Summary
골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
종양 microenvironment 내 거주 또는 모집 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 여러 암 종류에 악성 진행에 기여 한다. 특정 환경 신호 영향이 성인 줄기 세포 paracrine 중재자 가속된 종양 성장 및 전이 해제할 수 있습니다. 종양 및 MSCs 사이 누화를 정의 암 진행을 기본 메커니즘을 이해 하 고 치료 적 개입에 대 한 새로운 목표를 식별 하려면 기본 중요성 이다.
암 세포 생성 높은 양의 extracellular 소포 (EVs), 뿌리깊은 대상 세포 종양 microenvironment에 또는 먼 사이트에서의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 종양 EVs 염증 성 RNAs 등 (onco) 단백질, 암 세포의 전이 행동을 강화 하거나 미리 전이성 틈새 시장 형성에 참여 stromal 세포 교육 수 기능 생체를 묶습니다. 이 문서에서는, 우리는 EV 중재 누화 종양 사이의 중간 엽 줄기 세포의 특정 평가 가능 하 게 하는 전 임상 암 마우스 모델의 개발을 설명 합니다. 첫째, 우리는 정화 및 종양 분 비 EVs의 특성화 및 MSCs에서 EV 국제화 평가 설명합니다. 우리 다음 게 암 EVs에 의해 유도 된 다중 구슬 기반 immunoassay MSC cytokine 식 프로필 변경을 평가 하의 사용. 마지막으로, 우리이 종양-msc와 상호 작용 하는 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 기여를 표시.
우리의 모델 암 EVs 종양 지원 환경 형성 하는 방법을 정의 하 고 종양 및 MSCs 간의 EV 중재 통신의 봉쇄 암 진행을 방지 하는 여부를 평가 기회를 제공 한다.
Introduction
종양 microenvironment tumorigenesis 및 암 진행, 전이 형성 등의 치료제1저항 개발의 대부분, 그렇지 않으면 모두, 측면에서 적극적으로 참여 합니다. 이 종양 틈새에서 발생 하는 복잡 한 종양-기질 상호 작용의 해 부를 수 있는 전 임상 orthotopic 암 마우스 모델에 대 한 필요성을 강조 하고있다.
종양 microenvironment의 많은 세포 구성 성분 중에서 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 강하게 유방암, 전립선 암, 뇌종양, 다 발성 골 수 종, 및 다리2 등 여러 암 종류의 암 진행에 기여 ,3,,45,,67. MSCs는8,9골 수, 지방 조직, 태 반, 탯 줄 혈액, 등을 포함 하 여 다양 한 성인 그리고 태아 조직에 있는 multipotent 줄기 세포 이다. 염증 신호 암 생성에 대 한 응답, MSCs 종양 사이트 쪽으로 마이그레이션할 종양 microenvironment에 통합 고 궁극적으로 암 지원 셀10으로 차별화 합니다. 이러한 암 관련 된 MSCs 종양 진행 행동 종양 세포에 및 주변 기질2, 에 대 한 필수적인 요인 (즉, 성장 요인, 발산, cytokines, 면역 중재자) 제공 3 , 11 , 12 , 13. 동안 종양 증진 효과 암 관련 된 MSCs의 수많은 암 모델에서 조사 되어, 종양 세포는 암 홍보 틈새를 형성 하는 MSCs 재 설 정할 메커니즘 제대로 이해 하는. 여기는 orthotopic이 종이 식 모델을 구체적으로 extracellular 소포 (EVs) 통해 뼈 암 세포와 MSCs의 프로 tumorigenic 상호작용 연구의 생성에 설명 합니다.
EVs는 종양과 stromal 세포14사이 세포 커뮤니케이션의 중요 한 중개자. EVs의 원산지, 단백질, 지질, 및 규제 RNAs를 포함 하 여 세포의 기능 생체 나. 일단 세포 외 공간에서 발표,이 소포 주변 세포에 의해 채택 될 수 있다 또는 혈액 이나 림프 순환 통해 먼 사이트에 고 뿌리깊은 대상 셀 동작에 영향을 미칠 수 있습니다. 15 , 16 , 17 예를 들어, stromal 섬유 아 세포에 의해 암 EVs의 신생을 지원 하 고 종양 성장 을 vivo에서18,19, 내 피에 의해 국제화 가속 myofibroblast 차별화에 발생할 수 있습니다. 셀 수 있는 종양 혈관 신생을 자극 하 고 증가 혈관 침투성16,20, 그리고 면역 세포와의 상호 작용21antitumor 면역 반응 억제로 이어질 수도 있습니다.
우리는 최근 시연, 종양 세포 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형 얻으려고 MSCs 프롬프트 EVs의 높은 금액을 출시, 다리의 발광 orthotopic이 종이 식 마우스 모델을 사용 하 여. 이 효과 MSC cytokine 식 프로 파일 ("MSC 교육" 라고도 함)에 있는 극적인 변화 때문 이며 치료 인터 루 킨-6 수용 체 (IL-6R) 항 체7의 행정에 의해 방지 될 수 있다. 우리의 일 암 EVs 다리 진행 중단 microenvironment 대상 접근에 대 한 근거를 제공 하는 MSC 행동의 중요 한 변조기는 설명 했다. 여기, 우리는 EV 중재 종양-MSC 상호 작용에서 vivo에서조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델을 것입니다: 1) 특히 종양 microenvironment 암 EV 유도 변경 MSC 행동의 정의 2) 어떻게이 상호 작용에 기여 뼈 종양 성장 및 전이 형성, 그리고 연구 3) 방해 하는 여부를 평가 vivo에서 EV 중재 누화 암 진행을 방지합니다.
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Protocol
중간 엽 줄기 세포 분리에 대 한 인간의 지방 조직 기관 윤리 위원회에 의해 승인 후 Tergooi 병원 (쉼, 네덜란드)의 성형 수술의 부서에서 얻은 고 서 면 통지 해준 동의. GFP-긍정적인 많은 MSCs는 어린이 성인 (모 데 나 대학와 레지오 에밀리 아)에 대 한 부의 의료 및 외과 과학에서 얻은 했다.
동물 실험, 동물 실험에 네덜란드 법률에 따라 수행 하 고 프로토콜 VU 대학 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드의 동물 실험에 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 세포 외 소포 종양 분 비의 격리.
- FBS 70000 x g 하룻밤 사이에 (16 시간), 초 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에서 아무 브레이크 centrifuging EV 고갈 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 준비 (기대 감속에 대 한 1 시간). 신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 (EV 고갈 FBS)를 수집 합니다. 0.22 μ m 필터 EV 고갈 FBS를 필터링 합니다.
- Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2mm 글루타민을 보완 하 여 EV 고갈 문화 매체를 준비 (1 x P/S/G) 및 5% FBS EV 고갈.
- 175 cm2 플라스 크에 3 x 106 143B 셀 씨 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 EV 고갈 문화 매체에 문화. 셀 (일반적으로 48 h 36 h) 후 80-90% 합칠 때, EV 격리는 상쾌한 8 x 175 cm2 플라스 크 (28 mL/플라스 크)에서 수집 합니다.
- 미리 다음 프로토콜에 따라 차등 원심 (말합니다 때마다 상쾌한 centrifuging)에 의해 세포 및 세포 잔해를 제거 하려면 셀 상쾌한 취소:
- 10 분 동안 500 x g에서 두번 상쾌한 원심
- 2000 x g 15 분에 두 번 상쾌한 원심
- 10000 x g 30 분에 두 번 상쾌한 원심
- 최대 가속 및 감속 속도 설정으로 4 ° C에서 모든 centrifugations를 수행 합니다. 각 단계 후 신중 하 게 포함 하는 EV 상쾌한, 약 1 mL를 남겨두고 수집 합니다. 1.5 또는 상점을 사전 허가 조건-80 ° C에서 매체 EV 절연까지 바로 진행 합니다.
- 사전 허가 조건된 매체 한번 70000 x g 1 h에서 centrifuging 여 EVs를 격리, 천천히 브레이크, 울트라 진동 물통 회전자를 사용 하 여 울트라 원심 분리기 튜브 (최종 볼륨 38.5 mL/튜브)에 4 ° C에서.
- 신중 하 게 나머지 볼륨에 뒤에, resuspend 약 1 mL EV 포함 된 펠 릿을 떠나 상쾌한 제거, 1 개의 ultracentrifuge 관에 모두 수영장 및 완벽 한 튜브 작성까지 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 (최종 볼륨 38.5 mL).
- 브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 다시 한번 원심 분리기 (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 100-200 µ L을 남겨두고.
- Resuspend EV-펠 릿을 PBS (모든 EV-격리에 대 한 표준화)와 200 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 즉시 EV 준비를 사용 하거나 사용22까지-80 ° C에 저장 합니다.
참고: EVs 저장 될 수 있다-80 ° c.에 6 개월
2. EV의 특성화
순화 EVs는 전송 전자 현미경 (TEM)23에 의해 구상 될 수 있다.
- 인산 염 버퍼에서 4 %paraformaldehyde 동등한 양으로 혼합 EV preps.
- 코트 200 EV 정지 실 온에서 20 분의 5 µ L로 니켈 가장 격자 Formvar 카본 코팅 메쉬.
- 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.0), uranyl oxalate (pH 7.0) 대비 1%도 함께 가장 격자에 EV 샘플 흥분 하 고 4 %uranyl 아세테이트 및 2% 메 틸 셀 룰 로스 얼음에 1:9 비율에서의 혼합물에 포함.
- 스테인레스 스틸 루프와 격자를 제거 하 고 필터 종이 메 틸 셀 룰 로스 필름의 적절 한 두께 보장 하기 위해 초과 하는 액체를 되 리.
- 건조 후, 그리드 전송 전자 현미경으로 검사 하 고 해당 이미지를 소프트웨어를 결합 하 여 디지털 카메라 캡처 이미지.
3. 종양에서 파생 된 EVs에 의해 MSCs의 교육.
- 4 %EV 고갈 인간 혈소판 Lysate (hPL)24, 헤 파 린 (10 U/mL)와 1 알파-최소 필수 매체 (알파-MEM)을 보완 하 여 MSC 문화 매체를 준비 P/S/G. x
참고: EV 고갈 hPL 1.1 섹션에 설명 된 절차에 따라 얻을 수 있다. - 시드 1.4 x 106 75 cm2 플라스 크 당 MSCs 지방이 많은 파생 하 고 37 ° C에서 5 %CO2 인큐베이터에서 EV 고갈 MSC 문화 매체에 문화.
- 때 셀 70% 합류에 도달, 추가 143B 다리-또는 인간의 섬유 아 세포 (hf) 제어-EVs, 10 µ L EV 준비/cm2 문화 플라스 크의. 24 시간 동안 incubate 고 추가 6 시간에 대 한 EVs의 동일한 금액을 추가 합니다. 참고: 인간의 섬유 아 세포에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 교양 10 %FBS EVs 섹션 1에서에서 설명한 대로 격리 됩니다.
- MSC 상쾌한 수집, 1 x 4 ° C (최대 가속 및 감속 속도 설정)에서 5 분 동안 500 x g에서 원심, 새로운 튜브에 전송 및 저장 미래의 cytokine 분석 (섹션 5)을-80 ° C에서 지운된 상쾌한.
- 비보에 대 한 실험 (단원 6), 섹션 3.1을 3.3에에서 설명 된 대로 GFP-긍정적인 MSCs25 교육, 수집 셀 하 고 주입까지 얼음에 100 µ L. 계속 셀 당 106 셀의 최종 농도에 PBS에 그들을 resuspend.
4. EV 국제화의 시험
MSCs에서 EV 글귀를 시각화 하려면 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 링커 염료 (GFLD) (상용)와 EVs 레이블:
- 간단히, 200 µ L EV 준비에 희석제의 180 µ L를 추가 합니다. 희석제의 50 µ L에서 GFLD 염료의 1 µ L를 희석 하 고 추가 20 µ L 희석된 염료의 희석된 EV 준비.
- 부드럽게 pipetting으로 혼합 하 고 어둠 속에서 실 온에서 3 분 동안 품 어.
- PBS에서 0.1 %BSA 5 mL을 추가 하 고 울트라-원심 분리기 관에 전송 PBS (최종 볼륨 38.5 mL/튜브) 튜브를 채울.
- 원심 브레이크 없이 4 ° C에서 1 시간에 대 한 70000 x g에서 1 x (기대 감속에 대 한 1 시간). 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 200 µ L의 최종 볼륨에서 레이블이 EV-펠 릿 resuspend (PBS 가진 볼륨 조절).
- MSC 문화를 레이블이 EVs를 추가 하거나-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 야간 보육, 후 형광 현미경 검사 법에 의해 소포 국제화를 평가 하 고 flow cytometry7.
5입니다. MSC Cytokine 식 프로필의 평가입니다.
- 인터 루 킨-8 (IL-8)의 다중 정량화, 인터 루 킨-1β (IL 1β), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 인터 루 킨-10 (IL-10), 종양 괴 사 인자 (TNF) 및 MSC에서 인터 루 킨-12 p 70 (IL-12 p 70) 단백질 수준 조절 매체 (단계 3.4 참조) 사용 하는 상업적으로 사용할 수 있는 cytometric 구슬 배열 (CBA) 제조업체의 지침에 따라 인간의 염증 성 cytokines에 대 한.
- 간단히, 항 체 활용 된 캡처 구슬 혼합을 모든 분석 결과 튜브를 추가 합니다. Cytokine 표준 희석 또는 조건된 중간 샘플 튜브를 추가 합니다.
- 검출 시 약을 추가 하 고 실시간에 3 시간을 품 어
- 워시 제공 된 세척 솔루션 비즈. 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 측정 하 고 제조업체의 지침에 따라 데이터를 분석.
6. 다리의이 종이 식 Orthotopic 마우스 모델의 세대.
- 6 주 오래 된, 여성, Athymic 누드-Foxn1nu 쥐 실험 절차를 시작 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 순응을 허용 합니다.
- 1 일 peri 요원으로 수술 전과 진통 식용 수에 해 열을 추가 합니다. "아이 들을 위한 해 열 솔루션" 희석 ( 재료의 표참조) 2 mg/mL의 최종 농도를 물으로. 150 mL/kg의 평균 물 섭취 량에 따라/일, 20 g의 평균 몸 무게,이 복용량은 6 밀리 그램의 복용량에 도달 / 마우스 충분 한 일 (300 m g/k g/일).
- 수술 후, 또는 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 더 이상 24 시간까지 진통 치료를 계속 합니다.
- 수술 당일 10 분에 대 한 300 x g에서 centrifuging 여 교양된 luciferase 양성 (Fluc) 143B 셀 (이전 lentiviral 변환에 의해 생성 된)를 수집 하 고 PBS에서 2 x 105 셀 / µ L의 농도에서 세포를 resuspend. 6 시간 얼음에 세포 현 탁 액을 유지.
- 압력솥 수술 장비입니다. 준비 및 작업 영역을 청소 하 고 소독된가 위 핀셋 살 균 시트에 배치. 20 분 전에 수술 (6.8), 단계 주입 동물 피하 buprenorphine (0.05 mg/kg, 0.9% 식 염 수에 희석) 0.5 mL 인슐린 주사기 (29 게이지 바늘)을 사용 하 여 진통제로.
- 각 동물을 마비 직전 채워 10 µ L 주사기 집중된 (Fluc) 143B 셀 서 스 펜 션의 1 µ L (단계 6.4 참조).
- Isoflurane 흡입 마 취 (산소에 2-3%)와 함께 동물 anesthetize 발가락 꼬 집는 동물에 의해 마 취의 수준을 확인 합니다. 동물을 곤란 하 게, 즉, 그것은 깊은 마 취에 반응 하지 않는 연 고 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용.
- 동물 마 취 마스크에 머리와 운영자 쪽으로 다리의 뒷면에 위치. 왼쪽된 무릎을 플렉스. 70% 에탄올으로 피부를 닦 고 3 번 로컬 진통제로 목화 팁 lidocaine (2%)을 적용.
- 무 균 수술 칼을 사용 하 여 노출 경골을 무릎 바로 아래 피부에 작은 절 개 (약 5 m m)를 확인. 약 2 m m 0.8 m m 마이크로 트위스트 드릴을 사용 하 여 무릎 아래 경골에 작은 구멍을 드릴 합니다. 두 경골 외피가 드릴스루할 수 없습니다 주의 해야 합니다.
- 26-게이지 바늘을 사용 하 여 구멍에 천천히 (약 5 초)에서 1 µ L 세포 현 탁 액 (약 2 × 105 셀)를 주사. 현 탁 액의 역류를 방지 하기 위해 조직 접착제의 작은 물방울으로 구멍을 닫습니다.
- Monofilament 봉합 및 조직 접착제 한 방울 피부를 닫습니다. 잘가 열된 환경 (열 램프 사용)에서 동물 복구 하자. 두지 마십시오 동물 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지. 동물 마 취에서 완전히 복구는, 후에 그들의 자신의 감 금 소에 그들을 반환 합니다.
- 종양 접종 후 2 일 교육 EV 또는 순진한 GFP-긍정적인 MSCs를 주입 (100 µ L PBS에 106 세포 단계 3.5 참조) 쥐의 꼬리 정 맥에 0.5 mL 인슐린 주사기와 정 맥.
- 생물 발광 영상26 일주일에 두 번 여 종양의 성장에 따라. 이 위해, 150 µ L 마우스 i.p. 주입 D-인슐린 주사기 (30 mg/mL)를 소. 주입 후 10 분 이미징 시스템 생물 발광에 동물을 종양 세포에 의해 생성 된 광자 유량을 측정.
- 또한, 캘리퍼스 기본 뼈 종양의 직경을 측정 합니다. (M m3)에 종양 볼륨 x 0.5 x 길이2 폭으로 추정 된다.
- 참고: 인간적 끝점 종양 직경으로 정의 된다 > 15 m m 또는 체중 감소 > 15%.
7입니다. 폐 결 절 수의 평가
- 동물 중 하나에 정의 된 단계 6.14 (약 3-4 주) 인간적 끝점에 도달 하면, 실험을 종료 하 고 수집 하 고 분석 하는 모든 관련 조직.
- Euthanization, 전에 10 분 주사 150 µ L D-소 (30 mg/mL) 0.5 mL 인슐린 주사기.
- Anesthetize isoflurane 흡입 마 취와 함께 동물 (단계 6.7 참조). 발가락을 꼬 집는 마우스의 반응의 부재에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위27여 쥐를 안락사.
- 폐, 간, 비장, 신장 소독된가 위 핀셋을 사용 하 여 수집 합니다. 혈액 자취를 제거 하 고 배양 접시에 그들을 넣어 PBS에 장기를 씻어.
- 이미징 시스템 생물 발광에 장기와 배양 접시를 놓습니다. 장기의 양쪽에 생물 발광 신호를 측정 합니다. 측정, 직후 미래 조직학 분석을 위해 그들에 게 (24-72 시간, RT) 흥분을 4% 포 르 말린에 장기 급락.
- 수동 임계 처리 하 여 적절 한 이미징 소프트웨어 얻은 그림을 처리 합니다. 각 사진에 폐 작은 혹의 수를 계산 합니다. 양쪽 폐에 폐 작은 혹의 총 수를 계산 합니다.
8. 조직학 분석
- 폐 조직의 조직학 분석:
- 파라핀에 포 르 말린 고정 장기를 포함 하 고 6 µ m 조직 슬라이드를 준비.
- Deparaffinate 폐 조직 슬라이드 하 고 0.01 M 구 연산 염 버퍼 (pH 6)에서 15 분 동안 그들을 비등 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.
- 반대로 인간의 vimentin 항 체 (200 µ g/mL) 희석 1:150 항 체 희석 액 (상용)에 그 후 보조, HRP 표시 된 항 체 (0.5 mg/mL, 희석 1: 500) 실 온에서 가로로 슬라이드를 품 어. 조직 diaminobenzidine (DAB)-3'와 hematoxylin 카운터 얼룩 얼룩.
- 해당 카메라 및 이미지 소프트웨어를 결합 하는 광학 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 슬라이드를 관찰 합니다.
- 마우스 tibias에 GFP-긍정적인 MSCs의 존재를 평가:
- Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 0.24 M, pH 7.2-7.4 tibias 알려줍니다 뼈 유연 하 게 (약 1 주일)까지 매일 EDTA 버퍼를 새로 고칩니다.
- Tibias 탈수 하 고 파라핀을 침투. 파라핀 블록에 tibias (osteosarcoma 조직 포함)를 포함 합니다.
- 6 µ m 파라핀 섹션을 준비 하는 톰을 사용 합니다. 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 놓습니다. 건조 후, 실 온에서 하룻밤 슬라이드를 저장 합니다.
- 구 연산 염 버퍼를 사용 하 여 열 중재 항 원 검색 수행 (8.1.2 참조)와 1:900 항 체 희석 액에 희석에 안티-GFP 항 체 (전체 원으로)로 조직 얼룩. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 조직 counterstain
- 조직 슬라이드 해당 이미징 소프트웨어를 결합 하는 형광 현미경으로 관찰 합니다.
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Representative Results
이 연구에서 우리는 tumorigenic 프로 및 프로-전이성 형으로 MSCs 교육 다리 분 비 EVs 수 탐험. 우리 다리 셀 MSCs에 의해 내 면화는 exosome 같은 EVs 릴리스 보여줍니다. 우리 암 EVs에 의해 유도 된 MSC cytokine 식 프로필의 변경을 측정 하 고 종양 성장 및 전이 형성에 EV 교육 MSCs의 효과 평가. 연구 디자인의 일반적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.
EVs 발표 143B 다리 셀 또는 컨트롤 인간의 섬유 아 세포 차등 원심 분리에 의해 순화 되었다. EV 순도 계시는 준비는 주로 40-100 nm (그림 2A) 사이 배열 하는 직경을 가진 소포를 포함 하는 전자 현미경으로 확인 됐다. 암 EVs MSCs 상호 작용, 녹색 형광 닥터지 링커 염료 (GFLD)와 소포를 표시 하 고 대상 셀으로 하룻밤 그들을 인 큐베이 팅. 형광 현미경 검사 법에 의해 효율적인 EV 글귀 MSCs (그림 2B)에 의해 관찰합니다. 또한, 교류 cytometry 분석 다리 및 제어 EVs는 유사한 효율 (그림 2C) 내 면을 보여주었다. Osteosarcoma EVs MSCs의 immunomodulatory 속성 변경 여부 조사, 종양 EVs 인간의 섬유 아 세포와 비교 하는 IL-8과 일리노이-6 생산에서 2-fold 증가 결정을 보여주었다 다중 구슬 기반 cytokine immunoassay 사용 EVs (그림 2D, E)을 제어 합니다.
Osteosarcoma EVs tumorigenic 프로 및 프로-전이성 표현 형을 채택 하는 MSCs 교육 여부 조사, 우리는 다리의 발광, orthotopic이 종이 식 마우스 모델 고용. 모든 동물 실험 하나의 연산자에 의해 수행 되었다. 전이성 143B Fluc 셀 athymic 누드 마우스의 경골에 이식 했다 하 고, 이틀 후, 다리 xenografted 마우스 GFP-긍정적인 EV 교육 MSCs. 쥐 (비 교육) 순진한 MSCs 또는 아무 MSCs의 단일 관리 대상이 됐다 제어 그룹으로 사용 되었다. 아니 동물 설명된 끝점 전에 죽 었 다. 우리 캘리퍼스 측정에 의해 시연 및 생물 발광 영상 (BLI) 마우스 EV 교육 MSCs로 치료 하는 제어 그룹 (그림 3A)에 비해 종양의 성장을 가속 했다. 각 치료 팔의 종양 크기의 대표 이미지는 그림 3C에 나와 있습니다. 우리의 데이터는 교양 있는 MSCs의 단일 i.v. 관리 (그림 3B) 접종 후 10 일 일찍 종양 진행에 영향을 나타냅니다. 또한, MSCs GFP 표현그림 4(A), 교육/순의 조직의 주사 후 4 일 우리 수 시각화 GFP 표현 세포 골 수 (그림 4B)와 종양 조직 (그림 4 에 C) MSC 종양 사이트에 귀환을 보여주는.
비보 전 폐, 간, 신장, 비장 (데이터 표시 되지 않음)의 씨 분석 독점적으로 모든 치료 팔 (그림 4D-F)의 쥐의 폐에서 폐 결 절 형성을 보여주었다. 기 막히게, 마우스 했다 폐 전이 받은 쥐에 비해 높은 수 비-교육 MSCs 또는 아무 MSCs (그림 4G) MSCs EV 교육을 받고, MSCs 증가 전이성 교육 종양 microenvironment 내에서 하는 제안 다리의 잠재력 세포 vivo에서7.
그림 1 . 연구 디자인의 도식 대표. 인간의 기본 MSCs는 EVs 교양된 전이성 osteosarcoma (143B) 세포에서 분리 된 교육. 암 EV 순도 전자 현미경에 의해 평가 및 MSCs에 의해 국제화는 형광 현미경 검사 법에 의해 시각 cytometry에 의해 분석. MSC cytokine 식 프로필에 변경 cytometric 구슬 배열 (CBA)에 의해 평가 됩니다. EV 교육의 역할을 정의 하려면 종양 성장 및 전이 형성, 다리-베어링 쥐 MSC는 EV 교육 주사 (또는 순) MSC. 종양의 성장 뒤에 생물 발광 영상 (BLI) 및 캘리퍼스 측정, 전이 형성 비보 전 씨에 의해 실험 끝점 및 조직학 분석 평가 하는 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . EVs와 MSCs. (A) 그들의 상호 작용의 정화 143B 셀에서 절연 EVs의 전송 전자 현미경 현미경 사진 (눈금 막대: 100 nm). MSCs 형광 현미경 검사 법에 의해 평가 하 여 (B) 통풍 관의 GFLD 표시 된 143B EVs (눈금 막대: 10 µ m). (C) (오렌지) GFLD의 국제화 라는 143B EVs 또는 MSCs cytometry에 의해 분석 하 여 제어 (인간 섬유 아 세포, hf) EVs (녹색). (D) 다중 MSCs 143B에 노출의 supernatants 염증 성 cytokines의 탐지 (143B EV-MSC) 또는 hf-EVs (hf EV-MSC) cytometric 구슬 배열에 의해. 143B MSC 익스프레스 일리노이-6와 IL-8 제어에 비해 (치료 및 hF EV 치료) MSCs. 점선은 cytokine 생산의 변화를 나타냅니다. (E) 일리노이 8과 일리노이-6 단백질 농도 조절된 미디어에 cytometric 구슬 배열, 유도 치료 컨트롤을 기준으로 접어 표현에 의해 분석으로 MSCs EV 치료의. 데이터 ± SD, 의미 표현 된다 n = 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 다리의 발광, orthotopic이 종이 식 마우스 모델. (A) 캘리퍼스 측정, 및 (B) 종양의 성장을 생물 발광 영상 (씨)에 의해 측정을 사용 하 여 종양 볼륨의 추정. 종양 크기는 광자 플럭스 (광자/초)으로 표시 됩니다. p < 0.01, 비 교육 MSC (n = 6) vs MSC 교육 (n = 6), t-검정 짝이 없는. 데이터는 의미 ± 설립된 다리 종양 (위 패널)와 쥐의 SEM. (C) 대표 씨 이미지 표현 됩니다. 7.7 x 10에서 색 눈금 막대 범위 108 (레드) 광자/초 x 2.67 (보라색). 하단 패널에서 종양 지역 라스 오버레이 없이 시각입니다. 화살표는 종양 부피를 나타냅니다. 스케일 바: 0.6 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . MSCs와 폐 조직의 비보 전 이미지입니다. (A) 형광 현미경 이미지 교양된 GFP-긍정적인의 지방이 많은 파생 MSCs (녹색). (B) 면역 형광 골에 GFP-긍정적인 MSCs와 MSC 수신 쥐의 종양 조직에서 (C) 의 얼룩 (녹색: MSCs, 파랑: DAPI 핵; 스테인드 눈금 막대 10 µ m). (D-F) Ex vivo 생물 발광 영상 (BLI) 보여주는 순진한 MSC (E) 또는 아무 MSC (D)를수신 하는 쥐에 비해 EV 교육 MSCs (F)을 받은 쥐에서 전이성 foci의 높은 수. 색 눈금 막대 1 x 106 (보라색) 1.5 x 106 (레드) 광자/sec에서에서 배열 한다. (G) 씨에 의해 시각으로 폐 전이 번호의 정량화 (라인 대표 중간; * p < 0.05, 단측 t-검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
종양-분 비 세포 외 소포 (EVs) 종양 지원 환경 생성 하 현지와 먼 중간 엽 세포의 생리학을 변경할 수 있습니다. 여기 우리가 종양 세포 간의 EV 중재 한 상호 작용의 해 부를 수 있는 다리의 전 임상 마우스 모델의 생성을 설명 하 고 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) vivo에서. 우리는 인간의 종양 마우스 다리 xenografts 강하게 베어링의 EV 교육 MSCs의 조직의 주입7일-6/STAT3 신호 통로 활성화 하 여 암 성장과 전이 형성 촉진을 보여줍니다.
최근 연구 결과 암 EVs 로컬 또는 골 수 유래 기질 세포16,,2829의 동작을 변경 하 여 미리 전이성 틈새의 형성에 도움이 될 수 있습니다 나타났습니다. 이러한 연구 결과 암 파생 소포 종양 홍보 효과 대 한 책임 셀 형식의 식별을 복잡 하 게 받는 사람 마우스에 직접 주입 하 여 주로 실시 되었습니다. 우리의 프로토콜에서 암 EVs MSCs의 교육에서 체 외에서 MSC 주입 전에 발생합니다. 이 이렇게 암 진행을 종양 MSC 누화의 구체적인 기여의 주소 지정을 허용 하 고 로컬 또는 조직의 환경의 다른 구성 요소에 암 EVs의 혼란 간접 효과 최소화.
여부를 평가 교육된 MSCs 집 종양 사이트에, 우리는 체계적으로 GFP-긍정적인 MSCs 종양 방위 쥐의 꼬리 정 맥에 주입. 꼬리 정 맥 주사는 중요 하지만 기술적으로 도전 하는 많은 실험 프로토콜에 단계. 주사 중 최소한의 변화를 위해 절차 경험 있는 조사자에 의해 수행 되어야 한다. 정 맥을 통해 액체의 움직임을 관찰 하 여 정확한 정 맥 행정을 시각적으로 확인할 수 있습니다. 꼬리에는 흰색 영역이 나타납니다 또는 저항 하는 주입 동안 발견, 혈관 접근 하지 달성 했다. 이 경우 첫 번째 주사 부 위에 바늘을 삽입 하 여 절차를 반복 한다. MSCs는 종양에 쉽게 가정에서 때문에 면역 형광 얼룩 종양 조직 및 골 수의 주입 (그림 4B, C) 후 4 일에 의해 (GFP-긍정적인) MSCs의 성공적인 관리를 확인할 수 있습니다.
우리는 암 분 비 EVs 염증 성 cytokines의 생산을 변경 하 여 MSCs에서 종양-지원 형 유도 보여. 이 발견은 면역 변조 이후 특히 관련 되며 종양 면역 회피 악성 진행에 핵심 메커니즘. 우리의 데이터는 EVs 수 직접 보고 독립적인 연구21,30,31,,3233, 또는 간접적으로 (통해 MSCs) 암 타고 난 또는 적응 면역에 영향을 제안합니다 구성 요소입니다. 그러나,이 종이 식 (immunocompromised) 모델의 사용 EVs의이 측면을 조사 가능성을 제한 합니다. 따라서, immunocompetent 또는 인간 답게 마우스 모델에서 비슷한 접근 암에서 EV 중재 종양-MSC-면역 세포 상호 작용의 역할을 정의 하기 위해 수행 해야 합니다.
마지막으로, MSCs 종양 골 또는 다른 조직 소스에서 채용 될 수 있습니다., 때문에 우리의 방법은 뼈 암의 연구에 제한 되지 않습니다 하지만 종양 여러 암 종류2, EV 교육 MSCs의 역할 조사에 적용할 수 있습니다. 3 , 4 , 5 , 6, 흑색 종 및 림프 종 모델에서 최근 연구34를확인 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
S.R. 발리는 유럽 연합에 의해 Cancro (AIRC) 공동 투자 라 검색 술 당 예술 우승에 의해 친교에 의해 지원 되었다. 또한,이 프로젝트 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 아무 660200 (S.R. 발리) 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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