Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Vitro çalışmalar için 3D benzeri platformlar olarak Fetal ve yetişkin kalp doku karşılaştırılabilir Decellularization Explants

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

Kardiyak hücre dışı Matriks (ECM) anahtar süreçlerinde doku ve organların fizyolojik hayatı boyunca remodeling kalıcı süre alacak moleküllerinin karmaşık bir ağdır. Fetal ve yetişkin kalplerin standart decellularization 3D bir bağlamda yerel mimari ve biyomekanik özellikleri yakalayarak karşılaştırmalı deneysel çalışmalar hem dokuların izin verir.

Abstract

Geçerli hücre dışı Matriks (ECM) bilgisine-hücre iletişim çevirir büyük iki boyutlu (2D) tüp bebek kültür çalışmaları nerede ECM bileşenleri bir yüzey kaplama olarak sunulmaktadır. Bu kültür sistemleri biyokimyasal bileşimi, yapısı ve mekanik özellikleri kapsar ECM dokusunun karmaşık yapısı basitleştirilmesi oluşturmaktadır. Bütün fetal kalp decellularization için sağlayan bir protokol geliştirdiğimiz kardiyak microenvironment şekillendirme ECM-hücre iletişim daha iyi taklit etmek için ve yetişkin sol ventrikül doku aynı anda için karşılaştırmalı çalışmalar explants. Protokol Hipotonik bir arabellek, bir deterjan Anyonik yüzey aktif özellikleri ve Dnaz tedavi herhangi bir gereksinim olmadan kullanmak özel beceri ya da ekipman için birleştirir. Doku örnekleri arasında aynı decellularization stratejisi uygulamadan konularda çeşitli yaş karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşımdır. Mevcut iletişim kuralı benzersiz yapısal farklılıkları tanımlaması fetal ve yetişkin kalp ECM mesh ve biyolojik hücresel yanıt izin verir. Ayrıca, burada daha geniş bir uygulama başarıyla diğer dokulara ve küçük ayarlamalar, bu türe gibi insan bağırsak biyopsisi ve fare akciğer uygulanan metodoloji gösterir.

Introduction

Hücre dışı Matriks (ECM) önemli hücresel süreçler, yani kader-karar, yayılmasını önleme ve farklılaşma1,2düzenleyen molekülleri dinamik bir ağdır. Hücre-ECM etkileşimlerin incelenmesi esas olarak iki boyutlu (2D) in vitro kültürlerde ECM bileşenleri ile kaplı, hangi vivo içindebulunan yerel ECM özellikleri basitleştirilmesi teşkil yapıldı. Decellularization büyük ölçüde hücre dışı mimarisi ve kompozisyon yerel doku ve organları3,4korumak acellular 3D benzeri ECM bioscaffolds oluşturur. Doku Mühendisliği için biyoaktif iskele olarak görev ek olarak, decellularized 3D ECM Biyomalzeme roman platformlar hücre-ECM Biyoloji değerlendirmek için o paralel içinde vivo ortamda ortaya çıkıyor.

ECM bileşenleri farklı dokular, organlar ve yaş fark rolünün değerlendirilmesi ile yerel bioscaffolds üretme benzer iletişim kurallarının kullanımını yararlanacaktır. Kalbinden, decellularization örnekleri, fetal ve yetişkin türetilmiş için çok yönlü bir iletişim kuralı organ microenvironment, karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, biz yerel kardiyak microenvironment yakalanan ve fetal ECM kalp hücreleri5yüksek repopulation verimi teşvik gösterdi. Decellularization daha fazla lif kompozisyon5arasında fetal ve yetişkin ECM Bodrum lamina ve pericellular matris kafes düzenlemenin düzeyinde ikamet yapısal farklılıklar tanımlaması sağlanmıştır. Önce bu çalışmaları, aynı decellularization yaklaşımı kullanarak farklı ontogenic aşamalarında dokuların kafa kafaya karşılaştırma yalnızca al yanaklı maymun böbrekler ve kemirgen kalpler için bildirilmiştir. Buna ek olarak, sınırlı sayıda çalışmalar fetal doku/organ decellularization başına5,6,7rapor. Bu SDS benzersiz decellularization Aracısı olarak kullanarak elde edilmiştir; Ancak, farklı SDS konsantrasyonları fetal ve yetişkin kalp dokusu7,8decellularization için kullanıldı. SDS en etkili iyonik deterjanlar için izni sitoplazmik ve nükleer malzeme biridir ve yaygın olarak kullanılan farklı doku ve numuneler9,10decellularization içinde. Yüksek SDS konsantrasyonları ve uzun süreli maruz kalma içeren çözümler proteini denatürasyon, glikozaminoglikan (gag) kaybı ve kollajen liflerinde10,11, bozulma ile ilişkili ve bu nedenle bir ECM korunması ve hücre kaldırma arasında denge gereklidir. Fetal ve yetişkin kalp dokusu ile aynı yordamı uygulamak için burada açıklanan protokol üç sıralı adımları ayrılmıştır: hücre lizis ozmotik şok (Hipotonik arabellek); solubilization lipid-protein, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerinin (% 0,2 SDS); ve nükleer malzeme kaldırma (Dnaz tedavisi).

Bizim iletişim kuralı birkaç avantajları gösterir: Ben) aynı decellularization strateji; uygulama tarafından yaş özgü kardiyak dokuların eşdeğer decellularization olasılığı II) özel yöntemler veya ekipman gereksinim yoktur; III) diğer doku ve tür olarak bu hazır adaptasyon ile insan bağırsak biyopsisi12 ve fare akciğer13' te küçük değişiklikler başarıyla uygulandı; ve önemlisi, IV) ECM biyomekanik özellikleri 3D benzeri organotypic kültürleri daha yakından yerel doku microenvironment moleküler özelliklerini taklit Meclisi etkinleştirilirken adresleyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Açıklanan yöntemleri i3S hayvan Etik Komitesi ve Direção Geral de tarafından onaylanmış Veterinária (DGAV) ve are uygun olarak Avrupa Parlamentosu yönergesi 2010/63/AB.

1. decellularization çözümleri hazırlanması

Not: çözümleri 0,22 mikron membran filtre ile filtre ve dışında en fazla 3 ay için depolanan tüm decellularization aksi belirtilmediği.

  1. 1 x PBS için: 8 gram NaCl, 1,01 g Na2HPO4 KCl, 200 mg Mix ve KH2PO4 200 mg ile 900 mL deiyonize su (DI su). Çözüm pH 7.5 ve nihai çözüm Cilt 1 L. filtre, basınçlı kap ve mağaza oda sıcaklığında (RT) çözüm için ayarlayın.
  2. Hipotonik arabellek (10 mM Tris, % 0,1 EDTA) için: 1.21 g TrisBASE ve EDTA 1 g 900 mL deiyonize su içinde çözülür. Çözüm pH 7.8 NaOH/HCl ile için ve nihai çözüm Cilt 1 L. filtre ayarlamak, otoklav tarafından sterilize ve RT. stok
  3. İçin % 0,2 SDS eriyik (% 0,2 SDS, 10 mM Tris): 0,6 g TrisBASE ve 1 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 400 mL DI su ekleyin ve 60 ° C'de tam çözünen dağılmasına kadar karıştırın. Çözüm RT. ayarla çözüm pH 7.8 için ve 500 mL nihai çözüm birime soğumasını izin. Çözüm filtrasyon tarafından sterilize.
    Not: SDS çözüm kullanmadan önce hazırlanmalıdır. Filtre çözümü sonra SDS dağılması tamamlamak, aksi halde SDS erimeyen parçacıklar son SDS konsantrasyon değiştirme ve sonuç olarak doku decellularization verimliliği etkileyen filtre emdirmek.
  4. Hipotonik yıkama arabellek (10 mM Tris) için: TrisBASE 1.21 g DI 900 ml su karıştırın. Çözüm pH 7.8 için ve son hacim 1 L. filtre ayarlamak, otoklav tarafından sterilize ve RT. stok
  5. Dnaz tedavi (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL Dnaz) için: 2.42 g TrisBASE ve 2 mL 1 M MgCl2 900 mL DI su içinde çözülür. PH 7.8 için ve nihai çözüm Cilt 1 L. filtre ayarlamak ve çözüm otoklav tarafından sterilize. Saklamak çözüm RT. eklemek Dnaz, ben (50 U/mL) kullanmak için önceden.
  6. Dnaz için çözüm stok: % 50 gliserol, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2, içeren bir Dnaz arabellek hazırlamak ve DI su ile 10 mL nihai çözüm hacmiyle ayarlayın. Laminar akış mahallede Dnaz arabelleğe toz ve karışımı yavaşça kadar tam çözülme Dnaz ekleyin. Çözüm 0,22 mikron filtre üzerinden sterilize. 1 mL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın

2. doku hasat ve dondurma

  1. Yetişkin hamile kadın, gebelik (E18 fetusa) CO2 Havasızlıktan Boğulma yoluyla 18 gün ötenazi. Cerrahi makas kadınlarla bir sezaryen gerçekleştirmek ve eğri İpuçları (her iki boynuz ucu için bir cımbız) ile iki tırtıklı cımbız kullanarak buz gibi 1 x PBS ile fetal fareler için bir petri taşıyan rahim boynuzları toplamak.
    1. Rahim boynuzları ve amniyotik kese fetusa izole etmek için açın. Fetusa onları anestezi ve makas ile başını kesmek için buz gibi 1 x PBS ile yeni Petri kabına aktarın.
    2. 7-8 hafta yaşlı erkek C57BL/6 fareler CO2 boğulma kullanarak ötenazi. Bir kesik her fare göğüs üzerinde gerçekleştirmek ve kalp toplamak.
    3. Kısaca fetal ve yetişkin kalplerini buz soğuk 1 x PBS ile yıkayın.
  2. Yetişkin Kalp kulakçık bir neşter yardımıyla kaldırın. Bir kesik sağ ventrikül üzerinde gerçekleştirmek ve düz küçük makas kullanarak kaldırın. Sol ventrikül iç duvar septum kaldırarak maruz. Yeni Petri kabına, sol ventrikül ücretsiz-duvardaki uzunlamasına şeritler ile 2 mm kalınlığında bölmek ve Papiller kas bir neşter ve tırtıklı cımbız ile eğri ipuçlarını kullanarak kaldırın.
    1. 2 x 2 mm Kılavuzu (detaylı açıklama ek Resim 15) kullanarak bir neşter yardımıyla özel tüketim küçük doku explants. Kısaca doku explants 1 x PBS ile yıkayın.
  3. ~ 250 µL en uygun kesme sıcaklık (OCT) bileşik autoclaved 1.5 mL microcentrifuge tüpler için ekleyin. Bütün fetal kalp ve yetişkin kalp explants, Ekim 250 µL tüplerini transfer ve onları kuru buz soğutmalı isopentane ve mağaza-80 ° c (ile en fazla 6 ay) ile dondurma.
    Not: Kalp doku explants 6 aydan fazla cryopreserved kullanımını decellularization verimlilik, özellikle yetişkin kalp doku explants önemli ölçüde azaltır.

3. doku decellularization

Not: Kalp doku decellularization 24-iyi doku kültürü plaka başına iyi bir örnek ile gerçekleştirilir. Her decellularization çözüm 1 mL her birey için de eklenir. Tüm decellularization merdiven ile ajitasyon 165 RPM (kuluçka shaker bir yörünge çapı 20 mm) ve 25 ° c, aksi belirtilmedikçe yapılmalıdır. Daha fazla ayrıntı için lütfen şekil 1Adüzeni bakın. Amfoterisin B (örneğin fungizone) ve gentamisin taze 2.5 μg/mL ve 0,01 μg/mL, son bir konsantrasyon için kullanmadan önce tüm decellularization çözümler sırasıyla eklenir. Decellularized dokular, decellularization Protokolü başlamadan önce belirlenecek örnek kitle ihtiyaçlarını içinde muhafaza DNA miktarını ölçmek için. DNA miktar Protokolü daha ayrıntılı olarak açıklandığı 5.1 bölümdür.

  1. 1. GÜN
    1. Doku örnekleri-80 ° C dondurucudan kaldırın. OCT kısmen erimiş hale gelinceye kadar 1.5 mL microcentrifuge tüpler RT bırakın. Kalp doku blok, hala donmuş Ekim 1 x PBS ile Petri kabına aktarın.
    2. OKT'yi erir sonra kalp doku yeni Petri kabına 1 x PBS ile taşıyın. 1 x PBS ve 10-15 dakika süreyle bir shaker ile 60 RPM yıkama örnekleri en az iki kez tekrarlayın.
    3. Hipotonik arabellek bir steril 24-iyi doku kültürü tabak iyi çalışma 1 mL ekleyin. Bir örnek de forseps yardımıyla başına aktarın.
    4. 25 ° C'de bir kuluçka shaker örnekleri ile 24-iyi doku kültürü plaka taşımak ve 18 h kuluçka Hipotonik arabellek ile başlar.
  2. 2. GÜN
    1. % 0,2 SDS çözüm 1.3 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.
    2. Hipotonik arabellek Aspire edin ve 1 x PBS ile örnekleri için 1 h. tekrar 3 kez yıkayın.
      Not: Duraklat noktası: doku decellularization altında 1 x PBS için statik koşullarda 18 h 4 ° C'de içinde tutulur.
    3. 1 x PBS kaldırmak, 1 mL taze yapılmış SDS çözeltisi (Adım 1.3) iyi ücret eklemek ve örnekleri için 24 saat kuluçkaya.
      Not: (Kontrol noktası) Post SDS kuluçka, örnekleri bir beyaz yarı saydam bir görünüm için sergi emin olun. Bu adımda, SDS tedavi örnekleri tutarlılık jelatin gibi gösterilen DNA'SINDA boğulmuş. SDS çözüm yavaş yavaş örnek yapışma pipet ucu kaçınmak için kaldırın.
  3. 3. GÜN
    1. Hipotonik yıkama arabelleği (iyi başına 1 mL) ile örnekleri için 20 dk. tekrar 3 kez yıkayın.
      Not: Bu adımda örnek boyutu hücre kalıntıları kaldırılması nedeniyle bir düşüş gözlemlemek için normaldir. DURMA noktası: Statik koşullarda 18 h için 4 ° C'de Hipotonik yıkama arabellekte doku decellularization altında tutulabilir.
    2. Dnaz tedavi çözüm iyi başına 1 mL ekleyin ve örnekleri 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya
    3. Dnaz tedavi çözüm Aspire edin ve 1 x PBS (iyi başına 1 mL) ile örnekleri için 20 dk. tekrar 3 kez yıkayın. Son yıkama 1 x PBS (iyi başına 1 mL) ile bir gecede RT ve 60 rpm'de sallayarak gerçekleştirmek.
    4. (Kontrol noktası) Dnaz tedaviden sonra decellularized örnekleri jelatin benzeri tutarlılık kaybetmiş olun.
      Not: Dnaz tedavi sonra kaldırmak ve örnekleri kolaylıkla entrapped ve pipet ucu bağlı beri 1 x PBS yavaşça ekleyin.

4. decellularized doku hücre kaldırma değerlendirilmesi

  1. RT taze yapılmış % 10 formalin tarafsız tampon % 0.03 sulu Eozin 2.5-3 h ile 1 mL ekleyerek örnekleri bir 24-iyi doku kültürü tabak, şey, başına 1 örnek fix
    Not: Decellularized doku leke ve örnek görselleştirme kesit ve histolojik boyama sırasında kolaylaştırmak için sabitleştirici Eozin eklenir. İkisi de histolojik lekeleri ile ne de ayirt teknikleri ile müdahale Eozin eklenmesi. Alternatif olarak, fiksasyon gecede 4 ° C'de gerçekleştirilebilir
  2. Sabitleştirici çözümü kaldırmak ve 1 mL 1 x PBS örnek yıkamak için ekleyin.
  3. Histoloji işleme jel üreticinin talimatlarına göre bir tek kullanımlık vinil numune kalıp kullanarak sabit bioscaffolds kapsüller.
  4. Histoloji jel ile kalıp ve transfer için biyopsi işleme/katıştırma kaset kapağı ile gömülü örnek kaldırın.
    Not: Her örnekte iki biyopsi sünger küçük gözenekli işlemek için alternatif Histoloji içinde gömme ve jel işleme doku var. Örnekleri algılamasını etkinleştirmek için biyopsi sünger ortasına doğru yerelleştirilmiş. Belirtmek gerekirse bazı örnekler bu yaklaşımı kullanarak yerelleştirmek zor olabilir.
  5. Art arda gelen incubations (çözüm başına 30 dk) aracılığıyla isoparaffinic Alifatik hidrokarbonlar çözüm (2 kuluçka istasyonu) alkol konsantrasyonu (% 70, %80, % 90'ı, % 100, % 100), bir dizi içinde katıştırma parafin ve parafin (2 kuluçka için örnekleri işleme 56 ° C'de istasyonları)
  6. Parafin blok örneklerinde bağlayın.
  7. 3 mikron kalınlığında parafin bölümleri bir microtome üzerinde kesme ve bölümleri cam mikroskop slaytlarda toplamak.
  8. Kuru parafin kesitler 37 ° C'de gecede
    Not: (Duraklat noktası) parafin kesitler 4 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanır.
  9. İletişim kuralı verimliliği doğrulamak için Hematoxilin ve Eozin (H & E) ve (MT) decellularized örnek bölüm ve manipüle olmayan doku üreticinin yönergelerine uygun bölümlerine boyama Masson'ın Trichrome gerçekleştirin.
    Not: H & E lekeleri boyama hücre çekirdeği mavi/mor, sitoplazma koyu pembe/kırmızı ve kollajen soluk pembe ve MT mavi lekeleri nükleuslar siyah, kırmızı, sitoplazma ve kolajen ve müsin. Verimli decellularization gözenekli bir pembe zaman (H & E, MT) elde edilir ve mavi (MT) ağ, nükleer bir leke olmaması durumunda görülmektedir.

5. decellularized doku nükleer malzeme kaldırma değerlendirilmesi

Not: Decellularized doku DNA içeriğine miktar ilgili olmayan manipüle doku ile karşılaştırıldığında gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Decellularization önce bir yüksek hassasiyetli digital ölçekte bir 1.5 mL microcentrifuge tüp tartın. Kalp doku transferi tüp, 1 x PBS ekstra miktar kaldırmak ve örnekleri ile tüp tartın. Örnekleri ıslak ağırlığını hesaplamak:
    Örnekıslak ağırlık ağırlık örnekleri ile tüp -ağırlık boş tüp =
  2. 3. adımda açıklandığı gibi örnekleri decellularize.
  3. Decellularization sonra decellularized doku microcentrifuge tüp içine toplamak.
    1. Küçük boyutları ve bireysel kardiyak örnekleri ve seti özellikleri kitle nedeniyle havuzu her örnek koşul decellularized dokuları (fetal kalp: 5 tüm kalpleri; yetişkin LV explants: 15 explants). Sigara manipüle doku ile aynı yordamı gerçekleştirin.
      Not: (Duraklat noktası) örnekleri olabilir DNA ekstraksiyon ve miktar gerçekleştirilir kadar-20 ° C de saklanmalıdır.
  4. Sigara manipüle kesme ve temiz bir petri bir neşter yardımıyla küçük explants dokularda decellularized.
    Not: her örnek için bir bireysel neşter ve Petri kapları kullanın. Bir neşter ile örnekleri mekanik bozulma onların posterior Enzimatik sindirim ve sonraki DNA ekstraksiyon kolaylaştırır.
  5. DNA ekstraksiyon için üreticinin yönergelerine uygun spin-sütun temel DNA ekstraksiyon yöntemi kullanın.
    1. Mekanik Disosiye örnekleri Petri kabına geniş orifis pipet ucu kullanarak üretici yönergelerine göre ana sindirim arabelleği (sindirim tampon ve İndinavir K) ile toplamak.
      Not: Doku lizis İndinavir K sindirim ile daha hızlı decellularized örnekleri var. Farklı örnekleri aynı anda işlemek için tüm örneklerini bozulması en aza indirmek için lysed kadar lysed örnekleri buz üzerinde tutun. Tam örnekleri lizis 4-6 h arasında elde edilir.
    2. Üreticinin yönergelerini göre protokolü ile devam edin.
    3. Decellularized ve sigara decellularized doku örneklerinin ayıklanan DNA verimi artırmak için DNA'sı 25-50 μL ve 100 μL elüsyon arabelleği, anılan sıraya göre elute. Eluted DNA toplamak ve spin-sütun yükleyin. RT santrifüj, 1 dk. için örnekleri üreticinin talimatlarına göre kuluçkaya.
      Not: (Duraklat noktası) DNA örneklerinden elde deposu-20 ° c kadar daha fazla kullanmak olabilir.
  6. Ayıklanan DNA örneklerinden üreticinin yönergelerini izleyerek bir floresan dsDNA algılama kiti ile ölçmek.
  7. DNA'ın nanogram miligram (decellularization önce) ilk örnek ıslak ağırlığının başı olarak DNA içeriği normalleştirmek.

6. decellularized iskele hücre tohumlama

Not: Tüm çözümleri/reaktifler steril olması gerekir ve tüm müdahalede steril koşullar.

  1. Amfoterisin B ve %1 2.5 μg/mL ile 1 x DPBS hazırlamak P/S (penisilin, 100 IU; streptomisin 100 µg/mL).
  2. 1 x PBS çözüm son decellularization çamaşır adımından (Adım 3.3.3) kaldırın ve taze hazırlanmış 1 x DPBS/2.5 μg/mL Amfoterisin B/1% P/S çözeltisi kuyu başına 500 μL ekleyin. Örnekler 1-7 gün 4 ° C'de depolayın.
    Not: Örnekleri depolama 4 ° C'de kısırlık korumak önemlidir.
  3. P/S son konsantrasyonu % 1 (olmadan FBS ve takviyeleri) Bazal medya hücre ekleyin.
  4. 1 x DPBS/2.5 μg/mL Amfoterisin B/1% P/S çözeltisi decellularized örneklerinden Aspire edin. Hücre Bazal media/1% P/S kuyu başına 500 μL eklemek ve 1 h 37 ° c veya daha 1 h için 4 ° C'de equilibrate örnekleri.
  5. Faiz hücreleri bölme ve hücre istenen hücre yoğunluğu, küçük aliquots hazırlayın.
    Not: Decellularized doku tohum stereoskopik mikroskop altında ve steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir. Hücre kültür medya %1 içermesi gerektiğini P/S.
  6. Bir de bir 96-şey plaka ortasına DPBS 3-4 μL pipette. İnce ve düz cımbız kullanarak, DPBS damla decellularized iskele transfer, ilave DPBS aspirasyon tarafından kaldırmak ve örnek katlanmış buruşuk ya da değil emin olun. İyi yüzeye uymaları kenarlı kuru haline izin.
    Not: Alt tohum verimi müstakil iskele var.
  7. Hücrelerin yavaş yavaş iyi kenarlarını karşı tek hücreli çözüm pipetting tarafından iskele için ekleyin.
    Not: Örneğin, Yenidoğan fare cardiomyocytes ile 7.500 hücreler/mm2 ve ölümsüzleştirdi fare yoğunluğu 60-1.500 hücreler/mm2yoğunluğu, Lin− Sca-1+ kardiyak progenitör hücre (ICPCSca-1) numaralı seribaşı. Hücre yoğunluğu deneysel mantığı göre ayarlayın.
  8. DPBS hızlı ortam buharlaşma önlemek için komşu wells ekleyin.
  9. kullanılan hücre tipi uydurdugunuz hikayeye bagli kaldim doku kültürü polistren levhalar (TCPS), bioscaffolds için yeni bir kuyu aktarırsanız hücre tohum, 24 saat sonrası. Aksi takdirde, yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için orta yerine.
  10. Dikkatli bir şekilde medya hücre tipi belirli gereksinimlerine göre değiştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Decellularization verimliliği üç ana teknikleri sayesinde tespit edilebilir: makroskopik gözlem, Histoloji ve DNA miktar. Örnekleri yazı-SDS tedavi makroskopik görünümünü hücre kaldırma etkinliğini dolaylı olarak etkiler. SDS kuluçka sonra örnekleri beyazımsı (şekil 1 c) saydam görüntülenmesi gerekir. Fetal (E18) Yetişkin explants bir yarı saydam beyaz görünüşüyle varken decellularized doku tarafından son derece şeffaf bir yapıya karakterizedir. Beyaz bir görünüm genellikle daha yüksek lif ve kollajen içerik, Yetişkin ventrikül ve vasküler damarları ECM mesh örneğin sergileyen bir ECM ağa (şekil 1 c) ilişkilidir. Hematoksilen ve Eozin (H & E) ve/veya Masson'ın Trichrome (MT) lekeleri gerçekleştirilen etkin hücre kaldırma işlemini onaylamak için gözenekli bir kafes (pembe, H & E; hafif pembe ve mavi, MT) gözlem tarafından (şekil 1 c). Ayrıca, kolajen meshwork mavi5MT leke vurgulamaktadır. Decellularization DNA miktar tarafından erişilen sonra nükleer malzeme temizlik ve bir azalma yaklaşık % 99.8 genellikle, Sigara manipüle dokulara (şekil 1 c) karşılaştırıldığında elde edilir. Nükleer malzeme decellularized iskele üzerinde varlığı istenmeyen inflamatuar yanıt implantasyon14üzerine bir tetikleyici olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, verimli decellularization onay yerel 3D iskele repopulation deneyler önce esastır. Decellularized iskele faiz hücreleri ile tohum kadar steril koşullarda depolanmış olabilir. Hücre canlılığı tüp bebek kültür boyunca (şekil 2A) Boyama calcein tarafından izlenir. Yine de, calcein leke duyarlı hücre tipleri için sitotoksik olabilir. Terminal hücre repopulation ve dağıtım iskele karşısında gerçekleştirilen sonrası parafin işleme analizidir; H & bioscaffolds bir orta kısmında boyama E tarafından değerlendirildi bioscaffold repopulation fotoğrafını (şekil 2B, 2 C) gösterilir.

Figure 1
Şekil 1. Decellularization verimliliği ile fetal (E18) ve yetişkin kalp doku decellularization yordam ve. (A) iletişim kuralı genel bakış. (B) Decellularization ayrıntılı iletişim kuralı. (C) önce ve decellularization sonra kalp fetal ve yetişkin doku makroskopik analizi. Ölçek çubuğu: 2 mm. (D) nükleer malzemenin miktar manipüle olmayan doku karşı decellularized. ± SEM bir öğrenci t-Testi, iki kuyruklu demek gibi ifade veri * p < 0,05. (E) H & E ve Masson'ın Trichrome histolojik analizi kardiyak fetal ve yetişkin doku önce ve decellularization sonra. Ölçek çubuğu: 100 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Decellularized iskele Lin - Sca-1+ kardiyak progenitör hücre satırıyla (ICPCSca-1) numaralı seribaşı Repopulation analizi. (A) yüksek hücre canlılığı tüp bebek kültür calcein leke (yeşil) tarafından sırasında iskele yüzeyde görülmektedir. Ölçek çubuğu: 100 mikron. (B) hücre sayı ve dağıtım genelinde iskele H & E boyama ile değerlendirildi. Ölçek çubuğu: 100 mikron. (C) decellularized ECM gömülü hücreleri dik bakış. 50μm-kalın parafin bölüm confocal görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 mikron (dik görünümü XZ, YZ) ve 40 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adım Gözlem Olası neden Sorun Çözüm
3.1.2. Kahverengi bir renk ile doku Örnek cryofixation; kararsız donma sıcaklığı Örnek cryofixation sitoplazmik protein verimsiz kaldırılması için yol açacaktır Donmuş doku daha kısa dönemlerde saklayın. Dondurucu sıcaklık ve istikrar kontrol edin
3.2.4. Pembe Beyaz opak örnekleri SDS çözüm iyi hazırlanmış değildi; Yetişkin LV explants çok büyük Sitoplazmik protein verimsiz kaldırma Tam SDS çözünme sağlamak. Örnekleri daha küçük boyutta decellularize.
3.3.4. Jelatin gibi bir görünüm ile örnekleri Verimsiz DNA kaldırma Verimsiz nükleer malzeme izni Dnaz konsantrasyon ve/veya KULUÇKA süresini artırın.
4.6. Histoloji jel sıkıştırma Parafin işlemeden önce PBS1X/etanol içinde uzun bekleme süresi Decellularized doku yapısı değiştirme En kısa zamanda işleme histolojik başlatmak
6.6. Kurutulmuş decellularized örnekleri Örnekleri çok uzun süre kurumaya bırakıldı Decellularized doku kalıcı çöküşü. Verimsiz hücre tohumlama Örnekleri için izin sadece çevre kuyunun için tohum sırasında bağlı olmak için biraz Kuru
6.7. Tohum sırasında decellularized örnek dekolmanı Örnekleri tohum önce kurutulmuş yeterli değildi Verimsiz hücre tohumlama Tohum hücre önce daha iyi yapışma sağlamak için ECM kurutma süresini artırmak

Tablo 1. Tablo paralel decellularization fetal (E18) ve yetişkin fare kalp doku için sorun giderme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücre dışı Matriks (ECM) çok sayıda biyoaktif peptidler ve sıkışmışlık büyüme faktörleri bir rezervuar oluşan lifli ve yapışkanlı glikoproteinlerin, son derece dinamik ve karmaşık bir meshwork var. Büyük modülatör hücre adezyon, sitoiskeleti dynamics, hareketliliği/geçiş, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve Apoptozis ECM aktif olarak hücresel fonksiyon ve davranış düzenlemektedir. Hücresel davranış 2D ve 3D kültürlerde farklı olduğunu bilmek, doğru bir şekilde doğal doku ortamlar çoğaltabilir roman organotypic modellerinin geliştirilmesi için çaba olmuştur. Son yıllarda, doku decellularization doku Mühendisliği ve rejeneratif tıp alternatif bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle doku ve organ decellularization şu anda daha iyi doku özgü microenvironmental parametreleri (biyokimyasal, yapısal ve mekanik) incelemek için tercih edilen aracı olduğunu ve tüp bebek ve içinde vivo biyolojik aktivitesi.

Hipotonik arabellek kullanımı arasında olan bir deterjan bir Dnaz tedavi5,12,13tarafından takip Anyonik yüzey aktif özellikleri birleştiren bir iletişim kuralı geliştirdik. Mevcut iletişim kuralı decellularized fetal ve yetişkin fare kalp dokusu arasında karşılaştırmalı analizi yapmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem kabul ettiğiniz anlamına gelir. Yani kanser hastalarının cerrahi rezeksiyonu ve fare akciğer dokusu, elde tümör örnekleri ile diğer dokular ile bizim deneyim bu iletişim kuralı kolayca uyarlanabilir ve diğer koşullarda başarılı ve12,13modelleri gösterir. Farklı örnekleri aynı decellularization ameliyat uygulanması 3D bir bağlamda karşılaştırmalı çalışmalar ECM kompozisyon, biyomekanik özellikleri, mimari ve hücresel düzenleyici özellikleri sağlar.

Doku decellularization en zor sorunlardan biri düpedüz hücre kaldırma, ECM meshwork korunması ve doku Biyouyumluluk arasındaki dengedir. Bu nedenle, birkaç önemli adımlar dikkatle, decellularization, doğru explant boyutu, taze çözümleri kullanımı ve son decellularized doku manipülasyonu önce doku dondurma zamanı gibi dikkate alınması gerekir. Çalışmalarımız sırasında decellularization verimsizlik ile uzun saklama süresi cryopreserved doku ve uzun süredir devam eden SDS çözümleri kullanımı arasında doğrudan bir ilişki görülmektedir. Uzun vadeli doku depolama verimsiz hücresel içerik kaldırma işleme kalıntıları (olmadan çekirdeği) kalın hücresel alanları arasında karmaşık ECM meshwork yol açar. Benzer bir istenmeyen etkisi uzun saklı SDS çözümleri doku decellularization, çünkü SDS çözümler zaman15,16 düşük çözünürlük, hidroliz ve pH değişiklikler nedeniyle kısa bir istikrar olasılığı için kullanıldığında elde . Explants doğru boyutu (~1.5 x 1.5 x 1.5 mm) kullanımı da başarılı yetişkin doku decellularization için gerekli daha büyük doku rezeksiyonu decellularize daha zor olduğundan, hücre artıkları görüntüleme yüzeyde entrapped ve tutuklandı yoğun ECM ağ arasında. Her ne kadar bu iletişim kuralı kalp doku decellularization verimli bir yöntem sağlar, Yetişkin explants küçük bir kısmını hücre kalıntıları, özellikle bu büyük boyutta takdim edebilir miyim? Histolojik analiz bu örnekleri kendi kimlik ve sonraki dışlama çalışma kolaylaştırır. Sonuçta, burada çok yönlü ve kolay uygulanabilir farklı örnekler doku explant boyutunda, SDS konsantrasyon hafif değişiklikler ile iletişim kuralıdır (0,1-%0,2 SDS) veya çözüm kuluçka saat5,12,13 .

Büyük mevcut yöntemi kısıtlamasıdır küçük boyutlu örnekleri, Yani fare fetal kalp ve yetişkin kalp explants, bazı işleme becerileri gerektirir. Aslında, fetal ve yetişkin decellularized dokuları işlem sırasında kurutulmuş veya entrapped ince pipet ucu veya forseps5ile işleme sırasında kalıcı olarak deforme olabilir hassas yapıları vardır.

Bu iletişim kuralı, fetal fare kalp ve yetişkin sol ventrikül explants ECM kompozisyon (biyomekanik analizler) ve ilişkili biyolojik fonksiyonu, karşılaştırmalı değerlendirilmesi için paralel decellularization yanı sıra büyük yenilik onun basit bir Çeviri farklı dokular ve modelleri5,12,13. Standart yöntemi uygulayarak farklı yaştan dokuların decellularization al yanaklı maymun böbrek ve enine bölümler için 10 gün6 %1 SDS tedaviye tabi tutuldu fetal, Yenidoğan ve yetişkin mendil tanımlanmıştır . Kardiyak bir ortamda fetal rağmen yenidoğan ve yetişkin doku decellularized, mekanik kekii, SDS konsantrasyonları ve uygulama7,8saat derecesini yöntemleri farklıydı. Her decellularization yordam ECM benzersiz bir şekilde etkiler gibi decellularized örnekleri farklı iletişim kuralları alınan kısıtlı karşılaştırılması yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, farklı örnekler üzerindeki aynı decellularization yordamı uygulayarak güvenilir karşılaştırmalı analizi sağlar.

Piyasada bulunan decellularized dokulara büyük çoğunluğu yetişkin örnekler17türetmek. Yetişkin karşılıkları ile karşılaştırıldığında pro rejeneratif sinyalleri veren fetal microenvironments artan bir yetenek için büyüyen tanıma rağmen decellularization fetal dokularda sadece birkaç çalışmaları5', bildirildi 7 , 18 , 19 , 20 , 21. anlama ECM dynamics yaşlanma sürecinde-ecek var olmak yegane şekil-in hangi, sırayla, daha yüksek verimlilik biomimetic-malzeme gelişimine etkisi olacaktır pro rejeneratif microenvironments tanımlamak çok önemli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar tüm üyelerine Pinto--Ó laboratuvar ilgili kritik tartışma için borçlu bulunmaktadır. Bu eser Programa MIT-Fundação para Ciência e teknoloji (FCT) "CARDIOSTEM-mühendislik kalp doku ve kök hücre tabanlı terapiler kardiyovasküler uygulamalar için" projesi kapsamında tarafından desteklenmiştir (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. FCT dostluk [SFRH/BD/88780/2012] bir alıcı ve M.J.O. bir FCT adam (FCT-araştırmacı 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Biyomühendislik sayı: 145 Decellularization hücre dışı Matriks 3D iskele fetal kalp Yetişkin kalp kalp doku Mühendisliği

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Vitro çalışmalar için 3D benzeri platformlar olarak Fetal ve yetişkin kalp doku karşılaştırılabilir Decellularization Explants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter