Summary
الحقن المباشر حويصلات خارج الخلية المستمدة من السرطان (EVs) ويؤدي إلى إعادة برمجة نخاع العظام دعم تطور الورم؛ ومع ذلك، الخلايا التي تتوسط هذا التأثير غير واضح. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق EV بوساطة الخلايا الجذعية الورم الوسيطة (MSC) التفاعلات في فيفو، يكشف عن دور حاسم للمتعلمين EV MSCs في ورم خبيث.
Abstract
داخل ورم المكروية، تسهم الخلايا الجذعية الوسيطة المقيم أو المعينين (MSCs) التدرج الخبيث في العديد من أنواع السرطان. تحت تأثير إشارات بيئية محددة، يمكن أن تطلق هذه الخلايا الجذعية البالغة الوسطاء paracrine مما يؤدي إلى نمو الأورام المعجل وورم خبيث. تعريف الحديث المتبادل بين الورم و MSCs من الأهمية فهم الآليات الكامنة وراء تطور السرطان، وتحديد أهداف جديدة للتدخل العلاجي.
الخلايا السرطانية تنتج كميات كبيرة من حويصلات خارج الخلية (EVs)، التي يمكن أن تؤثر تأثيراً عميقا في سلوك الخلايا المستهدفة في ورم المكروية أو في مواقع بعيدة. ورم EVs أرفق الجزيئات الحيوية الوظيفية، بما في ذلك الكشف التحريضية والبروتينات (أونكو)، التي يمكن تعليم الخلايا اللحمية لتعزيز السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية، أو للمشاركة في تشكيل المتخصصة قبل المنتشر. في هذه المقالة، يصف لنا تطوير نموذج الماوس السرطان الإكلينيكية التي تمكن من تقييم محدد للحديث EV بوساطة المتبادل بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة. أولاً، يصف لنا بتنقية وتوصيف المركبات الكهربائية يفرز الورم وتقييم استيعاب EV ب MSCs. ونحن ثم جعل استخدام المناعة على أساس حبة متعدد لتقييم تغيير التشكيل الجانبي التعبير سيتوكين MSC الناجمة عن السرطان المركبات الكهربائية. وأخيراً، توضح توليد نموذج الماوس إكسينوجرافت أورثوتوبيك طرحه أوستيوساركوما أن يلخص التفاعل الورم-ماجستير، وإظهار مساهمة المتعلمين EV MSCs لتشكيل الورم النمو وورم خبيث.
لدينا نموذج يتيح الفرصة لتحديد كيفية تشكيل المركبات الكهربائية السرطان بيئة داعمة للورم، وتقييم ما إذا كان حصار الاتصالات EV بوساطة بين الورم و MSCs يمنع تطور مرض السرطان.
Introduction
وورم المكروية تشارك بنشاط في معظم، أن لم يكن كلها، جوانب التقدم توموريجينيسيس والسرطان، بما في ذلك تشكيل ورم خبيث وتطوير المقاومة للتداوي1. هذا يؤكد الحاجة إلى نماذج الماوس سرطان أورثوتوبيك الإكلينيكية التي تسمح لتشريح ستروما الورم معقدة التفاعلات التي تحدث في مكانة الورم.
بين العديد من المكونات الخلوية لورم المكروية، تسهم الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة في تطور السرطان في العديد من أنواع السرطان مثل سرطان الثدي وسرطان البروستاتا، وأورام الدماغ، والورم النخاعي المتعدد و osteosarcoma2 ،3،،من45،،من67. MSCs هي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الموجودة في أنسجة البالغين والجنين المختلفة، بما فيها نخاع العظام والأنسجة الدهنية، والمشيمة، ودم الحبل السري وغيرها8،9. استجابة لإشارات تحريضية تولد السرطان، ترحيل نحو مواقع الورم MSCs وإدماج وورم المكروية والتفريق في نهاية المطاف إلى خلايا السرطان دعم10. هذه MSCs المرتبطة بالسرطان توفر العوامل الأساسية (أي، عوامل النمو، المستقطبات، السيتوكينات، ووسطاء كآبته) لتطور الورم يتصرف على الخلايا السرطانية و سدى المحيطة بها2، 3 , 11 , 12 , 13-في حين تم التحقيق آثار تعزيز الورم MSCs المرتبطة بالسرطان في العديد من النماذج السرطان، الآليات التي بواسطتها برمجة الخلايا السرطانية MSCs على تشكيل السرطان-تعزيز مكانة هي غير مفهومة. هنا يصف لنا الجيل من طراز إكسينوجرافت أورثوتوبيك التي تسمح على وجه التحديد دراسة التفاعل برو ورمي بين خلايا سرطان العظام و MSCs عبر الحويصلات خارج الخلية (EVs).
المركبات الكهربائية حاسمة وسطاء الاتصال بين الخلايا بين الورم والخلايا اللحمية14. المركبات الكهربائية تحمل الجزيئات الحيوية الوظيفية من الخلية الأصلية، بما في ذلك البروتينات والدهون، والكشف التنظيمي. بعد إطلاق سراحه في الفضاء خارج الخلية، هذه الحويصلات يمكن أن تتناولها الخلايا المحيطة بها أو نقلها إلى مواقع بعيدة عن طريق الدم أو الدورة اللمفاوية، ويمكن أن تترك آثاراً عميقة على سلوك الخلية المستهدفة. 15 , 16 , 17 على سبيل المثال، ينتج الإقبال على السرطان المركبات الكهربائية بالخلايا الليفية stromal في تمايز أرومية دعم الأوعية والتعجيل بالورم النمو في فيفو18،19، استيعاب غشائي يمكن تنشيط الأوعية ورم الخلايا وزيادة نفاذية الأوعية الدموية16،20، والتفاعل مع الخلايا المناعية قد تؤدي إلى قمع استجابة مناعية انتيتومور21.
نحن مؤخرا أثبتت، باستخدام نموذج أورثوتوبيك طرحه ماوس إكسينوجرافت من أوستيوساركوما، أن الخلايا السرطانية الإفراج عن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية التي تطالب MSCs للحصول النمط الظاهري برو الورمية والمحترفين المنتشر. هذا التأثير هو سبب تغيير جذري في الشخصية التعبير سيتوكين ماجستير (يشار إلى "ماجستير التعليم")، ويمكن منع الإدارة من الأجسام المضادة مستقبلات انترلوكين-6 العلاجية (إيل-6R)7. عملنا أثبتت أن السرطان المركبات الكهربائية هي المغيرون حاسم لسلوك لجنة السلامة البحرية، مما يوفر الأساس منطقي للنهج المكروية التي تستهدف وقف التقدم osteosarcoma. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق في EV بوساطة الورم. ماجستير تفاعل في فيفو. ويهدف هذا النموذج إلى: 1) على وجه التحديد وتحديد التعديلات التي يسببها EV السرطان من السلوك ماجستير في ورم المكروية، 2) تقييم كيفية إسهام هذا التفاعل إلى نمو ورم العظام وتشكيل ورم خبيث، و 3) دراسة ما إذا كان التدخل في EV بوساطة الحديث المتبادل في فيفو يمنع تطور مرض السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأنسجة الدهنية البشرية لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة التي تم الحصول عليها من قسم الجراحة التجميلية في مستشفى تيرجوي (هيلفرسوم، هولندا) بعد الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية المؤسسية وكتب الموافقة المستنيرة. تم الحصول على MSCs الدهنية الحاملات للتجارة والنقل من إدارة الطب والعلوم الجراحية للأطفال والكبار (جامعة مودينا وريدجو إميليا).
وأجريت تجارب على الحيوانات وفقا للقانون الهولندي على التجارب الحيوانية، والبروتوكول أقرته لجنة التجارب الحيوانية من المركز الطبي في "جامعة فو"، أمستردام، هولندا.
1-عزل يفرز الورم حويصلات خارج الخلية.
- إعداد المنضب EV المصل البقري الجنين (FBS) عن طريق سينتريفوجينج FBS في 70,000 س ز بين عشية وضحاها (16 ساعة)، لا الفرامل، عند 4 درجة مئوية دوار دلو يتأرجح فائقة باستخدام (نتوقع ح 1 للتباطؤ). بعناية بجمع المادة طافية (FBS المستنفد EV) دون الإخلال بيليه. تصفية FBS المستنفد EV مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- إعداد متوسطة الثقافة المنضب EV بتكميل المتوسطة (إيمدم "تعديل دولبيكو" ل Iscove) مع البنسلين يو/مليلتر 100، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، الجلوتامين 2 مم (1 × P/S/G) و 5% FBS المستنفد EV.
- البذور 3 × 106 143B الخلايا في قوارير2 175 سم والثقافة لهم في مستنبت المنضب EV في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. عندما تكون الخلايا روافد 80-90 ٪ (عادة بعد ح 36 إلى 48 ساعة)، جمع المادة طافية من 8 x 175 سم2 قوارير (28 مل في قارورة) لعزل EV.
- قبل إلغاء المادة طافية خلية لإزالة الحطام الخلية وخلايا بالطرد المركزي التفاضلية (سينتريفوجينج المادة طافية للدوران السابق في كل مرة) ووفقا لبروتوكول التالية:
- الطرد المركزي المادة طافية مرتين في 500 غرام x لمدة 10 دقائق.
- الطرد المركزي المادة طافية مرتين في 2000 غ س لمدة 15 دقيقة.
- الطرد المركزي المادة طافية مرتين في 10,000 ز س لمدة 30 دقيقة.
- أداء جميع سينتريفوجيشنز في 4 درجات مئوية مع أقصى تسارع وتباطؤ سرعة إعدادات. بعد كل خطوة، بعناية جمع المادة طافية المحتوية على EV، تاركين حوالي 1 مل. المضي قدما على الفور الخطوة 1.5 أو مخزن المجازين مكيفة المتوسطة في-80 درجة مئوية حتى عزلة EV.
- عزل المركبات الكهربائية التي سينتريفوجينج المتوسطة مكيفة المجازين مرة واحدة في 70,000 س ز ح 1، وبطء الفرامل، عند 4 درجة مئوية في أنابيب الترا--أجهزة الطرد المركزي (الحجم النهائي 38.5 مل/أنبوب) استخدام دوار دلو يتأرجح فائقة.
- بعناية إزالة المادة طافية، ترك حوالي 1 مل خلف، ريسوسبيند الكريات المحتوية على EV في حجم المتبقية وتجمع لهم في كل من أنبوب أولتراسينتريفوجي واحد وإضافة المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) حتى إكمال أنبوب الملء (الحجم النهائي مل 38.5).
- أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 70,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية، دون الفرامل (نتوقع ح 1 للتباطؤ). بعناية إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه وترك 100-200 ميليلتر.
- ريسوسبيند EV-بيليه، وضبط وحدة التخزين النهائي إلى 200 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني (موحدة لجميع EV-العزلة). استخدام إعداد EV فورا أو تخزينها في-80 درجة مئوية حتى استخدام22.
ملاحظة: يمكن تخزين المركبات الكهربائية إلى 6 أشهر في-80 درجة مئوية.
2-EV التوصيف.
يمكن تصور المركبات الكهربائية المنقي بانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)23.
- محضرات EV ميكس مع زيادة متساوية في حجم بارافورمالدهيد 4 ٪ في المخزن المؤقت للفوسفات.
- مش 200 معطف النيكل المغلفة من الكربون فورمفار تيم الشبكات مع 5 ميليلتر من تعليق ف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ثبت العينات EV في شبكات تيم مع جلوتارالديهيدي 1% في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (pH 7.0)، على النقيض من أكسالات اليورانيل (pH 7.0)، وتضمين في خليط من 4% اليورانيل خلات و 2% الميثيل السليلوز بنسبة 1:9 على الجليد.
- إزالة الشبكات مع حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ ولطخة السوائل الزائدة مع أوراق الترشيح لضمان سماكة مناسبة الفيلم الميثيل السليلوز.
- بعد التجفيف، دراسة الشبكات مع انتقال إلكترون مجهر والتقاط الصور مع كاميرا رقمية بالإضافة إلى برنامج الصورة المقابلة.
3-التعليم MSCs بالمركبات الكهربائية المستمدة من الورم.
- إعداد ماجستير الثقافة المتوسطة بتكميل ألفا-الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (ألفا-MEM) مع 4% المنضب EV البشرية "ليستي الصفائح الدموية" (hPL)24والهيبارين (10 U/mL) و 1 × P/S/غ.
ملاحظة: يتم الحصول hPL المستنفد EV على اتباع الإجراء الموضح في القسم 1-1. - بذور 1.4 × 106 الدهنية المشتقة MSCs الواحدة 75 سم2 قارورة والثقافة لهم في متوسط المنضب EV ماجستير-الثقافة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- عند التوصل إلى التقاء 70% الخلايا، إضافة osteosarcoma 143B-أو التحكم في الخلايا البشرية الليفية (hf)-المركبات الكهربائية، 10 ميليلتر EV إعداد/سم2 من قارورة الثقافة. احتضان لمدة 24 ساعة، وإضافة نفس الكمية من المركبات الكهربائية لمدة 6 ساعات إضافية. ملاحظة: تستزرع الليفية البشرية في النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو) 10% FBS والمركبات الكهربائية معزولة كما هو موضح في المقطع 1.
- جمع المادة طافية ماجستير والطرد المركزي 1 x في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية (مع أقصى تسارع وتباطؤ سرعة إعدادات)، نقل إلى أنبوب جديد وتخزين المادة المطهرة طافية في-80 درجة مئوية لتمكين تحليل المستقبل سيتوكين (القسم 5).
- في فيفو تثقيف MSCs الحاملات للتجارة والنقل25 كما هو موضح في المقاطع 3.1 إلى 3.3 تجارب (المادة 6)، وجمع الخلايا وريسوسبيند لهم في برنامج تلفزيوني بتركيز نهائي 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر. الخلايا الحفاظ على الجليد حتى الحقن.
4-EV تدخيل المقايسة.
تصور EV امتصاص MSCs، تسمية المركبات الكهربائية مع صبغ رابط الفلورية الخضراء (جفلد) (متاح تجارياً) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة:
- بإيجاز، إضافة ميليلتر 180 من مخفف للإعدادية EV 200 ميليلتر. تمييع 1 ميليلتر من صبغة جفلد في 50 ميليلتر من مخفف، وإضافة 20 ميليلتر لصبغ المخفف للإعدادية EV المخفف.
- بلطف مزيج من بيبيتينج واحتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- إضافة 5 مل من جيش صرب البوسنة 0.1% في برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب الترا--أجهزة الطرد المركزي وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (الحجم النهائي 38.5 مل/أنبوب).
- الطرد المركزي س 1 في 70,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية، دون الفرامل (نتوقع ح 1 للتباطؤ). بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند المسمى EV-بيليه بحجم نهائي في 200 ميليلتر (ضبط حجم الصوت مع برنامج تلفزيوني).
- إضافة المركبات الكهربائية مسماة إلى ثقافة ماجستير أو تخزينها في-80 درجة مئوية. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، تقييم استيعاب حويصلة بالفحص المجهري الأسفار والتدفق الخلوي7.
5-تقييم MSC سيتوكين التعبير الشخصية.
- لتحديد مقدار متعدد انترلوكين-8 (إيل-8)، مكيفة انترلوكين-1β (إيل-1β)، انترلوكين-6 (إيل-6)، 10-انترلوكين (إيل-10)، وعامل نخر الورم (تنف)، ومستويات البروتين انترلوكين-12 ف 70 (إيل-12 ف 70) في لجنة السلامة البحرية المتوسطة (راجع الخطوة 3، 4)، استخدام سيتوميتريك المتاحة تجارياً حبة الصفيف (CBA) للبشرية السيتوكينات الالتهابية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- بإيجاز، مزيج الخرز التقاط الأجسام المضادة مترافق وإضافتها إلى كل فحص الأنابيب. إضافة تخفيف قياسي سيتوكين أو عينات متوسطة مكيفة للأنابيب.
- إضافة الكاشف الكشف واحتضان 3 ساعات في الرايت
- أغسل حبات مع الحل الغسيل التي تم توفيرها. قياس العينات استخدام سيتوميتير تدفق وتحليل البيانات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
6-جيل طراز الماوس إكسينوجرافت أورثوتوبيك من أوستيوساركوما.
- تسمح الفئران Athymic عارية-Foxn1nu عمره ست الأسبوع، أنثى، التأقلم لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل بدء الإجراءات التجريبية.
- إضافة يوم واحد قبل إجراء العمليات الجراحية والتسكين شبه المنطوق الباراسيتامول لمياه الشرب. تمييع "الحل باراسيتامول للأطفال" (انظر الجدول للمواد) مع الماء للحصول على تركيز نهائي 2 ملغ/مل. استناداً إلى كمية الماء متوسط 150 مل/كغ/يوم، ووزن جسم متوسط من 20 غرام، هذه الجرعة كافية للوصول إلى جرعة من 6 مغ/فأر/يوم (300 ملغ/كغ/يوم).
- مواصلة العلاج مسكن حتى 24 ساعة بعد العملية، أو لفترة أطول إذا كانت الحيوانات تظهر علامات الألم.
- في يوم العملية الجراحية، جمع مثقف لوسيفراس-إيجابية الخلايا 143B (فلك) (تم إنشاؤه مسبقاً بتوصيل لينتيفيرال) التي سينتريفوجينج في 300 غرام x لمدة 10 دقائق وريسوسبيند الخلايا بتركيز 2 × 105 خلايا/ميليلتر في برنامج تلفزيوني. إبقاء تعليق خلية على الجليد إلى 6 ساعات.
- اﻷوتوكﻻف المعدات الجراحية. إعداد وتنظيف منطقة عمل ووضع مقص معقم وملاقط على أوراق عقيمة. عشرون دقيقة قبل إجراء العمليات الجراحية (الخطوة 6.8)، حقن الحيوانات تحت الجلد مع البوبرينورفين (0.05 مغ/كغ، تضعف في المحلول الملحي 0.9 في المائة) كمسكن استخدام 0.5 مل الأنسولين المحاقن (29-قياس الإبرة).
- قبل أنيسثيتيزينج كل الحيوان، ملء حقنه 10 ميليلتر مع على الأقل 1 ميليلتر من تعليق خلية (فلك) 143B مركزة (راجع الخطوة رقم 6، 4).
- تخدير الحيوان مع التخدير استنشاق إيسوفلوراني (2-3% في الأكسجين). التحقق من مستوى التخدير بأصبع معسر الحيوان. عند الحيوان لا تستجيب معسر، أي أنه يتم تخديره من عميق، تطبيق مرهم على العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
- ضع الحيوان على ظهره مع الرأس في قناع تخدير والساقين نحو المشغل. فليكس في الركبة اليسرى. مسح الجلد مع الإيثانول 70% وتطبيق ليدوكائين (2 في المائة) مع تلميح القطن 3 مرات كمسكن محلي.
- استخدام سكين جراحية معقمة لإجراء شق صغير (حوالي 5 ملم) على الجلد فقط تحت الركبة لكشف الساق. حفر ثقب في الساق، حوالي 2 ملم تحت الركبة استخدام حفر تويست الصغرى 0.8 مم. كن حذراً لا لحفر من خلال كلا كورتيسيس الساق.
- حقن 1 تعليق خلية ميليلتر (حوالي 2 × 105 خلايا) ببطء (في حوالي 5 ثوان) في الحفرة باستخدام إبرة مقياس 26. إغلاق الثقب مع معالجة تجميعية غراء الأنسجة لمنع الدفق التعليق.
- إغلاق الجلد بخيوط شعيرات وقطره واحدة من الغراء الأنسجة. السماح استرداد الحيوان في بيئة دافئة جيدا (استخدام مصباح حرارة). لا تترك الحيوانات غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. إلا بعد الحيوانات هي تعافي تماما من التخدير، إعادتها إلى الأقفاص الخاصة بهم.
- حقن التطعيم الورم، بعد يومين من EV المتعلمين أو MSCs السذاجة الحاملات للتجارة والنقل (106 خلايا في 100 ميليلتر PBS، راجع الخطوة 3، 5) عن طريق الوريد مع حقنه الأنسولين 0.5 مل في هذا السياق ذيل من الفئران.
- تتبع نمو الورم بالإضاءة الحيوية التصوير26 مرتين في أسبوع. وتحقيقا لهذه الغاية، إدخال القائمة الفئران مع 150 ميليلتر د-لوسيفرين (30 ملغ/مل) مع حقنه الأنسولين. عشرة دقيقة بعد الحقن، ضع الحيوانات في الإضاءة الحيوية نظام تصوير وقياس الفوتون-التدفق التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا السرطانية.
- وباﻹضافة إلى ذلك، قياس القطر من العظام-الورم الرئيسي مع قدمه ذات الورنيّة. ويقدر حجم الورم (في ملم3) قبل العرض × الطول2 × 0.5.
- ملاحظة: يتم تعريف نقاط النهاية إنسانية كقطر الورم > فقدان الوزن أو 15 ملم > 15%.
7-تقييم عدد العقيدات الرئة
- عندما يصل أحد الحيوانات إلى نقطة النهاية إنسانية محددة في الخطوة 6، 14 (في حوالي 3-4 أسابيع)، إنهاء التجربة وجمع وتحليل جميع الأنسجة ذات الصلة.
- عشرة دقيقة قبل يوثانيزيشن، حقن 150 ميليلتر د-لوسيفرين (30 ملغ/مل) مع حقنه الأنسولين 0.5 مل.
- تخدير الحيوانات مع التخدير استنشاق isoflurane (راجع الخطوة 6.7). تأكيد عمق التخدير بسبب غياب ردود فعل الماوس إلى أخمص القدمين معسر. Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم27.
- جمع الرئتين والكبد والطحال والكلى باستخدام مقص معقم وملاقط. تغسل الأجهزة في برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الدم ووضعها على طبق بيتري.
- ضع طبق بيتري مع الأجهزة في الإضاءة الحيوية نظام التصوير. قياس الإشارات الإضاءة الحيوية في كلا الجانبين من الأجهزة. فورا بعد قياس، يغرق الأجهزة في 4% فورمالين ثبت لهم (24-72 ساعة، في RT) للتحليل النسيجي في المستقبل.
- معالجة الصور التي يتم الحصول عليها مع برامج التصوير المناسبة بالعتبة اليدوي. حساب العدد العقيدات الرئة في كل صورة. حساب العدد الإجمالي للعقيدات الرئة على كلا الجانبين من الرئتين.
8-نسيجية تحليل
- التحليل النسيجي لانسجة الرئة:
- تضمين أجهزة ثابتة الفورمالين في البارافين وإعداد 6 شرائح الأنسجة ميكرومتر.
- ديبارافيناتي أنسجة الرئة الشرائح وإجراء استرجاع مستضد المغلي عليهم لمدة 15 دقيقة في المخزن المؤقت لسترات 0.01 متر (الرقم الهيدروجيني 6).
- احتضان الشرائح أفقياً في درجة حرارة الغرفة مع فيمنتين الإنسان المضادة الأجسام المضادة (200 ميكروغرام/مل) المخفف 1:150 في جسم-مخفف (متاح تجارياً)، وفيما بعد مع جسم التعليم الثانوي، المسمى برنامج الصحة الإنجابية (0.5 ملغ/مل، وتمييع 1: 500). وصمة عار الأنسجة مع 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) وتلطيخ العداد الهيماتوكسيلين.
- مراقبة الشرائح الأنسجة الملطخة مجهر بصري بالإضافة إلى الكاميرا المقابلة والصور والبرمجيات باستخدام.
- لتقييم وجود MSCs الحاملات للتجارة والنقل في تيبياس الماوس:
- ديكالسيفي تيبياس في حمض الإيثيلين (يدتا) 0.24 م، الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4. تحديث المخزن المؤقت يدتا كل يوم حتى العظام تصبح مرنة (حوالي أسبوع واحد).
- يذوي tibias والتسلل منها مع البارافين. تضمين تيبياس (بما في ذلك الأنسجة osteosarcoma) في كتل البارافين.
- استخدم مبضع لإعداد 6 مقاطع البارافين ميكرومتر. وضع المقاطع البارافين على الشرائح الزجاجية. بعد التجفيف، تخزين الشرائح بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- إجراء استرداد الحرارة بوساطة مستضد استخدام سترات المخزن المؤقت (انظر 8.1.2) ووصمة عار الأنسجة مع الأضداد المضادة-التجارة والنقل (كامل أنتيسيروم) في إضعاف 1:900 في جسم مخفف. كونتيرستين الأنسجة مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
- نلاحظ شرائح الأنسجة مجهر الأسفار بالإضافة إلى برنامج التصوير المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، فإننا استكشاف قدرة يفرز osteosarcoma المركبات الكهربائية لتثقيف MSCs نحو النمط الظاهري برو الورمية والمحترفين المنتشر. ونحن تبين أن الخلايا osteosarcoma الإفراج عن المركبات الكهربائية مثل اكسوسومي التي يتم استيعابه من MSCs. نحن قياس تغيير التشكيل الجانبي التعبير سيتوكين MSC الناجمة عن السرطان المركبات الكهربائية، وتقييم أثر MSCs EV المتعلمين على نمو الورم وتشكيل ورم خبيث. التمثيل العام لتصميم الدراسة يتضح في الشكل 1.
المركبات الكهربائية الصادرة عن الخلايا osteosarcoma 143B أو الليفية البشرية عنصر تحكم تم تنقيته بالطرد المركزي التفاضلي. وأكد نقاء EV الميكروسكوب الإلكتروني، التي كشفت عن أن الأعمال التحضيرية الواردة أساسا حويصلات قطرها يتراوح بين 40-100 نانومتر (الشكل 2أ). تقييم ما إذا كانت المركبات الكهربائية السرطان يتفاعل مع MSCs، المسمى الحويصلات مع صبغة رابط محبتين الفلورية الخضراء (جفلد)، والمحتضنة لهم بين عشية وضحاها مع الخلايا المستهدفة. بالفحص المجهري fluorescence لاحظنا كفاءة امتصاص EV MSCs (الشكل 2ب). وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل التدفق الخلوي أن EVs osteosarcoma والتحكم يتم استيعابه بكفاءة مماثلة (الشكل 2-ج). للتحقيق في ما إذا كانت المركبات الكهربائية osteosarcoma تغيير خصائص immunomodulatory MSCs، استخدمنا المناعة متعدد سيتوكين المستندة إلى حبة، التي أظهرت أن تحديد الورم المركبات الكهربائية إلى زيادة إضعاف في إنتاج 8 إيل وايل-6 مقارنة مع البشرية تنتجها الخلايا الليفية مراقبة المركبات الكهربائية (الشكل 2د، ه).
للتحقيق في ما إذا كانت المركبات الكهربائية osteosarcoma تثقيف MSCs تعتمد النمط الظاهري برو الورمية والمحترفين المنتشر، استخدمنا طرحه، أورثوتوبيك إكسينوجرافت ماوس نموذج أوستيوساركوما. أجريت جميع التجارب على الحيوانات بعامل واحد. تم زرع خلايا فلك 143B المنتشر في الساق athymic الفئران عارية، وبعد يومين، تعرضت الفئران أوستيوساركوما إكسينوجرافتيد لإدارة واحدة بروتينات فلورية خضراء-إيجابية المتعلمين EV MSCs. الفئران تلقي MSCs السذاجة (غير المتعلمين) أو لا MSCs واستخدمت كمجموعات المراقبة. لا الحيوانات توفي قبل وصف نقاط النهاية. أظهرنا بقياس قدمه ذات الورنيّة وتصوير الإضاءة الحيوية (BLI) أن يعامل الفئران مع MSCs EV المتعلمين قد تسارع نمو الأورام بالمقارنة مع مجموعات التحكم (الشكل 3أ). صور الممثل لحجم الورم من كل ذراع العلاج مبينة في الشكل 3ج. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن إدارة رابعا واحد من المتعلمين MSCs يؤثر على تطور الورم أقرب 10 يوم بعد التلقيح (الشكل 3ب). وباﻹضافة إلى ذلك، أربعة أيام بعد الحقن المنهجية للمتعلمين/السذاجة MSCs معربا عن التجارة والنقل (الشكل 4أ)، فإننا يمكن أن تصور معربا عن بروتينات فلورية خضراء الخلايا في نخاع العظام (الشكل 4ب) وفي الأنسجة السرطانية (الشكل 4 ج)، مما يدل على ماجستير صاروخ موجه إلى موقع الورم.
السابقين فيفو وأظهر تحليل BLI للرئتين والكبد والكلى والطحال (البيانات لا تظهر) تكوين العقيدات الرئة حصرا في الرئتين في الفئران المعاملة جميع الأسلحة (الشكل 4د-F). لافت للنظر، مما يوحي بأن داخل ورم المكروية المتعلمين الفئران تلقي تعليما EV MSCs وكان أعلى عدد من الانبثاث الرئة مقارنة مع الفئران التي تلقي غير المتعلمين MSCs أو لا MSCs (الشكل 4ز)، MSCs الزيادة المنتشر إمكانات أوستيوساركوما الخلايا في فيفو7.
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي لتصميم الدراسة. يتم تعليم البشرية MSCs الأولية مع المركبات الكهربائية المعزولة من الخلايا المستزرعة osteosarcoma المنتشر (143B). يتم تقييم نقاء EV السرطان بالمجهر الإلكتروني، واستيعاب MSCs هو متصور بالفحص المجهري الأسفار وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. تقييم التغييرات في التشكيل الجانبي التعبير سيتوكين ماجستير سيتوميتريك حبة الصفيف (CBA). لتحديد دور EV المتعلمين يتم حقن ماجستير في نمو الورم وتشكيل ورم خبيث، والفئران الحاملة osteosarcoma مع المتعلمين EV (أو السذاجة) ماجستير. نمو الورم يتبع بتصوير الإضاءة الحيوية (BLI) وقياس قدمه ذات الورنيّة، بينما يتم تقييم تشكيل ورم خبيث في نقطة النهاية التجريبية ب السابقين فيفو BLI والتحليل النسيجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تنقية المركبات الكهربائية وتفاعلها مع MSCs-(أ) انتقال الميكروسكوب الإلكتروني صورة مجهرية من المركبات الكهربائية المعزولة من الخلايا 143B (مقياس بار: 100 nm). (ب) "امتصاص جفلد" المسمى 143B EVs من MSCs التي يقيمها fluorescence مجهرية (شريط الحجم: 10 ميكرون). (ج) "استيعاب جفلد" المسمى 143B المركبات الكهربائية (برتقالي) أو التحكم (تنتجها الخلايا الليفية البشرية، ذات التردد العالي) المركبات الكهربائية (الأخضر) من MSCs كما حللت بالتدفق الخلوي. متعدد (د) الكشف عن السيتوكينات الالتهابية في supernatants MSCs التي تتعرض إلى 143B (EV 143B-ماجستير) أو التردد المركبات الكهربائية (hf. ماجستير EV) بمصفوفة حبة سيتوميتريك. 143B-ماجستير التعبير عن مستويات أعلى من 6 إيل وايل-8 مقارنة بالتحكم (غير المعالجة والتردد تعامل EV) MSCs. تشير الخطوط المنقطة إلى التحول في إنتاج سيتوكين. (ه) 8 إيل وايل-6 البروتين تركيز وسائط الإعلام المكيفة MSCs EV تعامل كتحليل مجموعة حبة سيتوميتريك، أعرب عن إضعاف التعريفي بالنسبة لعنصر التحكم غير المعالجة. يتم التعبير عن البيانات يعني ± التنمية المستدامة، n = 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . طرحه، أورثوتوبيك إكسينوجرافت الماوس طراز أوستيوساركوما. (أ) تقدير حجم الورم باستخدام قياسات قدمه ذات الورنيّة، ونمو الورم (ب) تقاس بالإضاءة الحيوية التصوير (BLI). يتم التعبير عن حجم الورم كالتمويه فوتون (الفوتونات/sec). ف < 0.01، ماجستير غير المتعلمين (n = 6) مقابل تعليم ماجستير (n = 6)، مزاوج اختبار t. يتم التعبير عن البيانات يعني ± sem. (ج) الممثل BLI الصور من الفئران بأورام osteosarcoma المنشأة (اللوحة العلوية). مقياس ألوان شريط يتراوح بين 7.7 × 107 (أرجواني) إلى 2.6 × 108 (أحمر) الفوتونات/sec. في أسفل اللوحة، هو تصور منطقة الورم دون تراكب BLI. تشير الأسهم إلى معظم الورم. تغيير حجم أشرطة: 0.6 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التصوير MSCs و السابقين فيفو أنسجة الرئة. (أ) Fluorescence مجهرية الصورة الإيجابية بروتينات فلورية خضراء مثقف الدهنية المستمدة من MSCs (أخضر). (ب) الفلورة تلطيخ MSCs الحاملات للتجارة والنقل في نخاع العظام (ج) في أنسجة الورم من الفئران المستفيدة من لجنة السلامة البحرية (الأخضر: MSCs، الأزرق: DAPI الملون الأنوية؛ مقياس بار 10 ميكرومتر). (د-و) السابقين فيفو الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) تبين ارتفاع عدد البؤر المنتشر في الفئران يتلقون تعليما EV MSCs (و) بالمقارنة مع الفئران التي تلقي السذاجة ماجستير لا لجنة السلامة البحرية (د)أو (ه) . شريط مقياس اللون يتراوح من 1 × 106 (الأرجواني) إلى 1.5 × 106 (أحمر) الفوتونات/sec. (ز) التحديد الكمي لعدد خبيث الرئة كما تصور ب BLI (خطوط تمثل المتوسط؛ * p < 0.05، الاختبار t وحيد الطرف). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يغير يفرز الورم حويصلات خارج الخلية (EVs) فسيولوجيا الخلايا الوسيطة المحلية والبعيدة إيجاد بيئة داعمة لورم. هنا يصف لنا توليد نموذج الماوس الإكلينيكية osteosarcoma يسمح التشريح EV بوساطة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في فيفو. نظهر أن يعزز حقن النظامية من الأورام البشرية MSCs المتعلمين EV في الفئران التي تحمل osteosarcoma تكثيفها بقوة تشكيل النمو وورم خبيث سرطان بتفعيل مسار الإشارات إيل-6/STAT37.
وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن المركبات الكهربائية السرطان يمكن أن تساعد في تشكيل مكانة قبل المنتشر بتغيير سلوك الخلايا اللحمية المحلية أو المشتقة من نخاع العظم16،،من2829. وأجريت هذه الدراسات معظمها بالحقن حويصلات المستمدة من سرطان في الماوس المستفيدة، مما يزيد من تعقيد تحديد أنواع الخلايا المسؤولة عن آثار تعزيز الورم مباشرة. لدينا بروتوكول، تعليم MSCs مع السرطان المركبات الكهربائية التي يحدث في المختبر قبل الحقن MSC. هذا النهج يسمح معالجة مساهمة محددة ورم-ماجستير الحديث المتبادل لتطور السرطان، ويقلل من التباس الآثار غير المباشرة للسرطان المركبات الكهربائية على المكونات الأخرى للبيئة المحلية أو النظمية.
لتقييم ما إذا كانت MSCs المتعلمين الصفحة الرئيسية إلى موقع الورم، نحن عناصره حقن MSCs بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية في هذا السياق ذيل من الفئران الحاملة للورم. حقن الوريد الذيل حاسمة، لكن من الناحية الفنية تحدي خطوة في العديد من البروتوكولات التجريبية. لضمان الحد الأدنى من الاختلاف بين الحقن ينبغي أن يؤديها الإجراء من المحققين ذوي الخبرة. يمكن تأكيد الإدارة عن طريق الحقن الوريدي الصحيحة بصريا عن طريق مراقبة حركة السوائل عن طريق الوريد. إذا كانت تظهر منطقة بيضاء في الذيل أو مواجهة المقاومة أثناء الحقن، لم يتحقق الوصول إلى الأوعية الدموية. في هذه الحالة يجب تكرار هذا الإجراء بإدخال الإبرة أعلاه أول موقع الحقن. نظراً لسهولة الرئيسية MSCs شأن الورم، يمكن تأكيد الإدارة الناجحة من MSCs (بروتينات فلورية خضراء-إيجابي) تلطيخ الفلورة ورم الأنسجة ونخاع العظام أربعة أيام بعد الحقن (الشكل 4ب، ج).
ونحن تبين أن السرطان يفرز المركبات الكهربائية الحث النمط الظاهري داعمة لاستئصال ورم في MSCs بتغيير إنتاج السيتوكينات الالتهابية. هذا الاستنتاج ذات الصلة لا سيما منذ التحوير المناعي والورم المناعي التهرب من الآليات الرئيسية في تطور خبيث. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن السرطان قد المركبات الكهربائية مباشرة، كما ورد بدراسات مستقلة21،،من3031،،من3233، أو غير مباشر (عن طريق MSCs) تؤثر في المناعة الفطرية أو التكيف مكونات. ومع ذلك، استخدام نموذج إكسينوجرافت (المناعة) يحد من إمكانية التحقيق في هذا الجانب من المركبات الكهربائية. وهكذا، تحتاج إلى نهج مماثلة في نماذج الماوس الأشخاص أو أنسنة يتعين القيام بها لتحديد دور التفاعلات EV بوساطة الورم-ماجستير-المناعية الخلية في سرطان.
وأخيراً، لأنه يمكن تعيين MSCs من نخاع العظام أو الأنسجة المصادر الأخرى للأورام، لدينا أسلوب لا يقتصر على دراسة سرطان العظام، ولكن يمكن تطبيقها على التحقيق في دور الورم MSCs EV-تلقي تعليمة في عدة أنواع السرطان2، 3 , 4 , 5 , 6، كالدراسات التي أجريت مؤخرا في نماذج سرطان الجلد وسرطان الغدد الليمفاوية تأكيد34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد على زمالة بالإيطالية رابطة كل سول ريشيركا la كانكرو (التحكيمية) الممول من الاتحاد الأوروبي، Baglio ر. س. وبالإضافة إلى ذلك، تلقي هذا المشروع التمويل من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار بموجب المنحة ماري سكلودوفسكا-كوري لا 660200 (إلى Baglio ر. س).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
