, 올바른 explant 크기, 신선한 솔루션의 사용 및 최종 decellularized 조직의 조작 하기 전에 조직 cryopreservation 시간 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 우리의 연구 기간 동안 decellularization 비 효율으로 cryopreserved 직물의 긴 저장 시간과 오랜 SDS 솔루션 사용 사이의 직접적인 상관 관계를 관찰합니다. 장기 조직 저장 영역의 두꺼운 세포 (핵) 없이 복잡 한 ECM 채널 중 비효율적인 셀룰러 콘텐츠 제거 렌더링 나머지 이끌어 낸다. 오래 저장 된 SDS 솔루션 조직 decellularization, SDS 솔루션 시간15,16에 감소 된 가용성, 가수분해, 그리고 pH 변경으로 인해 짧은 안정성을가지고 있기 때문에 가능성에 대 한 사용 하는 경우 비슷한 바람직하지 않은 효과 얻을 수 있다 . Explants의 정확한 크기 (1.5 m m x 1.5 m m x ~1.5)의 사용 또한 필수적 성공적인 성인 조직 decellularization에 대 한 더 큰 조직 절제술 더 어려운 decellularize 이기 때문에, 세포 파편을 표시 표면에 갇힌 이며 체포 사이 조밀한 ECM 네트워크. 이 프로토콜을 제공 하지만 심장 조직 decellularization의 효율적인 방법, 성인 explants의 작은 분수 수 있습니다 현재 셀 나머지, 특히 더 큰 크기의. 이 샘플의 조직학 분석 용이 그들의 식별 및 연구에서 후속 제외. 궁극적으로, 여기 프로토콜은 다양 하 고 쉽게 조직 explant 크기, SDS 농도를 약간의 조정으로 다른 표본에 적용 (0.1-0.2 %SDS) 또는 솔루션 보육 시간5,12,13 .
현재 방법의 주요 한계는 소형 샘플, 즉 murine 태아 심장 및 성인 심장의 조작 explants, 일부 처리 기술이 필요 합니다. 사실, 태아 및 성인 decellularized 조직 수 있는 영구적으로 변형 때 절차 동안 건조 또는 속은 얇은 피 펫 팁 또는 집게5처리 중 섬세 한 구조는.
이 프로토콜, 태아 마우스 심 혼 및 ECM 구성 (biomechanical 분석) 및 관련된 생물 학적 기능, 비교 평가 대 한 성인 좌 심 실 explants의 병렬 decellularization 외의 주요 참신은 그것의 간단한 고유 조직 및 모델5,,1213번역. Decellularization 조직의 표준화 방법론을 적용 하 여 다른 연령대의 붉은 털 원숭이 신장 및 10 일6에 대 한 1 %SDS 치료를 태아, 신생아 및 성인 조직 가로 섹션에 대해서만 설명 했다 . 심장 속에서 태아, 신생아 및 성인 조직 decellularized 되었습니다, 하지만 방법의 기계적 dislodging, SDS 농도 및 응용 프로그램7,8시간 정도에 달랐다. 각 decellularization 프로시저는 독특한 방식으로 ECM를 영향을, 다른 프로토콜 로부터 얻은 decellularized 샘플의 비교는 잘못 된 결론에 발생할 수 있습니다. 따라서, 서로 다른 샘플에 걸쳐 동일한 decellularization 절차를 적용 신뢰성 비교 분석을 수 있습니다.
상용 decellularized 직물의 대다수 성인 표본17에서 파생 됩니다. 성인 들에 비해 프로 재생 신호를 제공 하는 태아 microenvironments의 증가 능력에 대 한 성장 인식에도 불구 하 고 태아 조직의 decellularization만에 알려졌다 몇 연구5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. 노화 과정 이해 ECM 역학 프로 재생 microenvironments는, 차례 차례로, 더 높은 효율 생체 모방 재료의 개발 영향의 독특한 기능에 중요 한 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 관련 중요 한 토론에 대 한 핀 토-마-Ó 연구소의 모든 구성원에 게 빚을. 이 작품 프로젝트 "CARDIOSTEM 설계 심장 조직 및 심장 혈관 응용 프로그램에 대 한 줄기 세포 기반 요법" 아래 프로그램이 MIT Fundação 파라 과학 전자 기술 (FCT)에 의해 지원 되었다 (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. [SFRH/BD/88780/2012] FCT 화목의 받는 사람 이며 M.J.O.은 FCT 동료 (FCT 탐정 2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | - | - | Equipment available |
| Digital weight scale | - | - | Equipment available |
| Inverted Microscope | - | - | Equipment available |
| Cell culture incubator | - | - | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | - | - | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | - | - | Equipment available |
| Microtome | - | - | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | - | - | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | - | - | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | - |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | - |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | - |
| Eppendorff | - | - | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | - |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | - |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | - |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | - |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | - |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | - |
| Dry ice | - | - | - |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | - |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | - |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | - |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | - |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | - |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | - |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | - |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | - |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | - |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | - |
| Deionized water (DI water) | - | - | - |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | - |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | - |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | - |
| Deionized water (DI water) | - | - | - |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | - |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | - |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | - |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | - |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | - |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | - |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | - |
| Cell culture media of the cell of interest | - | - | - |
References
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생명 공학 문제 145 Decellularization 기질 3D 건설 기계 태아의 심장 성인 심장 심장 조직 공학Erratum
Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. The affiliations were updated.
The fourth affiliation was corrected from:
Gladstone Institutes, University of California San Francisco
to:
Gladstone Institute of Cardiovascular Disease
An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:
University of California San Francisco
