Summary
Iniezione diretta di cancro-derivato di vescicole extracellulari (SVE) conduce alla riprogrammazione del midollo osseo, sostenendo la progressione del tumore; Tuttavia, le celle che mediano questo effetto è poco chiaro. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare EV-mediata di cellule staminali tumorali mesenchimali (MSC) interazioni in vivo, rivelando un ruolo cruciale per MSCs EV-educato in metastasi.
Abstract
All'interno del microambiente tumorale, residente o reclutate cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuire alla progressione maligna in diversi tipi di cancro. Sotto l'influenza di specifici segnali ambientali, queste cellule staminali adulte possono rilasciare mediatori paracrini che conduce alla crescita accelerata del tumore e metastasi. Definire il crosstalk tra tumore e MSCs è di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base di progressione del cancro e identificare nuovi bersagli per interventi terapeutici.
Le cellule tumorali producono elevate quantità di vescicole extracellulari (EVs), che possono influire profondamente sul comportamento delle cellule bersaglio nel microambiente tumorale o ai luoghi distanti. Tumore EVs racchiudere biomolecole funzionali, tra cui infiammatoria RNA e proteine (onco), che possono educare le cellule stromal per migliorare il comportamento metastatico delle cellule tumorali o per partecipare alla formazione di nicchia pre-metastatico. In questo articolo, descriviamo lo sviluppo di un modello murino di cancro preclinica che consente la valutazione specifica del crosstalk EV-mediata tra tumore e cellule staminali mesenchimali. In primo luogo, descriviamo la purificazione e la caratterizzazione del tumore-secreto SVE e alla valutazione di interiorizzazione EV di MSCs. Quindi facciamo uso di un immunodosaggio basato su perlina multiplex per valutare l'alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotta da cancro EVs. Infine, ci illustrano la generazione di un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma che ricapitola l'interazione tumore-MSC e mostrare il contributo delle MSC EV-educato a formazione di crescita e la metastasi del tumore.
Il nostro modello offre l'opportunità di definire come cancro EVs forma un ambiente di supporto di tumore e per valutare se il blocco della comunicazione fra il tumore e MSCs EV-mediato previene la progressione del cancro.
Introduction
Il microambiente tumorale partecipa attivamente in maggior parte, se non tutti, gli aspetti della progressione nella tumorigenesi e cancro, tra cui la formazione di metastasi e lo sviluppo della resistenza alla terapia1. Questo sottolinea la necessità di modelli murini di cancro preclinica orthotopic che consentono la dissezione delle interazioni tumore-stroma complesse che si verificano nella nicchia del tumore.
Tra i molti componenti cellulari del microambiente tumorale, cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuiscono fortemente alla progressione tumorale in diversi tipi di cancro come cancro al seno, cancro della prostata, i tumori cerebrali, mieloma multiplo e l'osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs sono cellule staminali multipotenti che si trovano in vari tessuti adulti e fetali, compreso il midollo osseo, il tessuto adiposo, placenta, sangue del cordone ombelicale e gli altri8,9. In risposta a segnali infiammatori generati dal cancro, MSCs migrare verso siti tumorali, incorporare nel microambiente tumorale e, in definitiva, differenziarsi in supporto di cancro cellule10. Questi MSCs cancro-collegati forniscono fattori essenziali (cioè, i fattori di crescita, chemochine, citochine e mediatori immunosoppressivi) per la progressione del tumore, che agiscono sia sulle cellule del tumore e lo stroma circostante2, 3 , 11 , 12 , 13. mentre gli effetti dipromozione di MSCs cancro-collegati sono stati studiati nei numerosi modelli di cancro, i meccanismi da cui le cellule del tumore riprogrammare MSCs per modellare una nicchia dipromozione sono capiti male. Qui descriviamo la generazione di un modello di xenotrapianto ortotopico che consente in particolare lo studio dell'interazione pro-cancerogeno tra cellule tumorali dell'osso e MSCs tramite vescicole extracellulari (EVs).
SVE sono mediatori cruciali della comunicazione intercellulare tra tumore e cellule stromali14. SVE trasportano biomolecole funzionale della cellula di origine, tra cui proteine, lipidi e RNA regolatori. Una volta rilasciato nello spazio extracellulare, queste vescicole possono essere preso dalle cellule circostanti o trasportato ai luoghi distanti tramite il sangue o la circolazione linfatica e possono influenzare profondamente il comportamento della cella di destinazione. 15 , 16 , 17 per esempio, l'assorbimento di cancro EVs dai fibroblasti stromal può provocare nella differenziazione dei miofibroblasti sostenendo l'angiogenesi e accelerando tumore crescita in vivo18,19, interiorizzazione di endoteliale cellule in grado di stimolare l'angiogenesi del tumore e aumentare la permeabilità vascolare16,20, e l'interazione con le cellule immunitarie potrebbe portare alla soppressione della risposta immunitaria antitumorale21.
Recentemente abbiamo dimostrato, utilizzando un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma, che le cellule del tumore rilasciano elevate quantità di EVs che richiedono MSCs per acquisire un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Questo effetto è dovuto ad un drammatico cambiamento nel profilo di espressione di citochina MSC (denominato "Formazione MSC") e può essere prevenuto con la somministrazione di un anticorpo di terapeutico del ricevitore interleukin-6 (IL-6R)7. Nostro lavoro ha dimostrato che il cancro SVE sono cruciali nella modulazione del comportamento MSC, così fornendo una spiegazione razionale per approcci mirati microambiente per fermare la progressione di osteosarcoma. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare l'interazione tumore-MSC EV-mediata in vivo. Questo modello è destinato a: 1) in particolare definire le alterazioni di EV-indotta di cancro di comportamento MSC nel microambiente tumorale, 2) valutare come questa interazione contribuisce alla crescita del tumore dell'osso e la formazione di metastasi e 3) Studio se interferiscono con la diafonia EV-mediata in vivo impedisce la progressione del cancro.
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Protocol
Adiposo umano per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali sono state ottenute dal reparto di chirurgia plastica dell'ospedale Tergooi (Hilversum, Paesi Bassi) dopo l'approvazione dal comitato etico istituzionale e consenso informato scritto. MSCs adiposa GFP-positivi sono stati ottenuti dal dipartimento di scienze mediche e chirurgiche per bambini e adulti (Università di Modena e Reggio Emilia).
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge olandese sulla sperimentazione animale, e il protocollo è stato approvato dal Comitato sulla sperimentazione animale del centro medico Vrije Universiteit, Amsterdam, Paesi Bassi.
1. isolamento delle vescicole extracellulari secrete del tumore.
- Preparare EV-vuotati fetale del siero bovino (FBS) mediante centrifugazione FBS a 70.000 x g durante la notte (16 ore), nessun freno, a 4 ° C, utilizzando un rotore ultra-oscillante (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione e raccogliere il surnatante (EV-vuotati FBS) senza disturbare il pellet. Filtrare la FBS EV-vuotati con un filtro da 0,22 µm.
- Preparare EV-vuotati colturale completando Medium (IMDM per volta Dulbecco di Iscove) con 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, glutammina 2 mM (1 x P/S/G) e 5% FBS EV-vuotati.
- 3 x 106 143B cellule in boccette di 175 cm2 di semi e li della coltura in terreno di coltura EV-vuotati in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Quando le cellule sono 80-90% confluenti (in genere dopo 36 h a 48 h), è possibile raccogliere il surnatante da 8 x 175 cm2 boccette (28 mL/boccetta) per EV-isolamento.
- Pre-cancellare il surnatante delle cellule per rimuovere le cellule e detriti cellulari tramite centrifugazione differenziale (centrifugazione il surnatante dello spin precedente ogni volta) secondo il seguente protocollo:
- Centrifugare il surnatante due volte a 500 x g per 10 min.
- Centrifugare il supernatante due volte a 2000 x g per 15 min.
- Centrifugare il surnatante due volte a 10.000 x g per 30 min.
- Eseguire tutte le centrifugazioni a 4 ° C con massima accelerazione e decelerazione velocità impostazioni. Dopo ogni passaggio, è necessario raccogliere con cura il supernatante contenente EV, lasciando circa 1 mL. Procedere immediatamente per passo 1.5 o negozio pre-sgomberati condizionata medio a-80 ° C fino a EV isolamento.
- Isolare il server virtuale di Exchange mediante centrifugazione il medium condizionato pre-cancellato una volta a 70.000 x g per 1 h, lento freno, a 4 ° C in provette da ultra-centrifuga (volume finale 38,5 mL/tubo) utilizzando un rotore ultra oscillante.
- Eliminare il surnatante, lasciando circa 1 mL dietro, risospendere il pellet contenente EV nel volume restante attentamente, piscina li tutti in una provetta di ultracentrifuga e aggiungere tampone fosfato salino (PBS) fino al riempimento completo tubo (volume finale mL 38,5).
- Centrifugare nuovamente a 70.000 x g per 1 h a 4 ° C, senza freno (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione, rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet e dimentichi di 100-200 µ l.
- Risospendere il pellet di EV e regolare il volume finale a 200 µ l con PBS (standardizzato per tutti i EV-isolamenti). Utilizzare la preparazione EV immediatamente o conservare a-80 ° C fino a uso22.
Nota: EVs possono essere conservati fino a 6 mesi a-80 ° C.
2. EV caratterizzazione.
Purificata EVs possono essere visualizzate da trasmissione microscopia elettronica (TEM)23.
- Preps mix EV con un volume uguale di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato.
- Cappotto 200 mesh griglie TEM di nichel rivestita di carbonio Formvar con 5 µ l di sospensione di EV per 20 min a temperatura ambiente.
- Fissare i campioni EV su griglie TEM con 1% di glutaraldeide in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.0), contrasto con ossalato di uranile (pH 7.0) e incorporare in una miscela di 4% uranile acetato e 2% metil cellulosa in un rapporto di 1:9 su ghiaccio.
- Rimuovere le griglie con passanti in acciaio inox e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro per garantire un adeguato spessore di pellicola di cellulosa di metile.
- Dopo l'essiccazione, esaminare le griglie con un microscopio elettronico a trasmissione e catturare immagini con una fotocamera digitale accoppiata al software di immagine corrispondente.
3. formazione delle MSC di tumore-derivato EVs.
- Preparare il terreno di coltura MSC completando alfa-minimo mezzo essenziale (alfa-MEM) con 4% EV-vuotati umana della piastrina Lysate (hPL)24, eparina (10 U/mL) e 1 x P/S/G.
Nota: EV-vuotati hPL è ottenuta seguendo la procedura descritta nella sezione 1.1. - Seme 1.4 x 106 adiposo-derivate MSCs per fiaschetta di 75 cm2 e loro la cultura a EV-vuotati MSC-coltura in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
- Quando cellule raggiungono 70% confluenza, aggiungere 143B osteosarcoma - o controllare i fibroblasti umani (hf)-SVE, 10 µ l EV preparazione/cm2 di matraccio di cultura. Incubare per 24 ore e aggiungere la stessa quantità di EVs per ulteriori 6 ore. Nota: I fibroblasti umani sono coltivati in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) 10% FBS e SVE sono isolati come descritto nella sezione 1.
- Raccogliere il surnatante MSC, centrifugare 1x a 500 x g per 5 min a 4 ° C (con massima accelerazione e decelerazione velocità impostazioni), trasferire in una nuova provetta e conservare il supernatante eliminato a-80 ° C per attivare l'analisi del futuro citochina (sezione 5).
- Per in vivo esperimenti (sezione 6), educare GFP-positive MSCs25 come descritto nelle sezioni 3.1 a 3.3, raccogliere le cellule e loro risospendere in PBS ad una concentrazione finale di 106 cellule per 100 µ l. cellule di tenere il ghiaccio fino a iniezione.
4. EV interiorizzazione Assay.
Per visualizzare l'assorbimento EV di MSCs, etichetta SVE con un colorante fluorescente verde del linker (GFLD) (disponibile in commercio) seguendo il protocollo del produttore:
- Brevemente, aggiungere 180 µ l di diluente per la preparazione di EV 200 µ l. Diluire 1 µ l di colorante GFLD in 50 µ l di diluente e aggiungere 20 µ l di colorante diluito il prep EV diluito.
- Delicatamente mescolare pipettando e incubare per 3 min a temperatura ambiente al buio.
- Aggiungere 5 mL di 0,1% BSA in PBS, trasferimento a ultra-provette e riempire il tubo con PBS (volume finale 38,5 mL/tubo).
- Centrifugare 1 x a 70.000 x g per 1 h a 4 ° C, senza freno (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il EV-pellet con etichettato in un volume finale di 200 µ l (regolazione del volume con PBS).
- Aggiungere il servizio volontario europeo con etichettato alla cultura MSC, e conservare a-80 ° C. Dopo l'incubazione overnight, valutare interiorizzazione della vescicola mediante microscopia a fluorescenza e flusso cytometry7.
5. valutazione del profilo di espressione di citochina MSC.
- Per la quantificazione multisala di interleukin-8 (IL-8), interleuchina-1 β (IL-1 β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), fattore di necrosi tumorale (TNF) e interleukin - 12p 70 (IL - 12p70) livelli della proteina in MSC condizionata medio (Vedi punto 3.4), utilizzare un matrice di perlina cytometric commercialmente disponibile (CBA) per citochine infiammatorie umane seguendo le istruzioni del produttore.
- Brevemente, mescolare le perle cattura anticorpo coniugato e aggiungerli a tutte le provette. Aggiungere le diluizioni standard di citochine o i campioni medi condizionati ai tubi.
- Aggiungere il reagente di rivelazione e incubare per 3 ore a TA.
- Lavare le perle con la soluzione di lavaggio fornita. Misurare i campioni utilizzando un citometro a flusso e analizzare i dati secondo le istruzioni del produttore.
6. generazione di un modello di topo Orthotopic dello xenotrapianto di Osteosarcoma.
- Consentire sei-settimana-vecchio, donna, topi Athymic Nude-Foxn1nu acclimatare per almeno una settimana prima di iniziare le procedure sperimentali.
- Un giorno prima dell'intervento chirurgico e come analgesia peri-operatorio aggiungere paracetamolo per l'acqua potabile. Diluire "paracetamolo soluzione per bambini" (Vedi Tabella materiali) con acqua per ottenere una concentrazione finale di 2 mg/mL. Basato su un'assunzione media dell'acqua di 150 mL/kg/giorno, e un peso medio di 20 g, questa dose è sufficiente per raggiungere un dosaggio di 6 mg/mouse/giorno (300 mg/kg/giorno).
- Continuare il trattamento analgesico fino a 24 ore dopo l'operazione, o più se gli animali mostrano segni di dolore.
- Il giorno della procedura chirurgica, raccogliere cellule coltivate di luciferasi-positivi (Fluc) 143 ter (precedentemente generate attraverso la trasduzione lentivirale) mediante centrifugazione a 300 x g per 10 min e risospendere le cellule ad una concentrazione di 2 x 105 cellule / µ l di PBS. Tenere la sospensione cellulare su ghiaccio fino a 6 ore.
- Apparecchiature chirurgiche di autoclave. Preparare e pulire l'area di lavoro e inserire le forbici sterilizzate e pinzette sterili fogli. Venti minuti prima che la procedura chirurgica (passo 6,8), iniettare gli animali per via sottocutanea con buprenorfina (0,05 mg/kg, diluito in soluzione fisiologica allo 0,9%) come analgesico utilizzando siringhe da insulina 0,5 mL (ago 29-gauge).
- Poco prima anestetizzando ogni animale, riempire una siringa 10 µ l con almeno 1 µ l della sospensione delle cellule (Fluc) 143B concentrata (Vedi punto 6.4).
- Anestetizzare l'animale con anestesia inalazione isoflurane (2-3% di ossigeno). Controllare il livello dell'anestesia di punta-pizzicare l'animale. Quando l'animale non reagisce ad i pizzicotti, cioè, che esso è profondamente anestetizzato, applicare unguento per gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Posizionare l'animale sul dorso con la testa in una mascherina dell'anestesia e con le gambe verso l'operatore. Flettere il ginocchio sinistro. Pulire la pelle con etanolo al 70% e applicare lidocaina (2%) con una punta di cotone 3 volte come analgesico locale.
- Utilizzare un coltello chirurgico sterile per praticare una piccola incisione (circa 5 mm) sulla pelle appena sotto il ginocchio per esporre la tibia. Praticare un foro nella tibia, circa 2 mm sotto il ginocchio con un trapano di torsione micro 0.8 mm. Fare attenzione a non forare entrambi cortecce di tibia.
- Iniettare il foro con un ago da 26-gauge sospensione di 1 µ l delle cellule (circa 2 x 105 cellule) lentamente (in circa 5 secondi). Chiudere il foro con una goccia di colla del tessuto per evitare il riflusso della sospensione.
- Chiudere la pelle con suture monofilamento e una goccia di colla del tessuto. Lasciate che il recupero degli animali in un ambiente ben riscaldato (uso una lampada di calore). Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Solo dopo che gli animali sono pienamente recuperati dall'anestesia, restituirli alle loro gabbie.
- Due giorni dopo l'inoculazione del tumore, iniettare EV educato o MSCs ingenuo GFP-positive (106 cellule in 100 µ l di PBS, vedi punto 3.5) per via endovenosa con una siringa da insulina 0,5 mL nella vena caudale dei topi.
- Seguire la crescita del tumore di bioluminescenza imaging26 due volte a settimana. A tal fine, iniettare il i.p. di topi con 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) con una siringa da insulina. Dieci minuti dopo l'iniezione, posizionare gli animali nella bioluminescenza sistema di imaging e misurare il flusso di fotoni generato dalle cellule del tumore.
- Inoltre, misurare il diametro del osso-tumore primario con una pinza. Il volume del tumore (in mm3) stima di larghezza x di lunghezza2 x 0,5.
- Nota: Humane endpoint sono definiti come il diametro del tumore > 15mm o perdita di peso > 15%.
7. la valutazione del numero di nodulo polmonare
- Quando uno degli animali raggiunge l'endpoint umano definito nel passaggio 6.14 (in circa 3-4 settimane), terminare l'esperimento e raccogliere e analizzare tutti i tessuti interessati.
- Dieci minuti prima euthanization, iniettare 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) con una siringa da insulina 0,5 mL.
- Anestetizzare gli animali con anestesia inalazione isoflurane (Vedi punto 6.7). Confermare la profondità dell'anestesia per l'assenza di reazioni del mouse a punta-pizzicare. Eutanasia i topi da dislocazione cervicale27.
- Raccogliere i polmoni, fegato, milza e reni, con pinzette e forbici sterilizzate. Lavare gli organi in PBS per rimuovere le tracce di sangue e metterli su una piastra di Petri.
- Posizionare la piastra di Petri con gli organi nella bioluminescenza sistema di imaging. Misurare il segnale di bioluminescenza su entrambi i lati degli organi. Immediatamente dopo la misurazione, immergere gli organi in formalina 4% di loro fissarsi (24-72 ore, a temperatura ambiente) per future analisi istologica.
- Elaborare le immagini ottenute con appropriato software di imaging di soglia manuale. Contare il numero di noduli polmonari su ogni immagine. Contare il numero totale dei noduli polmonari su entrambi i lati dei polmoni.
8. istologici
- Per l'analisi istologica del tessuto polmonare:
- Incorporare gli organi in formalina in paraffina e preparare i vetrini di tessuto 6 µm.
- Deparaffinate il tessuto polmonare diapositive ed effettuare ricupero dell'antigene, facendoli bollire per 15 minuti in tampone citrato 0.01 M (pH 6).
- Incubare i vetrini in posizione orizzontale a temperatura ambiente con il vimentin anti-umano dell'anticorpo (200 µ g/mL) diluito 1: 150 in anticorpo-diluente (disponibile in commercio) e successivamente con l'anticorpo secondario, HRP-etichettato (0,5 mg/mL, diluizione 1: 500). Macchiare i tessuti con 3'-diaminobenzidina (DAB) e contatore di ematossilina.
- Osservare i vetrini di tessuto macchiato con un microscopio ottico accoppiato alla telecamera corrispondente e immagine software.
- Per valutare la presenza di GFP-positive MSCs in tibie del mouse:
- Decalcificare le tibie in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Aggiornare la soluzione tampone dell'EDTA ogni giorno fino alle ossa diventano flessibili (circa 1 settimana).
- Disidratare tibie e infiltrarsi loro con paraffina. Incorporare le tibie (compreso osteosarcoma tessuto) in blocchi di paraffina.
- Utilizzare un microtomo per preparare 6 sezioni di paraffina µm. Inserire le sezioni di paraffina su vetrini. Dopo l'essiccazione, memorizzare diapositive durante la notte a temperatura ambiente.
- Eseguire il recupero di calore-mediata antigene utilizzando tampone citrato (Vedi 8.1.2) e macchia i tessuti con l'anticorpo anti-GFP (intero antisiero) in una diluizione di 1:900 in anticorpo-diluente. Colorante di contrasto dei tessuti con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Osservare i vetrini di tessuto con un microscopio a fluorescenza accoppiato per il corrispondente software di imaging.
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Representative Results
In questo studio, abbiamo esplorato la possibilità di sve osteosarcoma-secreto di educare MSCs verso un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Mostriamo che cellule di osteosarcoma rilasciano EVs esosomi-like che sono interiorizzati da MSCs. Abbiamo misurato l'alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotto da cancro EVs ed abbiamo valutato l'effetto di MSCs EV-istruiti sulla crescita del tumore e la formazione di metastasi. La rappresentazione generale del disegno dello studio è illustrata nella Figura 1.
SVE rilasciato dalle cellule di osteosarcoma 143B o controllo di fibroblasti umani sono stati purificati mediante centrifugazione differenziale. Purezza di EV è stata confermata da microscopia elettronica, che ha rivelato che le preparazioni contenevano principalmente vescicole con un diametro compreso tra 40-100 nm (Figura 2A). Per valutare se cancro EVs interagire con MSCs, abbiamo etichettato le vescicole con un colorante fluorescente verde lipofilico del linker (GFLD) e incubati in loro durante la notte con le cellule bersaglio. Mediante microscopia a fluorescenza, abbiamo osservato l'assorbimento efficiente EV di MSCs (Figura 2B). Inoltre, l'analisi di citometria a flusso ha mostrato che EVs osteosarcoma e controllo sono interiorizzati con efficienza paragonabile (Figura 2C). Per studiare se osteosarcoma EVs alterare le proprietà immunomodulatorie delle MSC, abbiamo usato un immunoassay citochina basati su perlina multiplex, che ha mostrato che il tumore EVs determinare un aumento di 2 volte nella produzione di IL-8 e IL-6 rispetto ai fibroblasti umani controllo EVs (Figura 2D, E).
Per studiare se osteosarcoma EVs educare MSCs per adottare un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico, abbiamo impiegato un bioluminescenti, modello di xenotrapianto ortotopico del topo di osteosarcoma. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti da un solo operatore. Le cellule metastatiche 143B-Fluc sono state trapiantate nella tibia di topi nudi athymic e, dopo due giorni, osteosarcoma-xenotrapiantati topi sono stati sottoposti ad una singola somministrazione di GFP-positivo EV-educato MSCs. topi che ricevono MSCs ingenuo (non di istruzione) o nessun MSCs sono stati utilizzati come gruppi di controllo. Nessun animale è morto prima gli endpoint descritti. Abbiamo dimostrato tramite la misura di pinza e imaging di bioluminescenza (BLI) che i topi trattati con MSCs EV-istruito ha accelerato la crescita del tumore rispetto ai gruppi di controllo (Figura 3A). Immagini rappresentative di dimensioni del tumore di ciascun braccio di trattamento sono mostrati in Figura 3C. I nostri dati indicano che un singolo i.v. amministrazione di MSCs istruito influisce sulla progressione del tumore fin dal 10 ° giorno dopo l'inoculazione (Figura 3B). Inoltre, quattro giorni dopo l'iniezione sistemica di educato/ingenuo MSCs che esprimono GFP (Figura 4A), noi potremmo visualizzare cellule che esprimono GFP sia nel midollo osseo (Figura 4B) e nel tessuto del tumore (Figura 4 C), dimostrando MSC homing al luogo del tumore.
Ex vivo Analisi BLI di polmoni, fegato, reni e milza (dati non mostrati) ha mostrato la formazione di noduli polmonari esclusivamente nei polmoni in topi di tutti i bracci di trattamento (Figura 4D-F). Sorprendentemente, i topi che ricevono MSCs EV-istruito era più alto numero delle metastasi del polmone rispetto ai topi che ricevono non-educato MSCs o nessun MSCs (Figura 4G), suggerendo che all'interno del microambiente tumorale educato MSCs aumento il metastatico potenziale di osteosarcoma cellule in vivo7.
Figura 1 . Rappresentazione schematica del disegno dello studio. MSCs primaria umana vengono educati con EVs isolato dalle cellule coltivate osteosarcoma metastatico (143 ter). Purezza di cancro EV è valutata da microscopia elettronica e interiorizzazione di MSCs è visualizzate da microscopia di fluorescenza e analizzate tramite flusso cytometry. Cambiamenti nel profilo di espressione di citochina del MSC vengono valutati da cytometric matrice perlina (CBA). Per definire il ruolo di EV educato MSC sulla crescita del tumore e la formazione di metastasi, osteosarcoma-cuscinetto topi sono iniettati con EV-educato (o ingenui) MSC. Crescita del tumore è seguita da bioluminescenza imaging (BLI) e pinza misura, mentre la formazione di metastasi è valutata al punto finale sperimentale di ex vivo BLI e l'analisi istologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Purificazione di EVs e la loro interazione con MSCs. (A) micrografo di microscopia elettronica di trasmissione dello SVE isolato dalle cellule 143B (barra della scala: 100 nm). (B) l'assorbimento di GFLD-labeled 143B EVs di MSCs valutati mediante microscopia a fluorescenza (barra della scala: 10 µm). (C) internalizzazione del GFLD-labeled 143B EVs (arancione) o controllo (fibroblasti umani, hf) EVs (verde) di MSCs come analizzato tramite flusso cytometry. (D) Multiplex rilevamento delle citochine infiammatorie nei surnatanti di MSCs esposti a 143 ter (143B EV-MSC) o hf-EVs (hf EV-MSC) di matrice perlina cytometric. 143B-MSC express i livelli elevati di IL-6 e IL-8 rispetto al controllo (non trattati e hF EV-trattati) MSCs. Le linee tratteggiate indicano il cambiamento nella produzione di citochina. (E) IL-8 e IL-6 concentrazione nella proteina in media condizionati di MSCs EV-trattati come analizzata dalla matrice di perlina cytometric, espresso come piegare induzione rispetto al controllo non trattato. I dati sono espressi come media ± SD, n = 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Bioluminescenti, modello ortotopico del topo dello xenotrapianto di osteosarcoma. (A) stima del volume del tumore mediante misure di pinza e crescita del tumore (B) misurata di bioluminescenza (BLI) di imaging. Dimensioni del tumore sono espresso come cambiamento continuo del fotone (fotoni/sec). p < 0.01, MSC non istruiti (n = 6) vs educato MSC (n = 6), spaiati t-test. I dati sono espressi come media ± Immagini SEM. (C) rappresentante BLI dei topi con tumori stabiliti osteosarcoma (pannello superiore). Range di bar di colore-scala da 7,7 x 107 (viola) a 2,6 x 108 (rosso) fotoni/sec. Nel pannello inferiore, la zona del tumore è visualizzata senza sovrapposizione BLI. Le frecce indicano la massa del tumore. Scala bar: 0,6 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Imaging di MSCs ed ex vivo tessuto polmonare. (A) immagine di microscopia di fluorescenza di GFP-positive coltivate adiposo-derivate MSCs (verde). (B) colorazione di immunofluorescenza di MSCs GFP-positive nel midollo osseo e (C) nel tessuto del tumore dei topi di MSC-ricezione (verde: MSCs, blu: DAPI macchiato i nuclei; scala bar 10 µm). (D-F) Ex vivo bioluminescenza imaging (BLI) visualizzando più alto numero di fuochi metastatici in topi che ricevono EV-educato MSCs (F) rispetto ai topi che ricevono ingenuo MSC (E) o senza MSC (D). Barra della scala colore varia da 1 x 106 (viola) a 1,5 x 106 (rosso) fotoni/sec. (G) quantificazione del numero di metastasi del polmone come visualizzate da BLI (linee rappresentano la mediana; * p < 0.05, test t a una coda). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Tumore-secreto di vescicole extracellulari (SVE) possono alterare la fisiologia delle cellule mesenchimali locali e distanti per generare un ambiente favorevole del tumore. Qui descriviamo la generazione di un modello murino preclinico di osteosarcoma che consente una dissezione delle interazioni EV-mediata tra cellule tumorali e cellule staminali mesenchimali (MSCs) in vivo. Mostriamo che iniezione sistemica del tumore umano MSCs EV-educato in topi che sopportano gli xenotrapianti osteosarcoma fortemente promuove la formazione di crescita e la metastasi del cancro attivando la IL-6/STAT3 signaling pathway7.
Recenti studi hanno dimostrato che cancro SVE possono aiutare nella formazione della nicchia pre-metastatico alterando il comportamento del locale o derivate da midollo osseo le cellule stromal16,28,29. Questi studi sono stati condotti principalmente iniettando direttamente derivata cancro vescicole nel topo destinatario, che complica l'identificazione dei tipi cellulari responsabili degli effetti dipromozione. Nel nostro protocollo, l'educazione di MSCs con cancro SVE si verifica in vitro prima dell'iniezione di MSC. Questo approccio consente l'indirizzamento del contributo specifico del crosstalk tumore-MSC alla progressione tumorale e riduce al minimo la confusione effetti indiretti del cancro EVs su altri componenti dell'ambiente locale o sistemica.
Per valutare se l'istruito MSCs casa al luogo del tumore, abbiamo iniettato sistemica MSCs GFP-positive nella vena caudale dei topi del tumore-cuscinetto. Iniezioni di vena della coda sono un cruciale, ma tecnicamente impegnativo passo in molti protocolli sperimentali. Per garantire la minima variazione tra iniezioni la procedura deve essere eseguita da esperti ricercatori. Corretta somministrazione endovenosa può essere confermata visivamente osservando il movimento del fluido attraverso la vena. Se viene visualizzata un'area bianca sulla coda o si incontra resistenza durante l'iniezione, accesso vascolare non è stato raggiunto. In questo caso la procedura deve essere ripetuta inserendo l'ago sopra il primo sito di iniezione. Perché MSCs, prontamente home sul tumore, riuscita gestione di MSCs (GFP-positivo) può essere confermata dalla macchiatura di immunofluorescenza del midollo osseo e del tessuto del tumore quattro giorni dopo l'iniezione (Figura 4B, C).
Mostriamo che cancro-secreto EVs indurre un fenotipo tumorale-solidale in MSCs alterando la produzione delle citochine infiammatorie. Ciò che trova è particolarmente rilevante dal modulazione immune ed evasione immune tumore sono meccanismi chiave nella progressione maligna. I nostri dati suggeriscono che il cancro EVs potrebbe direttamente, come riportato da studi indipendenti21,30,31,32,33, o indirettamente (tramite MSCs) influenzare immunitario innato o adaptive componenti. Tuttavia, l'uso di un modello di xenotrapianto (immunocompromessi) limita la possibilità di studiare questo aspetto del SVE. Pertanto, approcci simili in modelli di topi immunocompetenti o umanizzato necessario intraprendere per definire il ruolo delle interazioni EV-mediata delle cellule tumore-MSC-immunitario nel cancro.
Infine, poiché MSCs possono essere reclutati dal midollo osseo o da altre fonti di tessuto ai tumori, il nostro metodo non si limita allo studio dei tumori ossei, ma può essere applicato per studiare il ruolo del tumore MSCs EV-educato in più tipi di cancro2, 3 , 4 , 5 , 6, come studi recenti nei modelli del melanoma e linfoma confermare34.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
S.R. Baglio è stato sostenuto da una borsa di studio di Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-finanziato dall'Unione europea. Inoltre, questo progetto ha ricevuto non finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie 660200 (al S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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