Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro
Summary
A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.
Abstract
Conhecimento atual da matriz extracelular (ECM)-célula comunicação se traduz em estudos de grande bidimensional (2D) cultura in vitro, onde os componentes de ECM são apresentados como um revestimento de superfície. Estes sistemas de cultura constituam uma simplificação da natureza complexa do tecido ECM que engloba a composição bioquímica, estrutura e propriedades mecânicas. Para melhor emular a ECM-célula comunicação moldar o microambiente cardíaca, desenvolvemos um protocolo que permite a decellularization do coração fetal toda e tecido adulto ventrículo esquerdo explants simultaneamente para estudos comparativos. O protocolo combina a utilização de um buffer hipotônica, um detergente de surfactante aniônico Propriedades e tratamento de DNase sem qualquer exigência de habilidades especializadas ou equipamento. A aplicação da estratégia de decellularization da mesma através de amostras de tecido de indivíduos de idade diferentes é uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos. O presente protocolo permite a identificação das únicas diferenças estruturais entre fetais e adultas cardíaca ECM malha e biológicas respostas celulares. Além disso, a aqui a metodologia demonstra uma aplicação mais vasta, sendo aplicada com sucesso em outros tecidos e espécies com pequenos ajustes, tais como em biópsias de intestino humanas e pulmão do rato.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) é uma rede dinâmica de moléculas que regulam processos celulares importantes, nomeadamente o destino-decisão, proliferação e diferenciação de1,2. A investigação de interacções célula-ECM foi realizada principalmente em duas dimensões (2D) em vitro culturas revestido com componentes de ECM, que constituem uma simplificação das propriedades nativas de ECM encontrado na vivo. Decellularization gera bioscaffolds de ECM 3D-como acelular que preservam em grande parte a arquitetura extracelular e composição de tecidos nativos e órgãos3,4. Além de servir como andaimes bioativos para a engenharia de tecidos, biomateriais de ECM decellularized 3D estão emergindo como plataformas de romance para avaliar biologia celular-ECM desse paralelo o ambiente em que vivo.
Avaliação da função diferencial dos componentes de diferentes tecidos, órgãos e idade ECM serão beneficiados com o uso de protocolos semelhantes de gerar bioscaffolds nativo. No coração, temos desenvolvido um protocolo versátil para decellularization de amostras fetais e adulto-derivado, como uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos com o microambiente do órgão. Usando esta metodologia, capturamos o microambiente cardíaca nativa e mostrou que o ECM fetal promove maior rendimento de repovoamento de células cardíacas5. Decellularization ainda mais desde a identificação de residentes diferenças estruturais entre ECM fetal e adulto ao nível da cave lamina e pericelular matriz malha o arranjo e composição de fibra5. Antes deste trabalho, Head-to-comparação de tecidos em diferentes estágios de ontogenic, usando a mesma abordagem de decellularization só tem sido relatado para roedores corações e rins de macaco rhesus. Além disso, um número limitado de estudos relatam o tecido fetal/órgão decellularization por si5,6,7. Isto foi conseguido usando SDS como agente exclusivo de decellularization; no entanto, distintas concentrações de SDS foram usadas para o decellularization do tecido cardíaco fetal e adulto7,8. SDS é um dos detergentes iônicos mais eficazes para o apuramento de material citoplasmático e nuclear e amplamente utilizado na decellularization de diferentes tecidos e espécimes9,10. Soluções contendo altas concentrações de SDS e longos períodos de exposição tem sido correlacionadas com a desnaturação da proteína, a perda de glicosaminoglicano (GAGs) e a ruptura do colágeno fibrilas10,11e, portanto, um equilíbrio entre preservação e célula remoção de ECM é necessário. Para aplicar o mesmo procedimento para o tecido cardíaco fetal e adulto, o protocolo descrito neste documento é dividido em três etapas sequenciais: lise de células por choque osmotic (hipotônica tampão); solubilização dos lipídios-proteínas, ADN-proteína e proteína-proteína interações (0,2% SDS); e remoção de material nuclear (tratamento de DNase).
Nosso protocolo mostra várias vantagens: eu) a possibilidade de decellularization equivalente dos tecidos cardíacos de idade específica aplicando a mesma estratégia de decellularization; II) sem requisitos para métodos especializados ou equipamento; III) pronta adaptação para outros tecidos e espécies como foi aplicado com sucesso com pequenas alterações em biópsias de intestino humano12 e mouse pulmão13; e, importante, iv) pode resolver propriedades biomecânicas de ECM, permitindo a montagem de organotypic 3D-como as culturas que mais estreitamente imitam as características moleculares do microambiente do tecido nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A matriz extracelular (ECM) é uma malha altamente dinâmica e complexa de glicoproteínas fibrosas e adesivas, consistindo de um reservatório de inúmeros peptídeos bioativos e fatores de crescimento aprisionados. Como o principal modulador de adesão celular, dinâmica do citoesqueleto, mobilidade/migração, proliferação, diferenciação e apoptose, ECM ativamente regula o comportamento e a função celular. Sabendo que o diferente comportamento celular em culturas 2D e 3D, tem havido esforços para desenvolver mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores estão em dívida para todos os membros do laboratório de Pinto–Ó para discussão crítica relevante. Este trabalho foi financiado pelo Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) no âmbito do projecto “CARDIOSTEM-engenharia de tecidos cardíacos e terapias baseadas em células-tronco para aplicações cardiovasculares” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. é um destinatário de uma bolsa da FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. é um companheiro da FCT (FCT-investigador 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
References
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