Сердца внеклеточная матрица (ECM) является сложной сети молекул, которые оркестровать ключевых процессов в органах и тканях при Несокрушимая физиологических ремоделирования на протяжении всей жизни. Стандартизированные decellularization плода и взрослых сердец позволяет сравнительные экспериментальные исследования обеих тканей в условиях 3D, захватив родной архитектуры и биомеханических свойств.
Текущий набор знаний внеклеточного матрикса (ECM)-сотовой связи переводится большой двухмерный (2D) в пробирке культуры исследования, где представлены компоненты ECM как покрытие поверхности. Эти культуры системы представляют собой упрощение сложного характера ECM, которая охватывает биохимического состава, структуры и механических свойств ткани. Чтобы лучше подражать ECM-сотовой связи, формирование сердца микроокружения, мы разработали протокол, который позволяет для decellularization сердца всего плода и ткани взрослых левого желудочка эксплантах одновременно сравнительных исследований. Протокол сочетает в себе использование гипотонический буфера, моющее средство анионное ПАВ свойств и DNase лечения без какого-либо требования для специальных навыков или оборудования. Применение той же стратегии decellularization через образцы тканей от субъектов различного возраста является альтернативный подход для проведения сравнительных исследований. Настоящий Протокол позволяет выявление уникальных структурных различий между плода и взрослых сердца ECM сетки и биологического клеточных реакций. Кроме того здесь методологии демонстрирует более широкое применение, успешно применяется в других тканях и видов с незначительными изменениями, таких как в человеческой кишечника биопсии и мыши легких.
Внеклеточная матрица (ECM) является динамичной сети молекул, которые регулируют важные клеточные процессы, а именно судьба решение, пролиферации и дифференцировки1,2. Исследование взаимодействий клеток ECM была проведена главным образом в двухмерный (2D) в vitro культур, покрытые компоненты ECM, которые представляют собой упрощение родной ECM, найденных в естественных условиях. Decellularization генерирует бесклеточной ECM 3D-как bioscaffolds, который во многом сохранить внеклеточного архитектуры и состава собственных тканей и органов3,4. В дополнение к качестве биоактивные подмости для тканевой инженерии, decellularized 3D ECM биоматериалов появляются как Роман платформы для оценки биологии клетки ECM параллельных в естественных условиях окружающей среды.
Оценки дифференциальной роли компонентов ECM различных тканей, органов и возраста принесет пользу с использованием аналогичных протоколов генерации родной bioscaffolds. В самом сердце мы разработали универсальный протокол для decellularization плода и взрослого, полученных образцов, в качестве альтернативного подхода для проведения сравнительных исследований орган микроокружения. С использованием этой методологии, мы захватили собственного сердца микроокружения и показал, что плода ECM способствует повышению урожайности заселение сердечной клетки5. Decellularization представлена дополнительная идентификация резидентов структурных различий между плода и взрослых ECM на уровне механизма, подвал пластинки и околоклеточного сетки матрицы и волокна состав5. До этой работы голова к голове сравнения тканей на разных этапах онтогенезе, используя тот же подход decellularization сообщалось только резус почек и сердца грызунов. Кроме того ограниченное количество исследований сообщают плода ткани/орган decellularization per se5,6,7. Это было достигнуто с помощью SDS как уникальный decellularization агент; Однако собственный SDS концентрации были использованы для decellularization плода и взрослых сердечной ткани7,8. SDS является одним из наиболее эффективных ионных моющих средств для разминирования цитоплазмы и ядерных материалов и широко используется в decellularization различных тканей и образцы9,10. Растворы, содержащие высокие концентрации SDS и длительного воздействия были связаны с денатурации белков, потеря Глюкозаминогликан (GAGs) и нарушение фибрилл коллагена10,11и поэтому необходим баланс между удаления сохранение и клеток ECM. Чтобы применить ту же процедуру для ткани сердца плода и взрослых, протокол, описанные здесь делится на три последовательных этапа: сотовый лизис по осмотическим шоком (гипотоническая буфера); солюбилизация липидов белков, ДНК белковых и белок белковых взаимодействий (0,2% SDS); и удаления ядерного материала (DNase лечение).
Наш протокол показывает несколько преимуществ: я) возможность эквивалент decellularization возрасту сердечной ткани путем применения одной и той же стратегии decellularization; II) никаких требований для специализированных методов или средств; III) готовы адаптации для других видов тканей и как она успешно применялась с небольшими изменениями в человеческой кишечника биопсий12 и мыши легких13; и, главное, iv) может адресовать ECM биомеханических свойств позволяя Ассамблея 3D-как organotypic культур, что более тесно имитировать молекулярные особенности родной ткани микроокружения.
Внеклеточная матрица (ECM) является весьма динамичного и сложного сеть волокнистых и клей гликопротеинов, состоящий из водохранилища многочисленные биоактивные пептиды и зависшие факторов роста. Как основных модулятором клеточной адгезии, Цитоскелет динамики, моторики и миграцией, ра?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признательны всем членам Пинто ду Ó лаборатории для соответствующих критического обсуждения. Эта работа была поддержана програма MIT-Фонд пункт Ciência e Tecnologia (КГФ) в рамках проекта «CARDIOSTEM-инженерии сердечной ткани и основанного на стволовых клеток лечение сердечно-сосудистых приложений» (MITP-TB/ЕЭК/0013/2013). A.C.S. является получателем стипендий КГФ [SFRH/BD/88780/2012] и M.J.O. является членом КГФ (FCT-следователь 2012).
Equipment | |||
Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
Fluorimeter | – | – | Equipment available |
Digital weight scale | – | – | Equipment available |
Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
Microtome | – | – | Equipment available |
Cirurgical Instruments | |||
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
Materials | |||
24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
Eppendorff | – | – | Material available |
15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
Tissue cryopreservation | |||
Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
Dry ice | – | – | – |
Decellularization | |||
NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
Deionized water (DI water) | – | – | – |
Histology | |||
10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
Deionized water (DI water) | – | – | – |
Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
Kits | |||
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
Cell culture | |||
DPBS | VWR | 45000-434 | – |
Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |