Sammenlignbare Decellularization av Fetal og voksen hjerte vev Explants som 3D-lignende plattformer for i Vitro studier
Summary
Cardiac ekstracellulær matrix (EFM) er et kompleks nettverk av molekyler som arrangerer nøkkelprosesser i vev og organer mens varig fysiologiske remodeling gjennom hele livet. Standardiserte decellularization fosterets og voksen hjerter tillater komparative eksperimentelle studier av både vev i en 3D kontekst ved å fange opprinnelige arkitektur og biomekaniske egenskaper.
Abstract
Nåværende kunnskap om ekstracellulær matrix (EFM)-celle-kommunikasjon betyr store todimensjonal (2D) i vitro kultur studiene der ECM komponenter presenteres som en overflate belegg. Systemene kultur utgjør en forenkling av den komplekse naturen av vev ECM som omfatter biokjemisk komposisjon, struktur og mekaniske egenskaper. Bedre emulere ECM-celle kommunikasjonen utformingen av cardiac microenvironment, vi utviklet en protokoll som tillater decellularization av hele fosterets hjerte og voksen venstre ventrikkel vev explants samtidig for komparative studier. Protokollen kombinerer bruk av en hypotonisk buffer, et vaskemiddel anionic surfactant egenskaper og DNase behandling uten noen som helst krav for spesialiserte ferdigheter eller utstyr. Bruk av samme decellularization strategi over vevsprøver fra fag av ulike alder er en alternativ tilnærming til å utføre komparative studier. Nåværende protokollen tillater identifikasjon av unike strukturelle forskjeller over fosterets og voksen cardiac ECM mesh og biologiske mobilnettet svar. Videre den her metodikk demonstrerer en bredere anvendelse som blir brukt i andre vev og arter med mindre justeringer, som menneskelige tarmen biopsier og mus lunge.
Introduction
Den ekstracellulære matrisen (EFM) er et dynamisk nettverk av molekyler som regulerer viktig cellulære prosesser, nemlig skjebne avgjørelse, spredning og differensiering1,2. Etterforskningen av celle-ECM interaksjoner blitt utført hovedsakelig i todimensjonale (2D) i vitro kulturer belagt med ECM komponenter, som utgjør en forenkling av innfødte ECM egenskaper i vivo. Decellularization genererer acellular 3D-lignende ECM bioscaffolds som i stor grad bevarer ekstracellulære arkitektur og sammensetningen av innfødte vev og organer3,4. I tillegg bioaktive stillaser tissue engineering, er decellularized 3D ECM biologisk materiale fremstår som roman plattformer for å vurdere celle-ECM biologi som tilsvarer i vivo miljøet.
Vurdering av rollen annerledes ECM komponentene i forskjellige vev, organer og alder fordelen med bruk av lignende protokoller generere innfødte bioscaffolds. På hjertet, har vi utviklet en allsidig protokoll for decellularization av fetal og voksen-avledet prøver, som en alternativ tilnærming til å utføre komparative studier av orgel-microenvironment. Med denne metoden, vi fanget den opprinnelige hjerte microenvironment og viste at fosterets ECM fremmer høyere repopulation gir cardiac celler5. Decellularization gitt ytterligere identifikasjon av bosatt strukturelle forskjeller mellom fosterets og voksen ECM nivået av kjelleren lamina og pericellular matrix nettet arrangement og fiber komposisjon5. Før dette arbeidet, er head-to-head sammenligning av vev på ulike ontogenic stadier ved hjelp av samme decellularization tilnærming bare rapportert for rhesus monkey nyrer og gnager hjerter. I tillegg rapporterer et begrenset antall studier fosterets vev/orgel decellularization sådan5,6,7. Dette er oppnådd ved hjelp av SDS som unike decellularization agent; Imidlertid ble forskjellige SDS konsentrasjoner brukt til decellularization av fetal og voksen hjerte vev7,8. SDS er en av de mest effektive ioniske vaskemidler for klarering av cytoplasmatiske og kjernefysisk materiale, og brukt mye i decellularization av ulike vev og prøver9,10. Løsninger som inneholder høye konsentrasjoner av SDS og lengre eksponering har vært korrelert med protein rødsprit, glycosaminoglycan (GAGs) tap og forstyrrelse av kollagen fibrils10,11, og derfor en balanse mellom ECM bevaring og celle fjerning er nødvendig. Du kan bruke samme fremgangsmåte til fosterets og voksen hjertet vev ved protokollen beskrevet her er delt i tre sekvensielle trinn: celle lysis av osmotisk sjokk (hypotonisk buffer); solubilization av lipid-protein, DNA-protein og protein-protein interaksjoner (0,2% SDS); og kjernefysisk materiale fjerning (DNase behandling).
Våre Protokoll viser flere fordeler: jeg) at tilsvarende decellularization Aldersavhengige hjerte vev ved bruk av samme decellularization strategi; II) ingen krav til spesialiserte eller utstyr; III) klar tilpasning til andre vev og arter som det har vært anvendt med mindre endringer i menneskelige tarmen biopsier12 og mus lunge13; og viktigst, iv) kan ta ECM biomekaniske egenskaper samtidig som den muliggjør montering av 3D-lignende organotypic kulturer at mer tett etterligne molekylær funksjonene i den opprinnelige vev microenvironment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ekstracellulære matrisen (EFM) er en meget dynamisk og komplekse meshwork av fibrøs og lim glykoproteiner, bestående av et reservoar av rekke bioaktive peptider og fanget vekstfaktorer. Som store modulator celle vedheft, cytoskjelett dynamics, motilitet/overføring, spredning, differensiering og apoptose regulerer ECM aktivt cellulære funksjoner og atferd. Å vite at mobilnettet atferd avviker i 2D og 3D kulturer, har det vært innsatsen for å utvikle romanen organotypic modeller som replikeres nøyaktig naturli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er gjeld til alle medlemmer av Pinto–Ó laboratorium for relevante kritisk diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) under prosjektet “CARDIOSTEM-konstruert hjerte vev og stilk cellen-basert behandling for hjerte applikasjoner” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. er en mottaker av en FCT fellesskap [SFRH/BD/88780/2012] M.J.O. er en FCT kar (FCT-etterforsker 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
- Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
- Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
- Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
- Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
- Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
- Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
- Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).
