Summary
Injeção direta de câncer-derivado de vesículas extracelulares (EVs) leva a reprogramação da medula óssea, apoiando a progressão do tumor; no entanto, que as células mediam este efeito é claro. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para investigar mediada por EV células-tronco mesenquimais de tumor (MSC) interações na vivo, revelando um papel crucial para MSCs EV-educado em metástase.
Abstract
Dentro o microambiente do tumor, residentes ou recrutadas tronco células mesenquimais (MSCs) contribuir para a progressão maligna em vários tipos de câncer. Sob a influência dos sinais ambientais específicos, essas células-tronco adultas pode liberar mediadores parácrina, levando ao crescimento acelerado do tumor e metástases. Definir o crosstalk entre tumor e MSCs é de primordial importância para compreender os mecanismos subjacentes a progressão do câncer e identificar novos alvos para intervenção terapêutica.
As células cancerosas produzem quantidades elevadas de vesículas extracelulares (EVs), que podem afetar profundamente o comportamento das células alvo no microambiente do tumor ou em locais distantes. Tumor EVs Coloque biomoléculas funcionais, incluindo inflamatórias RNAs e proteínas (onco), que podem educar as células do estroma para melhorar o comportamento metastático de células cancerígenas ou para participar na formação pré-metastático nicho. Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de mouse de câncer pré-clínicos que permite a avaliação específica do crosstalk EV-negociada entre o tumor e as células-tronco mesenquimais. Primeiro, descrevemos a purificação e caracterização de tumor-secretada EVs e a avaliação da internalização de EV por MSCs. Então fazemos uso de um imunoensaio baseado no grânulo multiplex para avaliar a alteração do perfil de expressão de citocinas do MSC induzida pelo câncer EVs. Finalmente, podemos ilustrar a geração de um modelo de mouse de transplante ortotópico bioluminescentes de osteossarcoma que recapitula a interação de tumor-MSC e mostrar a contribuição da EV-educado MSCs para formação de crescimento e a metástase do tumor.
Nosso modelo fornece a oportunidade de definir como câncer EVs moldam um ambiente de suporte a tumor e para avaliar se o bloqueio da comunicação mediada por EV entre tumor e MSCs impede a progressão do câncer.
Introduction
O microambiente do tumor participa activamente na maioria, se não todos, os aspectos da progressão tumorigênese e câncer, incluindo a formação de metástases e o desenvolvimento de resistência à terapêutica1. Isto sublinha a necessidade de modelos de rato de câncer ortotópico pré-clínicos que permitem a dissecação das interações complexas tumor-estroma ocorrendo no nicho de tumor.
Entre os muitos componentes celulares do microambiente do tumor, as células-tronco mesenquimais (MSCs) contribuem muito para a progressão do cancro em vários tipos de câncer, como câncer de mama, câncer de próstata, tumores cerebrais, mieloma múltiplo e osteossarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs são células tronco que residem em vários tecidos fetais e adultos, incluindo a medula óssea, tecido adiposo, placenta, sangue de cordão umbilical e outros8,9. Em resposta a sinais inflamatórios gerado pelo câncer, MSCs migram para localizações tumorais, incorporam o microambiente do tumor em, finalmente, se diferenciar em células de câncer-suporte10. Estas MSCs câncer associadas fornecem fatores essenciais (ou seja, fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas e mediadores imunossupressoras) para progressão do tumor agindo em células tumorais e no estroma circundante2, 3 , 11 , 12 , 13. enquanto os efeitos de tumor-promoção do MSCs associada a câncer têm sido investigados em vários modelos de câncer, os mecanismos pelos quais células tumorais reprogram MSCs para dar forma a um nicho de câncer-promoção são mal compreendidos. Aqui descrevemos a geração de um modelo de transplante ortotópico especificamente, permite o estudo da interação entre as células de câncer de osso e MSCs pro-oncogenicidade através de vesículas extracelulares (EVs).
Sve é mediadores cruciais da comunicação intercelular entre tumor e células estromais14. SVE carrega biomoléculas funcionais da célula de origem, incluindo proteínas, lípidos e RNAs regulatórios. Uma vez lançado no espaço extracelular, essas vesículas podem ser absorvidas por células circundantes ou levadas para locais distantes através do sangue ou a circulação linfática e podem influenciar profundamente o comportamento de célula de destino. 15 , 16 , 17 por exemplo, absorção de câncer EVs por fibroblastos do estroma pode resultar na diferenciação de Miofibroblasto apoiando a angiogênese e acelerando o tumor crescimento na vivo18,19, internalização por endotelial as células podem estimular a angiogênese do tumor e aumentar a permeabilidade vascular16,20, e interação com células do sistema imune pode levar à supressão da resposta de imune antitumoral21.
Nós recentemente demonstrado, usando um modelo do rato de transplante ortotópico bioluminescentes de osteossarcoma, que células tumorais liberam quantidades elevadas de EVs que solicitam MSCs para adquirir um fenótipo oncogenicidade-pro e pro-metastático. Este efeito é devido a uma mudança dramática no perfil de expressão de citocinas MSC (referido como "Educação da MSC") e pode ser prevenido pela administração do anticorpo terapêutico do receptor de interleucina-6 (IL-6R)7. Nosso trabalho demonstrou que o câncer EVs são moduladores cruciais do comportamento do MSC, proporcionando assim uma justificativa para abordagens microambiente-alvo deter a progressão do osteossarcoma. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para investigar o tumor mediada por EV-MSC interação na vivo. Este modelo destina-se a: 1) especificamente definir as alterações de câncer induzido por EV de comportamento MSC no microambiente do tumor, 2) avaliar como essa interação contribui para o crescimento do tumor ósseo e formação de metástases e 3) estudo se interferir com o crosstalk mediada por EV em vivo impede a progressão do câncer.
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Protocol
Tecidos adiposo humanos para isolamento de células-tronco mesenquimais foram obtidos do departamento de cirurgia plástica do Hospital Tergooi (Hilversum, Países Baixos), após aprovação pelo Comitê de ética institucional e escritos consentimento informado. GFP-positivo adiposas MSCs foram obtidas do departamento de medicina e Ciências cirúrgicas para crianças e adultos (Universidade de Modena e Reggio Emilia).
Experiências em animais foram realizadas em conformidade com a lei holandesa sobre experimentação animal e o protocolo foi aprovado pelo Comitê em experimentação animal do centro médico de VU University, Amsterdam, Países Baixos.
1. isolamento de vesículas extracelulares secretadas por Tumor.
- Preparar empobrecido EV Fetal bovino soro (FBS) por centrifugação FBS a 70.000 x g durante a noite (16 horas), sem freio, a 4 ° C, utilizando um rotor de balde ultra balançando (esperar 1h para desaceleração). Recolha cuidadosamente o sobrenadante (FBS EV-esgotada) sem perturbar o sedimento. Filtre o FBS EV-esgotada com um filtro de 0,22 µm.
- Preparar meio de cultura EV-esgotada, completando médio (IMDM modificado Dulbecco a Iscove) com 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, glutamina 2 mM (1 x P/S/G) e 5% FBS EV-esgotada.
- Sementes de 3 x 106 143 células em frascos de2 175 cm e cultura-los em meio de cultura EV-esgotada em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Quando as células são 80-90% de confluencia (tipicamente após 36 h a 48 h), recolha o sobrenadante de 8 x 175 cm2 frascos (28 mL/frasco) para isolamento de EV.
- Pre-Limpe o sobrenadante celular para remover células e restos celulares por centrifugação diferencial (centrifugação o sobrenadante do spin anterior cada vez), de acordo com o seguinte protocolo:
- Centrifugue o sobrenadante duas vezes a 500 x g durante 10 minutos.
- Centrifugue o sobrenadante duas vezes a 2000 x g, durante 15 min.
- Centrifugue o sobrenadante duas vezes a 10.000 x g, durante 30 min.
- Execute todas as centrifugações a 4 ° C, com máxima aceleração e desaceleração velocidades. Depois de cada passo, cuidadosamente recolha o sobrenadante contendo EV, deixando cerca de 1 mL. Proceda imediatamente para a etapa de 1,5 ou loja o pre-apuradas condicionado médio a-80 ° C até isolamento EV.
- Isolar o EVs por centrifugação o meio condicionado previamente limpo uma vez a 70.000 x g, durante 1 h, lento do freio, a 4 ° C em tubos de ultracentrífuga (volume final 38,5 mL/tubo) usando um rotor de balde ultra balançando.
- Cuidadosamente Retire o sobrenadante, deixando cerca de 1 mL por trás, Ressuspender as pelotas EV-contendo o volume restante, piscina-los todos em um tubo se e adicionar tampão fosfato salino (PBS) até o enchimento completo do tubo (volume final 38,5 mL).
- Centrifugar novamente 70.000 x g por 1 h a 4 ° C, sem freio (esperar 1h para desaceleração). Cuidadosamente, remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e deixar 100-200 µ l.
- Ressuspender o EV e ajustar o volume final de 200 µ l com PBS (padronizado para todos os isolamentos-EV). Use a preparação EV imediatamente ou armazenar a-80 ° C até uso22.
Nota: EVs podem ser armazenados a 6 meses a-80 ° C.
2. EV caracterização.
EVs purificados podem ser visualizados por transmissão de microscopia eletrônica (TEM)23.
- Preps Mix EV com um volume igual de paraformaldeído 4% em tampão fosfato.
- Casaco 200 mesh Formvar-carbono revestido grades TEM de níquel com 5 µ l de suspensão de EV por 20 min em temperatura ambiente.
- Fixar as amostras de EV nas grades TEM com glutaraldeído de 1% em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,0), contraste com oxalato de uranilo (pH 7.0) e incorporar em uma mistura de 4% de uranilo acetato e 2% metil celulose em proporção de 1:9 no gelo.
- Retire grades com loops de aço inoxidável e secar o excesso de líquido com papel de filtro para garantir uma espessura apropriada do filme metil celulose.
- Após a secagem, examinar grades com um microscópio eletrônico de transmissão e capturar imagens com uma câmera digital, juntamente com o software de imagem correspondente.
3. educação do MSCs pelo tumor derivado EVs.
- Preparar o meio de cultura MSC completando alfa-mínima média essencial (alfa-MEM) com 4% EV empobrecido humana plaquetas lisado (hPL)24, heparina (10 U/mL) e 1 x P/S/G.
Nota: EV-esgotada hPL é obtido seguindo o procedimento descrito na seção 1.1. - Semente de 1.4 x 106 adiposo-derivado MSCs por balão2 de 75 cm e cultura-los EV empobrecido MSC-meio de cultura numa incubadora a 37 ° C e 5% CO2.
- Quando células alcançar 70% confluência, adicionar 143 osteossarcoma - ou controlar fibroblastos humanos (hf)-EVs, 10 µ l EV preparação/cm2 do frasco de cultura. Incubar 24 horas e adicionar a mesma quantidade de EVs para mais 6 horas. Nota: Fibroblastos humanos são cultivados em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) 10% FBS e EVs são isolados, conforme descrito na seção 1.
- Recolher o sobrenadante MSC, centrifugar 1 x 500 x g por 5 min a 4 ° C (com aceleração máxima e ajustes de velocidade de desaceleração), transfira para um tubo novo e armazenar o sobrenadante apurado a-80 ° C para permitir a análise futura de citocina (secção 5).
- In vivo experimentos (secção 6), educar GFP-positivo MSCs25 conforme descrito nas seções 3.1 a 3.3, coletar as células e Resuspenda-los em PBS em uma concentração final de 106 células por 100 µ l. manter as células no gelo até injeção.
4. ensaio de internalização EV.
Para visualizar a captação de EV por MSCs, rotule EVs com um corante verde-fluorescente vinculador (GFLD) (comercialmente disponível) seguindo o protocolo do fabricante:
- Brevemente, adicione 180 µ l de diluente para a preparação de EV de 200 µ l. Diluir 1 µ l de corante GFLD em 50 µ l de diluente e adicionar 20 µ l de corante diluído para a preparação de EV diluída.
- Delicadamente misture pipetando e incubar durante 3 min à temperatura ambiente no escuro.
- Adicionar 5 mL de 0.1% BSA em PBS, transferir para tubos de centrífuga-ultra e encher o tubo com PBS (volume final 38,5 mL/tubo).
- Centrifugar 1 x a 70.000 x g, durante 1 h a 4 ° C, sem freio (esperar 1h para desaceleração). Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender o rotulado EV-em um volume final de 200 µ l (ajustar o volume com PBS).
- Adicionar o EVs etiquetado para a cultura MSC ou armazená-los a-80 ° C. Após a incubação durante a noite, avaliar a internalização de vesículas por microscopia de fluorescência e fluxo cytometry7.
5. avaliação do perfil de expressão de citocinas MSC.
- Para a quantificação de multiplex de interleucina-8 (IL-8), interleucina-1 β (IL-1 β), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), fator de necrose tumoral (TNF) e níveis de proteína interleucina - 12p 70 (IL - 12p 70) no MSC condicionado médio (ver passo 3.4), use um matriz de grânulo de cytometric comercialmente disponíveis (CBA) por citocinas inflamatórias humanas, seguindo as instruções do fabricante.
- Brevemente, misturar os grânulos de captura anticorpo conjugado e adicioná-los a todos os tubos de ensaio. Adicione as diluições padrão de citocinas ou as amostras médias condicionadas aos tubos.
- Adicionar o reagente de detecção e incubar 3 horas no RT
- Lave os grânulos com a solução de lavagem fornecido. Medir as amostras usando um citômetro de fluxo e analisar os dados de acordo com as instruções do fabricante.
6. geração de um modelo de Mouse de transplante ortotópico de osteossarcoma.
- Permitir que os ratos Athymic nu-Foxn1nu seis semanas de idade, do sexo feminino, se adapte pelo menos uma semana antes de iniciar os procedimentos experimentais.
- Um dia antes do procedimento cirúrgico e como analgesia peri-operatório adicione paracetamol para a água potável. Diluir a "solução de paracetamol para crianças" (ver Tabela de materiais) com água para se obter uma concentração final de 2 mg/mL. Com base em um consumo médio de água de 150 mL/kg/dia, e um peso médio de 20 g, esta dose é suficiente para chegar a uma dosagem de 6 mg/rato/dia (300 mg/kg/dia).
- Continue o tratamento analgésico até 24 horas após a operação, ou mais, se os animais apresentam sinais de dor.
- No dia do procedimento cirúrgico, coletar luciferase-positivo (Fluc) 143 células cultivadas (anteriormente geradas pelo Lentivirus transdução) por centrifugação a 300 x g por 10 min e ressuspender as células em uma concentração de 2 x 105 células / µ l em PBS. Manter a suspensão de células no gelo até 6 horas.
- Equipamento cirúrgico de autoclave. Preparar e limpar a área de trabalho e coloque a tesoura esterilizada e pinça em folhas estéreis. 20 min antes do procedimento cirúrgico (etapa 6,8), injetar os animais por via subcutânea com buprenorfina (0,05 mg/kg, diluída em soro fisiológico a 0,9%) como analgésico, usando seringas de insulina 0,5 mL (agulha de 29).
- Antes só anestesiar cada animal, encher uma seringa de 10 µ l com pelo menos 1 µ l de suspensão de células de concentrado (Fluc) 143 (consulte a etapa 6.4).
- Anestesia o animal com anestesia de inalação de isoflurano (2-3% de oxigênio). Verificar o nível de anestesia pelo dedo do pé-beliscar o animal. Quando o animal não reage para beliscar, ou seja, que é profundamente anestesiada, aplica a pomada sobre os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- Posicione o animal em suas costas com a cabeça em uma máscara de anestesia e com as pernas em direção ao operador. Flexione o joelho esquerdo. Limpe a pele com álcool 70% e aplicar a lidocaína (2%) com uma ponta de algodão 3 vezes como analgésico local.
- Use uma faca cirúrgica estéril para fazer uma pequena incisão (cerca de 5 mm) na pele logo abaixo do joelho para expor a tíbia. Perfure um furo na tíbia, aproximadamente 2 mm abaixo do joelho, usando uma broca de torção micro de 0,8 mm. Tenha cuidado para não perfurar a ambos os córtices de tíbia.
- Injete a suspensão de células de 1 µ l (cerca de 2 x 105 células) lentamente (em aproximadamente 5 segundos) no orifício usando uma agulha de calibre 26. Feche o buraco com uma gota de cola de tecido para evitar o refluxo da suspensão.
- Feche a pele com suturas monofilamento e uma gota de cola de tecido. Deixe o animal recuperar em um ambiente aquecido (uso uma lâmpada de calor). Não abandone animais até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Somente depois que os animais são totalmente recuperados da anestesia, devolvê-los para suas próprias gaiolas.
- Dois dias após a inoculação do tumor, injetar EV educado ou MSCs ingênuo GFP-positivo (106 células em 100 µ l de PBS, consulte a etapa 3.5) por via intravenosa com uma seringa de insulina 0,5 mL na veia da cauda dos ratos.
- Acompanhar o crescimento do tumor por bioluminescência26 de imagem duas vezes por semana. Para este fim, injetar o i.p. de ratos com 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) com uma seringa de insulina. Dez minutos após a injeção, posicione os animais na bioluminescência sistema de imagem e medir o fluxo de fótons gerado pelas células do tumor.
- Além disso, medir o diâmetro do osso-tumor primário com um paquímetro. O volume do tumor (em mm3) estima-se pela largura x comprimento2 x 0.5.
- Nota: Pontos de extremidade humanos são definidos como diâmetro do tumor > perda de peso ou 15 mm > 15%.
7. a avaliação do número de nódulo pulmonar
- Quando um dos animais atinge o ponto de extremidade humano definido na etapa 6.14 (em aproximadamente 3-4 semanas), encerrar o experimento e coletar e analisar todos os tecidos pertinentes.
- Dez minutos antes da eutanásia, injetar 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) com uma seringa de insulina de 0,5 mL.
- Anestesiar os animais com anestesia por inalação de isoflurano (consulte a etapa 6,7). Confirme a profundidade de anestesia pela ausência de reações do mouse para beliscar por ponto-e-dedo do pé. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical27.
- Recolha os pulmões, fígado, baço e rins usando uma pinça e tesoura esterilizada. Lave os órgãos em PBS para remover vestígios de sangue e colocá-los em um prato de Petri.
- Coloque a placa de Petri com os órgãos na bioluminescência sistema de imagem. Medir o sinal de bioluminescência em ambos os lados dos órgãos. Imediatamente após a medição, mergulhe os órgãos em formol a 4% para fixa-los (24-72 horas, a RT) para futura análise histológica.
- Processe as imagens obtidas com software de imagem apropriado pela limiarização manual. Conte o número de nódulos pulmonares em cada foto. Conte o número total de nódulos pulmonares em ambos os lados dos pulmões.
8. histológica análise
- Para a análise histológica dos tecidos pulmonares:
- Incorporar os órgãos fixada em formol em parafina e preparar 6 µm slides de tecido.
- Deparaffinate tecido pulmonar desliza e executar a recuperação do antígeno fervendo-os por 15 min em 0,01 M de tampão citrato (pH 6).
- Incube as lâminas na horizontal em temperatura ambiente com 1:150 de anticorpo (200 µ g/mL) diluído anti-humano vimentina no anticorpo-diluente (comercialmente disponível) e, posteriormente, com o anticorpo secundário, HRP-etiquetada (0,5 mg/mL, diluição 1: 500). Mancha os tecidos com 3'-diaminobenzidine (DAB) e coloração de hematoxilina contador.
- Observe os slides de tecido manchado usando microscópio óptico acoplado à câmera correspondente e software de imagem.
- Para avaliar a presença de GFP-positivo MSCs em tíbias de rato:
- Descalcificar as tíbias em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Atualize o buffer de EDTA todos os dias até que os ossos tornam-se flexíveis (cerca de 1 semana).
- Desidratar tíbias e nos infiltrar com parafina. Incorpore as tíbias (incluindo tecido osteossarcoma) em blocos de parafina.
- Use um micrótomo para preparar 6 µm cortes de parafina. Coloca as seções de parafina em lâminas de vidro. Após a secagem, armazene slides durante a noite em temperatura ambiente.
- Executar recuperação de antígeno mediada por calor usando tampão citrato (ver 8.1.2) e manchar os tecidos com anticorpo anti-GFP (anti-soro inteiro) em uma diluição de 1:900 no anticorpo-diluente. Counterstain os tecidos com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observe os slides de tecido com um microscópio de fluorescência, juntamente com o software de imagem correspondente.
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Representative Results
Neste estudo, nós exploramos a capacidade de osteossarcoma-secretada EVs para educar MSCs para um fenótipo de oncogenicidade-pro e pro-metastático. Vamos mostrar que células de osteossarcoma liberam exossomo como EVs que são internalizados por MSCs. Nós medido a alteração do perfil de expressão do cytokine MSC induzida pelo câncer EVs e avaliado o efeito dos MSCs EV-educado no crescimento do tumor e a formação de metástases. A representação geral do estudo design é ilustrada na Figura 1.
SVE liberado pelas células de osteossarcoma 143 ou controle de fibroblastos humanos foram purificados por centrifugação diferencial. Pureza de EV foi confirmada por microscopia electrónica, que revelou que as preparações continham principalmente vesículas com um diâmetro que varia entre 40-100 nm(Figura 2). Para avaliar se o câncer EVs interagem com MSCs, nós rotulado as vesículas com um corante lipofílico vinculador verde-fluorescente (GFLD) e incubadas-los durante a noite com as células alvo. Por microscopia de fluorescência, observamos eficiente absorção de EV por MSCs (Figura 2B). Além disso, a análise de citometria de fluxo mostrou que EVs osteossarcoma e controle são internalizados com eficiência comparável (Figura 2C). Para investigar se o osteossarcoma EVs alteram as propriedades immunomodulatory MSCs, usamos um imunoensaio multiplex baseado no grânulo de citocinas, que mostrou que o tumor EVs determinam um aumento de 2 vezes na produção de IL-8 e IL-6 em comparação com fibroblastos humanos controle de EVs (Figura 2D, E).
Para investigar se o osteossarcoma EVs educar MSCs para adotar um fenótipo metastático-pro e pro-oncogenicidade, utilizamos um modelo de mouse de transplante ortotópico bioluminescentes, de osteossarcoma. Todas as experiências em animais foram realizadas por um operador. 143-Fluc metastático de células foram transplantadas em tíbia de ratos nude modelo, e, depois de dois dias, osteossarcoma-xenografted ratos foram submetidos a uma única administração de GFP-positivo EV-educado MSCs. ratos recebendo MSCs ingênuo (não-educado) ou sem MSCs foram usados como grupos de controle. Nenhum animal morreu antes dos pontos de extremidade descritos. Temos demonstrado pela medição da maxila e imagens de bioluminescência (BLI) que ratos tratados com MSCs EV-educado tinham acelerado crescimento do tumor em comparação com grupos de controle(Figura 3). Imagens representativas do tamanho do tumor de cada braço do tratamento são mostradas na Figura 3C. Nossos dados indicam que uma administração intravenosa única de MSCs educados afeta a progressão do tumor logo em 10 dia após a inoculação (Figura 3B). Além disso, quatro dias após a injeção sistêmica de GFP-expressando MSCs (Figura 4A), educado/ingênuo poderia visualizamos GFP-expressando as células da medula óssea (Figura 4B) e no tecido do tumor (Figura 4 ( C), demonstrando a MSC, orientação para o local do tumor.
Ex vivo BLI análise dos pulmões, fígado, rins e baço (dados não mostrados) mostrou a formação de nódulos pulmonares exclusivamente nos pulmões em ratos de todos os braços de tratamento (Figura 4D-F). Surpreendentemente, ratos recebendo MSCs EV-educado teve maior número de metástases pulmonares, em comparação com ratos recebendo não-educados MSCs ou não MSCs (Figura 4G), sugerindo que dentro o microambiente do tumor educado MSCs aumento o metastático potencial de osteossarcoma células na vivo7.
Figura 1 . Representação esquemática do estudo design. MSCs primárias humanas são educados com EVs isolados de células cultivadas osteossarcoma metastático (143). Pureza de câncer EV é avaliada pela microscopia eletrônica, e internalização por MSCs é visualizada por microscopia de fluorescência e analisada por citometria de fluxo. Mudanças no perfil de expressão de citocinas MSC são avaliadas pela matriz de grânulo cytometric (CBA). Para definir o papel do EV educado MSC no crescimento do tumor e formação de metástases, ratos de osteossarcoma-rolamento são injetados com EV-educado (ou ingênuo) MSC. O crescimento do tumor é seguido por imagens de bioluminescência (BLI) e medição do compasso de calibre, enquanto a formação de metástases é avaliada no ponto de extremidade experimental por ex vivo BLI e análise histológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Purificação do EVs e sua interação com MSCs. (A) Micrografia de microscopia eletrônica de transmissão de EVs isolado de células de 143 (barra de escala: 100 nm). (B) absorção de GFLD-rotulado 143 EVs por MSCs avaliados por microscopia de fluorescência (barra de escala: 10 µm). (C) internalização de GFLD-rotulado 143 EVs (laranja) ou controle (fibroblasto humano, hf) EVs (verde) por MSCs como analisados por citometria de fluxo. (D) Multiplex deteção de citocinas inflamatórias nos sobrenadantes de MSCs expostos a 143 (143 EV-MSC) ou hf-EVs (hf EV-MSC) pela matriz de cytometric do grânulo. 143-MSC expressar níveis mais elevados de IL-6 e IL-8 em relação ao controle (não tratados e hF EV-tratados) MSCs. As linhas pontilhadas indicam a mudança na produção de citocinas. (E) IL-8 e IL-6 concentração da proteína na mídia condicionada de MSCs EV-tratados como analisados pela matriz de grânulo cytometric, expressado como dobrar a indução em relação ao controle não tratado. Os dados são expressos como média ± DP, n = 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Bioluminescentes, ortotópico xenoenxertos modelo do rato osteossarcoma. (A) estimativa do volume do tumor usando medições paquímetro e (B) o crescimento do tumor medido pela bioluminescência imaging (BLI). Tamanho do tumor é expressa como o fluxo de fótons (fótons/s). p < 0,01, não-educado MSC (n = 6) vs educado MSC (n = 6), não emparelhadas, teste-t. Os dados são expressos como média ± imagens de SEM. (C) representante BLI de ratos com tumores osteossarcoma estabelecido (painel superior). Varia de bar cor-escala de 7,7 x 107 (roxo) para 2,6 x 108 (vermelho) fótons/s. No painel inferior, a área de tumor é visualizada sem sobreposição BLI. As setas indicam o volume do tumor. Barras de escala: 0,6 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Imagem de MSCs e tecido de pulmão ex vivo . (A) imagem de microscopia de fluorescência de GFP-positivo culta adiposo-derivado MSCs (verde). (B) mancha da imunofluorescência de GFP-positivo MSCs na medula óssea e (C) no tecido do tumor da MSC-recebendo ratos (verde: MSCs, azul: DAPI manchado núcleos; escala bar 10 µm). (D-F) Ex vivo bioluminescência imaging (BLI) apresentando maior número de focos metastáticos em ratos recebendo EV-educado MSCs (F) em comparação com ratos recebendo ingênuo MSC (E) ou não MSC (D). Barra de escala de cores varia de 1 x 106 (roxo) de 1,5 x 106 (vermelho) fótons/s. (G) quantificação do número de metástases pulmonares como visualizado pela BLI (linhas representam a mediana; * p < 0.05, teste t uni-caudal). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vesículas extracelulares secretadas por tumor (EVs) podem alterar a fisiologia das células mesenquimais locais e distantes para gerar um ambiente de apoio-tumor. Aqui descrevemos a geração de um modelo de mouse pré-clínicos de osteossarcoma que permite que a dissecação das interações entre células tumorais mediada por EV e tronco mesenquimal cells (MSCs) na vivo. Nós mostramos que injeção sistêmica de tumor humano MSCs EV-educado em camundongos rolamento xenografts osteossarcoma fortemente promove a formação de crescimento e a metástase do cancro ativando a IL-6/STAT3 sinalização via7.
Estudos recentes têm mostrado que câncer EVs podem auxiliar na formação do nicho pre-metastático, alterando o comportamento do local ou da medula óssea-derivado de células do estroma16,28,29. Estes estudos têm sido realizados principalmente injetando diretamente derivado de câncer vesículas no rato do destinatário, o que dificulta a identificação dos tipos de célula responsáveis para os efeitos do tumor-promoção. Em nosso protocolo, a educação do MSCs com câncer EVs ocorre em vitro antes da injeção do MSC. Esta abordagem permite o endereçamento da contribuição específica do crosstalk tumor-MSC a progressão do cancro e minimiza os efeitos indirectos confundimento de câncer EVs em outros componentes do ambiente local ou sistêmico.
Para avaliar se o MSCs educados em casa para o local do tumor, injetamos sistemicamente MSCs GFP-positivo na veia da cauda dos ratos tumor-rolamento. Injeções de veia da cauda são cruciais, mas tecnicamente desafiador passo em muitos protocolos experimentais. Para garantir a mínima variação entre injeções, o procedimento deve ser realizado por investigadores experientes. Correta administração intravenosa pode ser confirmada visualmente, observando o movimento do fluido na veia. Se uma área em branca aparece na cauda ou resistência durante a injeção, acesso vascular não foi alcançado. Neste caso, o procedimento deve ser repetido, inserindo a agulha acima o primeiro site de injeção. Porque MSCs prontamente em casa em sobre o tumor, administração bem sucedida do MSCs (GFP-positivo) pode ser confirmada por imunofluorescência coloração do tecido do tumor e da medula óssea, quatro dias após a injeção (Figura 4B, C).
Nós mostramos que câncer-secretada EVs induzem um tumor-apoio fenótipo em MSCs, alterando a produção de citocinas inflamatórias. Esta conclusão é particularmente relevante desde imunomodulação e evasão imune tumor são mecanismos chaves na progressão maligna. Nossos dados sugerem que o câncer EVs podem diretamente, conforme relatado por estudos independentes21,30,31,32,33, ou indiretamente (via MSCs) influenciar imune inata ou adaptável componentes. No entanto, o uso de um modelo de enxerto heterólogo (imunodeprimidos) limita a possibilidade de investigar este aspecto do EVs. Portanto, abordagens semelhantes em modelos do rato imunocompetentes ou humanizado precisam ser realizada para definir o papel das interações célula de tumor-MSC-imune mediada por EV em câncer.
Finalmente, porque MSCs podem ser recrutados para tumores da medula óssea ou outras fontes de tecido, nosso método não está restrito ao estudo de câncer de osso, mas pode ser aplicado para investigar o papel de tumor MSCs EV-educado em câncer Múltiplo tipos2, 3 , 4 , 5 , 6, como estudos recentes em modelos de melanoma e linfoma confirmar34.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
S.R. Baglio foi apoiado por uma bolsa pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), co-financiado pela União Europeia. Além disso, este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação de Horizonte 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 660200 (a S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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