Summary
Injection directe de vésicules extracellulaires dérivées du cancer (EVs) conduit à la reprogrammation de la moelle osseuse supportant la progression tumorale ; Cependant, les cellules médient cet effet n’est pas claire. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier les interactions de EV médiée par les cellules souches tumeur mésenchymateuse (MSC) in vivo, révélant un rôle crucial pour MSCs EV-éduqués à la métastase.
Abstract
Dans le microenvironnement tumoral, résidents ou recrutés cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent à la progression maligne dans plusieurs types de cancer. Sous l’influence de signaux environnementaux spécifiques, ces cellules souches adultes peuvent libérer des médiateurs paracrines conduisant à la croissance accélérée tumorale et les métastases. Définir la diaphonie entre la tumeur et MSCs est primordiales pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression du cancer et d’identifier de nouvelles cibles d’intervention thérapeutique.
Les cellules cancéreuses produisent des quantités élevées de vésicules extracellulaires (EVs), qui peuvent affecter profondément le comportement des cellules cibles dans le microenvironnement tumoral ou sur des sites éloignés. EVs tumeur joindre biomolécules fonctionnelle, notamment inflammatoires ARN et des protéines (onco), qui peuvent sensibiliser les cellules stromales afin d’améliorer le comportement métastatique des cellules cancéreuses ou de participer à la formation préalable métastatique niche. Dans cet article, nous décrivons le développement d’un modèle de souris cancer précliniques qui permet l’évaluation précise de la diaphonie EV-négociée entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses. Tout d’abord, nous décrivons la purification et la caractérisation de la tumeur-sécrétée SVE et l’évaluation de l’internalisation de l’EV de MSCs. Nous alors de faire usage d’un multiplex immunodosage axée sur la perle pour évaluer l’altération du profil expression de cytokines MSC induite par le cancer du SVE. Enfin, nous illustrer la génération d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome qui récapitule l’interaction de la tumeur-MSC et montrer l’apport des MSCs EV-éduqués à la formation de la croissance et la métastase des tumeurs.
Notre modèle offre la possibilité de définir comment le cancer EVs façonnent un environnement supportant les tumeurs et d’évaluer si le blocus de la EV-mediated communication entre la tumeur et MSCs empêche la progression du cancer.
Introduction
Le microenvironnement tumoral participe activement à la plupart, sinon tous, aspects de la progression de tumorigenèse et cancer du sein, y compris la formation de métastases et le développement de la résistance à la thérapeutique1. Cela souligne la nécessité pour les modèles de souris de cancer orthotopique préclinique permettant la dissection des interactions tumeur-stroma complexes qui se produisent dans le créneau de la tumeur.
Parmi les nombreux composants cellulaires du microenvironnement tumoral, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent fortement à la progression du cancer dans plusieurs types de cancers comme le cancer du sein, cancer de la prostate, tumeurs cérébrales, myélome multiple et ostéosarcome2 ,3,4,5,6,7. MSCs sont les cellules souches multipotentes qui résident dans divers tissus foetus et adultes, y compris la moelle osseuse, tissu adipeux, placenta, sang de cordon ombilical et autres8,9. En réponse aux signaux inflammatoires généré par le cancer, MSCs migrent vers les sites tumoraux, incorporent dans le microenvironnement tumoral et finalement se différencient en cellules de cancer supportant10. Ces MSCs associés à cancer facteurs essentiels (p. ex., les facteurs de croissance, chimiokines, cytokines et médiateurs immunosuppresseurs) prévoient de la progression tumorale agissant sur les cellules tumorales tant sur stroma environnant2, 3 , 11 , 12 , 13. alors que les effets favorisant la tumeur de MSCs associés au cancer ont été étudiés dans nombreux modèles de cancer, les mécanismes par lesquels les cellules tumorales reprogrammer MSCs pour façonner une niche cancer de promotion sont mal compris. Nous décrivons ici la génération d’un modèle de xénogreffes orthotopiques permettant spécifiquement de l’étude de l’interaction pro-tumorigènes entre cellules cancéreuses osseuse et MSCs, par l’intermédiaire de vésicules extracellulaires (EVs).
SVE est des médiateurs essentiels de communication intercellulaire entre la tumeur et les cellules du stroma14. SVE porte des biomolécules fonctionnelles de la cellule d’origine, y compris les protéines, les lipides et réglementation RNAs. Une fois libérés dans l’espace extracellulaire, ces vésicules peuvent être absorbés par les cellules environnantes ou transportées à des sites distants via le sang ou la circulation lymphatique et peuvent influencer profondément le comportement des cellules cibles. 15 , 16 , 17 par exemple, absorption du cancer EVs par les fibroblastes stromales peut entraîner dans la différenciation des myofibroblastes soutenant l’angiogenèse et en accélérant la tumeur croissance in vivo18,19, internalisation par endothéliale les cellules peuvent stimuler l’angiogenèse tumorale et augmenter la perméabilité vasculaire16,20, et interaction avec les cellules immunitaires pourrait conduire à la suppression du système immunitaire antitumorale21.
Nous avons récemment démontré, à l’aide d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome, que les cellules tumorales libèrent des quantités élevées de serveur virtuel Exchange qui invite MSCs pour acquérir un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro. Cet effet est dû à un changement radical dans le profil d’expression de cytokines MSC (dénommé « Enseignement de la SMC ») et peut être prévenu par l’administration d’un anticorps thérapeutique récepteur de l’interleukine-6 (IL-6R) à7. Nos travaux ont montré que le cancer EVs modulateurs cruciales du comportement MSC, fournissant ainsi une justification pour les approches ciblées microenvironnement stopper la progression de l’ostéosarcome. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier la tumeur-MSC EV-mediated interaction in vivo. Ce modèle est destiné à : 1) en particulier définir les altérations du cancer EV du comportement MSC dans le microenvironnement tumoral, 2) évaluer comment cette interaction contribue à la croissance de tumeur osseuse et la formation de métastases et l’étude 3) s’interférant avec la diaphonie induite par l’EV en vivo empêche la progression du cancer.
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Protocol
Les tissus adipeux humains pour isoler des cellules souches mésenchymateuses ont été obtenus auprès du service de chirurgie plastique de l’hôpital de Tergooi (Hilversum, Pays-Bas) après l’approbation par le Comité institutionnel d’éthique et consentement éclairé écrits. MSCs adipeuses GFP-positifs ont été obtenus du Department of Medical et chirurgical des Sciences pour enfants et adultes (Université de Modène et Reggio Emilia).
Des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la loi néerlandaise sur l’expérimentation animale, et le protocole a été approuvé par le Comité sur l’expérimentation animale du VU University medical center, Amsterdam, Pays-Bas.
1. isolement des vésicules extracellulaires sécrétée à la tumeur.
- Préparer le sérum bovin fœtal appauvris en EV (FBS) par centrifugation FBS à 70 000 x g pendant la nuit (16 heures), sans frein, à 4 ° C à l’aide d’un rotor oscillant ultra de seau (attendre 1 h pour la décélération). Recueillir soigneusement le surnageant (FBS appauvris en EV) sans déranger le culot. Filtrer la FBS appauvris en EV avec un filtre de 0,22 µm.
- Préparer appauvris en EV de milieu de culture en le complétant Medium (IMDM de Dulbecco modifiée de Iscove) avec 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, glutamine 2 mM (1 x P/S/G) et 5 % FBS appauvris en EV.
- 3 x 106 143 b cellules dans des flacons de2 175 cm de graines et leur culture en milieu appauvri en EV de culture dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Lorsque les cellules sont 80 à 90 % anastomosé (typiquement après 36 h à 48 h), recueillir le surnageant de 8 x 175 cm2 flacons (28 mL/flacon) pour EV-isolation.
- Avance le surnageant de cellule pour enlever les cellules et les débris cellulaires par centrifugation différentielle (centrifugation le surnageant au tour précédent chaque fois) conformément au protocole suivant :
- Centrifuger le surnageant deux fois à 500 x g pendant 10 min.
- Centrifuger le surnageant deux fois à 2000 g pendant 15 min.
- Centrifuger le surnageant deux fois à 10 000 x g pendant 30 min.
- Effectuer toutes les centrifugations à 4 ° C, avec une accélération maximale et les paramètres de vitesse de décélération. Après chaque étape, soigneusement recueillir le surnageant contenant EV, en laissant environ 1 mL. Aller de l’avant immédiatement pour revenir en 1.5 ou magasin la préapprouvés conditionné milieu à-80 ° C jusqu'à l’isolement de l’EV.
- Isoler le SVE en centrifugeant préapprouvé milieu conditionné une fois à 70 000 x g pendant 1 h, ralentir le frein, à 4 ° C dans des tubes d’ultracentrifugeuse (volume final 38,5 tube/mL) à l’aide d’un rotor oscillant ultra de seau.
- Soigneusement retirer le surnageant, en laissant environ 1 mL derrière, remettre les boulettes contenant EV dans le volume restant, leur piscine tout en un seul tube ultracentrifugeuse et ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’au remplissage complet tube (volume final mL 38,5).
- Centrifugeuse, une fois de plus à 70 000 x g pendant 1 h à 4 ° C, sans frein (attendre 1 h pour la décélération). Avec précaution, retirez le surnageant sans déranger le culot et laisser 100-200 µL.
- Resuspendre le culot-EV et ajuster le volume final de 200 µL avec du PBS (standardisé pour tous-l’isolement de l’EV). Utilisez la préparation EV immédiatement ou conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation22.
NOTE : EVs peuvent être conservés jusqu'à 6 mois à-80 ° C.
2. EV caractérisation.
EVs purifiés peuvent être visualisés par transmission electron microscopy (TEM)23.
- Mix EV se prépare avec un volume égal de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate.
- Manteau 200 mesh Formvar-carbone-enduit des grilles TEM nickel 5 µl de suspension EV pendant 20 min à température ambiante.
- Fixer les échantillons EV sur les grilles TEM au glutaraldéhyde 1 % dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0), contraste avec l’oxalate d’uranyle (pH 7,0) et l’incorporer dans un mélange de 4 % d’uranyle acétate et 2 % cellulose méthylique dans un ratio de 1:9 sur la glace.
- Retirez les grilles avec des boucles en acier inoxydable et épongez l’excès de liquide avec du papier filtre pour assurer une épaisseur appropriée de la pellicule de cellulose méthylique.
- Après séchage, examinez les grilles avec un microscope électronique à transmission et capturer des images avec un appareil photo numérique couplé au logiciel image correspondante.
3. l’éducation de MSCs par EVs dérivées de tumeurs.
- Préparer le milieu de culture MSC en complétant un milieu essentiel alpha-minimum (alpha-MEM) avec 4 % appauvris en EV humaine lysat plaquettaire (hPL)24, héparine (10 U/mL) et 1 x P/S/G.
NOTE : Les hPL appauvris en EV est obtenue suivant la procédure décrite à l’article 1.1. - Graine de 1,4 x 106 dérivés MSCs adipeux par flacon de 75 cm2 et leur culture dans un milieu appauvri en EV MSC-culture dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Lorsque les cellules atteignent 70 % confluence, ajoutez 143 ter ostéosarcome - ou contrôler les fibroblastes humains (hf)-EVs, 10 µL EV préparation/cm2 du flacon de culture. Incuber pendant 24 heures et ajouter la même quantité d’EVs pour heures supplémentaires. Remarque : Les fibroblastes humains sont cultivées dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) 10 % FBS et EVs sont isolés comme décrit à l’article 1.
- Recueillir le surnageant MSC, centrifuger 1 x à x 500 g pendant 5 min à 4 ° C (avec une accélération maximale et les paramètres de vitesse de décélération), transférer dans un nouveau tube et stocker le surnageant défriché à-80 ° C pour permettre l’analyse future cytokine (section 5).
- Pour in vivo les expériences (article 6), éduquer GFP-positif MSCs25 tel que décrit dans les sections 3.1 à 3.3, recueillir les cellules et remettre en suspension dans du PBS à une concentration finale de 106 cellules / 100 µL. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à l’injection.
4. EV internalisation dosage.
Pour visualiser l’absorption EV par MSCs, du label EVs avec un colorant fluorescent vert linker (GFLD) (disponible dans le commerce) suivant le protocole du fabricant :
- Brièvement, ajouter 180 µL de diluant à la prep de EV 200 µL. Diluer 1 µL de colorant GFLD dans 50 µL de diluant et ajouter 20 µL de colorant dilué à la prep EV diluée.
- Doucement de la composition de pipetage et incuber pendant 3 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Ajouter 5 mL de 0,1 % de BSA dans du PBS, transfert à ultracentrifugeuse tubes et remplir le tube avec du PBS (volume final 38,5 tube/mL).
- Centrifuger 1 x à 70 000 x g pendant 1 h à 4 ° C, sans frein (attendre 1 h pour la décélération). Avec précaution, retirez le surnageant et Resuspendre le EV-culot étiqueté dans un volume final de 200 µL (régler le volume avec du PBS).
- Ajouter le SVE marqué à la culture MSC ou de les stocker à-80 ° C. Après une nuit d’incubation, évaluer l’internalisation de la vésicule en microscopie par fluorescence et flow cytometry7.
5. évaluation du profil d’Expression de MSC Cytokine.
- Pour la quantification multiplexe de l’interleukine-8 (IL-8), interleukin-1β (IL-1β), interleukine-6 (IL-6), interleukine-10 (IL-10), facteur de nécrose tumorale (TNF) et des niveaux de protéine interleukine - 12p 70 (IL - 12p 70) au SMC conditionné support (reportez-vous à l’étape 3.4), utiliser un Tableau de perle commercialisé par cytométrie en flux (CBA) pour des cytokines inflammatoires humains suivant les instructions du fabricant.
- En bref, mélangez les perles de l’anticorps conjugué de capture et les ajouter à tous les tubes à essai. Ajouter les dilutions standard de cytokine ou les échantillons conditionnés moyens aux tubes.
- Ajouter le réactif de détection et incuber pendant 3 heures à température ambiante.
- Laver les billes avec la solution de lavage fourni. Mesurer les échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux et analyser les données selon les instructions du fabricant.
6. génération d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques de l’ostéosarcome.
- Autoriser les six semaines, la femelle, Athymic nu-Foxn1nu souris pour s’acclimater pendant au moins une semaine avant de commencer les procédures expérimentales.
- Un jour avant l’intervention chirurgicale et comme l’analgésie périopératoire ajouter paracétamol à l’eau potable. Diluer la « solution de paracétamol pour les enfants » (voir Table des matières) avec de l’eau pour obtenir une concentration finale de 2 mg/mL. Basé sur une consommation d’eau moyenne de 150 mL/kg/jour, et un poids corporel moyen de 20 g, cette dose est suffisante pour atteindre une dose de 6 mg/souris/jour (300 mg/kg/jour).
- Continuer le traitement analgésique jusqu'à 24 heures après l’opération, ou plus longtemps si les animaux montrent des signes de la douleur.
- Le jour de l’intervention chirurgicale, recueillir des cellules cultivées luciférase positifs (Fluc) 143 ter (précédemment générés par transduction LENTIVIRAUX) par centrifugation à 300 x g pendant 10 min et remettre en suspension les cellules à une concentration de 2 x 105 cellules/µL dans du PBS. Maintenir la suspension de cellules sur la glace à 6 heures.
- Appareils d’électrochirurgie autoclave. Préparer et nettoyer la zone de travail et placer les pinces et ciseaux stérilisés sur feuilles stériles. Vingt minutes avant l’intervention chirurgicale (étape 6,8), injecter par voie sous-cutanée les animaux avec la buprénorphine (0,05 mg/kg, dilué dans du sérum physiologique à 0,9 %) comme analgésique en utilisant des seringues à insuline 0,5 mL (aiguille de calibre 29).
- Juste avant d’anesthésier chaque animal, remplir une seringue de 10 µL au moins 1 µL de la suspension de cellules (Fluc) 143 ter concentrée (voir étape 6.4).
- Anesthésier l’animal avec l’anesthésie par inhalation isoflurane (2 à 3 % d’oxygène). Vérifier le niveau de l’anesthésie par orteil-pincer l’animal. Lorsque l’animal ne réagit pas à la pincer, c'est-à-dire, qu'il est profondément anesthésié, appliquer la pommade sur les yeux pour prévenir le dessèchement pendant l’anesthésie.
- Placez l’animal sur le dos avec la tête dans un masque d’anesthésie et avec les jambes vers l’opérateur. Fléchir le genou gauche. Essuyer la peau avec l’éthanol à 70 % et appliquez lidocaïne (2 %) avec un bout de coton 3 fois comme analgésique local.
- Utiliser un bistouri stérile pour faire une petite incision (environ 5 mm) sur la peau juste au-dessous du genou pour exposer le tibia. Percer un trou d’épingle dans le tibia, environ 2 mm en dessous du genou à l’aide d’un foret hélicoïdal micro de 0,8 mm. Soyez prudent ne pas à percer à travers les deux cortex tibia.
- Injecter 1 µL de la suspension cellulaire (environ 2 x 105 cellules) lentement (en 5 secondes environ) dans le trou à l’aide d’une aiguille de calibre 26. Fermer le trou avec une goutte de colle tissu pour empêcher le reflux de la suspension.
- Fermer la peau avec des sutures monofilament et une goutte de colle tissu. Laissez le récupérer animaux dans un environnement bien chauffé (utiliser une lampe chauffante). N’abandonnez pas animaux jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Seulement après que les animaux sont pleinement récupérés de l’anesthésie, les retourner à leurs propres cages.
- Deux jours après l’inoculation de la tumeur, injecter EV instruits ou naïf GFP-positif MSCs (106 cellules dans 100 µL de PBS, reportez-vous à l’étape 3.5) par voie intraveineuse avec une seringue d’insuline de 0,5 mL dans la veine de la queue des souris.
- Suivez la croissance tumorale par bioluminescence imagerie26 deux fois par semaine. À cette fin, injecter la souris i.p. avec 150 µL de D-luciférine (30 mg/mL) avec une seringue à insuline. Dix minutes après l’injection, positionner les animaux dans la bioluminescence système d’imagerie et de mesurer le photon-flux généré par les cellules tumorales.
- En outre, mesurer le diamètre de la tumeur osseuse primaire avec un pied à coulisse. Largeur x longueur2 x 0,5 estime le volume de la tumeur (en mm3).
- Remarque : Les points limites sont définies comme diamètre de la tumeur > 15 mm ou poids perte > 15 %.
7. évaluation du nombre de nodules pulmonaires
- Lorsque l’un des animaux atteigne le point de terminaison sans cruauté définie à l’étape 6.14 (dans environ 3-4 semaines), mettre fin à l’expérience et de recueillir et d’analyser tous les tissus.
- 10 min avant l’euthanasie, injecter 150 µL D-luciférine (30 mg/mL) avec une seringue d’insuline de 0,5 mL.
- Anesthésier les animaux avec l’anesthésie par inhalation isoflurane (voir étape 6,7). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réactions de la souris à l’orteil-pincement. Euthanasier les souris par dislocation cervicale27.
- Recueillir des poumons, foie, rate et les reins à l’aide de pinces et ciseaux stérilisés. Lavez les organes dans du PBS pour enlever des traces de sang et mettez-les sur un plat de Pétri.
- Placer la boîte de Pétri avec les organes de la bioluminescence, système d’imagerie. Mesurer le signal de bioluminescence des deux côtés des organes. Immédiatement après la mesure, plonger les organes dans du formol de 4 % pour les fixer (24-72 heures, à la droite) pour des analyses histologiques.
- Traiter les images obtenues avec le logiciel d’imagerie approprié par seuillage manuelle. Compter le nombre de nodules pulmonaires sur chaque photo. Compter le nombre total de nodules pulmonaires sur les deux côtés des poumons.
8. histologique analyse
- Pour faire une analyse histologique des tissus pulmonaires :
- Incorporer les organes fixés au formol à la paraffine et préparer des lames de tissu 6 µm.
- Deparaffinate le tissu pulmonaire glisse et effectuer la recherche d’antigène en les faisant bouillir pendant 15 minutes dans un tampon citrate 0,01 M (pH 6).
- Incuber les lames horizontalement à température ambiante avec anti-l’homme vimentine anticorps (200 µg/mL) dilué 1 : 150 en anticorps-diluant (disponible dans le commerce), puis avec l’anticorps secondaire, HRP-étiquetée (0,5 mg/mL en dilution 1/500). Tacher les tissus 3'-diaminobenzidine (DAB) et des taches de comptoir de l’hématoxyline.
- Observer les lames de tissu teinté à l’aide d’un microscope optique couplé à la caméra correspondante et le logiciel d’image.
- Pour évaluer la présence de MSCs GFP-positifs dans les tibias de souris :
- Détartrer les tibias en acide tétraacétique (EDTA) 0,24 M, pH 7,2 – 7,4. Actualiser le tampon EDTA tous les autres jours jusqu'à os deviennent souples (environ 1 semaine).
- Déshydrater les tibias et les infiltrer avec de la paraffine. Incorporer les tibias (y compris les tissus de l’ostéosarcome) dans des blocs de paraffine.
- Un microtome permet de préparer 6 sections de paraffine µm. Déposer les éléments de la paraffine sur lames de verre. Après séchage, stocker des diapositives du jour au lendemain à la température ambiante.
- Effectuer la recherche d’antigène induite par la chaleur à l’aide du tampon citrate (voir 8.1.2) et tacher les tissus avec l’anticorps anti-GFP (antisérum entier) dans une dilution de 1:900 en anticorps-diluant. Contre-coloration tissus avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
- Observer les lames de tissu avec un microscope à fluorescence couplé au logiciel d’imagerie correspondant.
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Representative Results
Dans cette étude, nous avons exploré la capacité des EVs ostéosarcome-sécrété à éduquer MSCs vers un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro. Nous montrons que les cellules d’ostéosarcome libèrent exosome comme EVs qui sont internalisés par MSCs. Nous avons mesuré la modification du profil de l’expression des cytokines MSC induite par le cancer EVs et évalué l’effet des MSCs EV instruits sur la croissance tumorale et de la formation de métastases. La représentation générale de la conception de l’étude est illustrée à la Figure 1.
SVE libéré par les cellules d’ostéosarcome 143 ter ou contrôle les fibroblastes humains ont été purifiés par centrifugation différentielle. Pureté de l’EV a été confirmée par microscopie électronique, qui a révélé que les préparatifs contenaient principalement des vésicules d’un diamètre allant de 40 à 100 nm (Figure 2A). Pour déterminer si le cancer EVs interagissent avec MSCs, nous étiqueté les vésicules avec un colorant fluorescent vert lipophiles linker (GFLD) et les incubés durant une nuit avec les cellules cibles. Microscopie à fluorescence, nous avons observé l’absorption efficace EV par MSCs (Figure 2B). En outre, analyse en cytométrie en flux a montré que les EVs ostéosarcome et contrôle sont internalisées avec une efficacité comparable (Figure 2C). Afin d’étudier si ostéosarcome EVs modifient les propriétés immunomodulatrices de MSCs, nous avons utilisé un test immunologique multiplex cytokine axée sur la perle, qui a montré que la tumeur EVs déterminent une augmentation de 2 fois dans la production d’IL-8 et d’IL-6 par rapport aux fibroblastes humains contrôler les EVs (Figure 2D, E).
Afin d’étudier si l’ostéosarcome EVs éduquer MSCs pour adopter un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro, nous avons utilisé un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescent, de l’ostéosarcome. Toutes les expériences animales ont été effectuées par un seul opérateur. Fluc-143 ter métastatique des cellules ont été transplantées dans le tibia de souris nude athymique, et, après deux jours, ostéosarcome-xénogreffe souris ont été soumises à une seule administration de GFP-positifs EV instruits MSCs. souris recevant MSCs naïf (non scolarisés) ou aucun MSCs ont servi de groupe témoin. Aucuns animaux ne morts avant les points de terminaison décrits. Nous avons démontré par mesure de calibre et imagerie de bioluminescence (BLI) que les souris traitées avec MSCs instruits EV avait accéléré la croissance de la tumeur par rapport aux groupes témoins (Figure 3A). Des images représentatives de la taille de la tumeur de chaque bras de traitement sont indiquées dans la Figure 3C. Nos données indiquent qu’une administration i.v. unique de MSCs instruits affecte la progression tumorale dès J10 après inoculation (Figure 3B). En outre, quatre jours après l’injection systémique d’éduqués/naïve exprimant le GFP MSCs (Figure 4A), nous pouvions visualiser les cellules exprimant le GFP dans la moelle osseuse (Figure 4B) et dans les tissus tumoraux (Figure 4 ( C), démontrant la MSC autoguidage pour le site de la tumeur.
Ex vivo BLI analyse des poumons, foie, rein et rate (données non présentées) a montré la formation de nodules pulmonaires exclusivement dans les poumons chez les souris de tous les groupes de traitement (Figure 4D-F). Étonnamment, souris reçu MSCs instruits EV avait un nombre plus élevé de métastases pulmonaires par rapport aux souris recevant non-éduqués MSCs ou aucun MSCs (Figure 4G), suggérant que dans le microenvironnement tumoral éduqué MSCs augmentation la métastatique potentiel de l’ostéosarcome cellules in vivo7.
Figure 1 . Représentation schématique de la conception de l’étude. MSCs primaires humains sont éduqués avec EVs isolés des cellules cultivées ostéosarcome métastatique (143 ter). Pureté de cancer EV est évaluée par la microscopie électronique et internalisation par MSCs est visualisée par microscopie à fluorescence et analysée par cytométrie en flux. Changements dans le profil d’expression de cytokines MSC sont évaluées par le tableau de perle de cytométrie de flux (CBA). Pour définir le rôle des EV éduqué MSC sur la croissance de la tumeur et la formation de métastases, souris porteuses ostéosarcome sont injectées avec EV-instruit (ou naïf) MSC. La croissance tumorale est suivie de bioluminescence imagerie (BLI) et mesure de calibre, tandis que la formation de métastases est évaluée au virage expérimental par ex vivo BLI et faire une analyse histologique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Purification des EVs et leur interaction avec MSCs. (A) microscopie électronique au microscope d’EVs isolés des cellules 143 ter (barre d’échelle : 100 nm). (B) absorption des GFLD marqués 143 ter EVs de MSCs évalués par microscopie à fluorescence (barre d’échelle : 10 µm). (C) 143 ter d’internalisation des GFLD marqués EVs (orange) ou contrôle (fibroblaste humain, hf) EVs (vert) de MSCs tel qu’analysé par cytométrie en flux. (D) Multiplex détection des cytokines inflammatoires dans les surnageants de MSCs exposés à 143 ter (143 ter EV-SMC) ou hf-EVs (hf EV-MSC) par un tableau de perle de cytométrie de flux. 143 ter-MSC express des niveaux plus élevés d’IL-6 et IL-8 par rapport au témoin (non traitées et hF imprégnées d’EV) MSCs. Les pointillés indiquent le changement dans la production de cytokines. (E) IL-8 et IL-6 concentration de protéines dans les milieux conditionnés de MSCs imprégnées d’EV comme analysées par tableau de perle de cytométrie de flux, exprimé que pli induction par rapport aux témoins non traités. Données sont exprimées en moyenne ± écart-type, n = 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Bioluminescent, modèle de souris xénogreffes orthotopiques de l’ostéosarcome. (A) Estimation du volume de tumeur à l’aide de mesures de l’étrier et (B) la croissance tumorale mesurée par bioluminescence imaging (BLI). Taille de la tumeur est exprimée en flux de photons (photons/sec). p < 0,01, MSC non instruits (n = 6) vs éduqué MSC (n = 6), non appariés test t. Données sont exprimées en moyenne ± images SEM. (C) représentant BLI des souris présentant des tumeurs établies ostéosarcome (panneau supérieur). Échelle de couleurs bar s’étend de 7,7 x 107 (violet) à 2,6 x8 (rouge) photons/10sec. Dans le panneau inférieur, la zone de la tumeur est visualisée sans superposition BLI. Les flèches indiquent le gros de la tumeur. Barreaux de l’échelle : 0,6 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Imagerie de MSCs et ex vivo des tissus pulmonaires. (A) image de microscopie de Fluorescence de GFP-positifs cultivées dérivés adipeux MSCs (vert). (B) Immunofluorescence souillant de GFP-positif MSCs dans la moelle osseuse et (C) dans les tissus tumoraux de souris MSC-réception (vert : MSCs, bleu : DAPI teinté noyaux ; échelle bar 10 µm). (D-F) Ex vivo bioluminescence imaging (BLI) montrant plus grand nombre de foyers métastatiques chez les souris recevant instruits EV MSCs (F) par rapport à des souris recevant naïf MSC (E) ou non MSC (D). Barre d’échelle de couleur s’étend de 1 x 106 (violet) à 1,5 x 106 (rouge) photons/s. (G) Quantification du nombre de métastases pulmonaires comme visualisés par BLI (lignes représentent la médiane ; * p < 0,05, t-test unilatéral). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Vésicules extracellulaires sécrétée à la tumeur (EVs) peuvent influer sur la physiologie des cellules mésenchymateuses les et éloignés pour générer un environnement propice à la tumeur. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome qui permet la dissection des interactions entre cellules tumorales induite par l’EV et les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) in vivo. Nous montrons que l’injection systémique de tumeur humaine MSCs EV-éduqués dans des souris porteuses de xénogreffes ostéosarcome fortement favorise la formation de croissance et de la métastase de cancer en activant l’IL-6/STAT3 signalisation voie7.
Des études récentes ont montré que cancer EVs peuvent aider à la formation de la niche pré métastatique en altérant le comportement du local ou de dérivés de la moelle osseuse des cellules stromales16,28,29. Ces études ont été menées pour la plupart en injectant directement des vésicules provenant du cancer chez la souris destinataire, ce qui complique l’identification des types de cellules responsables des effets favorisant la tumeur. Dans notre protocole, la formation de MSCs avec cancer EVs produit in vitro avant l’injection de MSC. Cette approche permet de traiter de la contribution spécifique de la diaphonie tumeur-MSC à la progression du cancer et réduit au minimum la confusion des effets indirects du cancer EVs sur d’autres composantes de l’environnement local ou systémique.
Afin de déterminer si les MSCs instruits qui abrite le site de la tumeur, nous avons injecté systémiquement MSCs GFP-positif dans la veine de la queue des souris de tumeur-roulement. Les injections de veine de queue sont crucial, mais techniquement difficile étape dans de nombreux protocoles expérimentaux. Afin d’assurer une variation minimale entre les injections, la procédure devrait être effectuée par enquêteurs chevronnés. L’administration intraveineuse correcte peut être confirmée visuellement en observant le mouvement du fluide dans la veine. Si un espace blanc apparaît sur la queue ou la résistance pendant l’injection, un accès vasculaire ne fut pas atteint. Dans ce cas, la procédure doit être répétée en insérant l’aiguille au-dessus du premier site d’injection. Parce que MSCs maison facilement sur la tumeur, administration réussie de MSCs (GFP-positif) peut être confirmée par immunofluorescence souillant du tissu tumoral et la moelle osseuse, quatre jours après l’injection (Figure 4B, C).
Nous montrons que cancer-sécrétée EVs induisent un phénotype tumoral conciliants dans MSCs en modifiant la production de cytokines inflammatoires. Cette constatation est particulièrement pertinente depuis immunomodulation et évasion immunitaire de tumeur sont des mécanismes clés en progression maligne. Nos données suggèrent que le cancer EVs peuvent directement, tel que rapporté par des études indépendantes21,30,31,32,33, ou indirectement (via MSCs) influencent immunitaire innée ou adaptative composants. Toutefois, l’utilisation d’un modèle de xénogreffe (immunodéprimés) limite la possibilité d’enquêter sur cet aspect du SVE. Ainsi, des approches similaires dans les modèles de souris immunocompétentes ou humanisé doivent être entreprises afin de définir le rôle des interactions tumeur-MSC-immunitaire cellulaire EV dans le cancer.
Enfin, parce que MSCs peuvent être recrutés dans la moelle osseuse ou autres sources de tissus aux tumeurs, notre méthode n’est pas limité à l’étude des cancers des os, mais peut être appliquée afin de déterminer le rôle de tumeur instruits EV MSCs dans plusieurs types de cancer2, 3 , 4 , 5 , 6, comme les études récentes dans les modèles de mélanome et lymphome confirmer34.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
S.R. Baglio était soutenue par une bourse par l’Associazione Italiana per le la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-financé par l’Union européenne. En outre, ce projet a reçu de ne financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne en vertu de la Convention de subvention de Marie Sklodowska-Curie aucun 660200 (S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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