Summary
Inyección directa de vesículas extracelulares derivadas de cáncer (EVs) conduce a la reprogramación de la médula ósea apoyando la progresión del tumor; sin embargo, está claro que las células median este efecto. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar EV-mediada de células madre tumorales mesenquimales (MSC) interacciones en vivo, revelando un papel crucial para MSCs EV-educado en metástasis.
Abstract
En el microambiente tumoral, residentes o a las células madre mesenquimales (MSCs) contribuyen a la progresión maligna en varios tipos de cáncer. Bajo la influencia de señales ambientales específicas, estas células madre adultas pueden liberar mediadores paracrinos conduce a crecimiento acelerado del tumor y metástasis. Definición de la diafonía entre tumor y MSCs es de vital importancia para entender los mecanismos subyacentes a la progresión del cáncer y para identificar nuevas dianas para la intervención terapéutica.
Las células cancerosas producen altas cantidades de vesículas extracelulares (EVs), que pueden afectar profundamente el comportamiento de las células Diana en el microambiente del tumor o en sitios distantes. Tumor EVs incluyen biomoléculas funcionales, incluyendo inflamatorios RNAs y proteínas (onco), que pueden educar a células estromales para mejorar el comportamiento metastático de las células cancerosas o para participar en la formación de nichos previamente metastásico. En este artículo, describimos el desarrollo de un modelo de ratón de cáncer preclínico que permite la evaluación específica de la diafonía EV-mediada entre el tumor y las células madre mesenquimales. En primer lugar, describimos la purificación y caracterización de EVs secretada por el tumor y la evaluación de la internalización de EV por MSCs. Entonces hacemos uso de un inmunoensayo multiplex basados en grano para evaluar la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs. Por último, ilustramos la generación de un modelo de ratón de xenoinjerto de orthotopic bioluminiscente de osteosarcoma que recapitula la interacción tumor-MSC y mostrar la contribución de la educación EV MSCs a formación crecimiento y metástasis del tumor.
Nuestro modelo ofrece la oportunidad de definir cómo cáncer EVs forma un entorno de apoyo al tumor y para evaluar si el bloqueo de la comunicación mediada por EV entre tumor y MSCs previene la progresión del cáncer.
Introduction
El microambiente tumoral participa activamente en la mayoría, si no todos, los aspectos de la progresión de la tumorigénesis y cáncer, incluyendo la formación de metástasis y el desarrollo de la resistencia a la terapéutica1. Esto subraya la necesidad de modelos de ratón de cáncer preclínico orthotopic que permite la disección de las interacciones del tumor-estroma complejo que ocurre en el lugar del tumor.
Entre los muchos componentes celulares del microambiente tumoral, las células madre mesenquimales (MSCs) fuertemente contribuir a la progresión del cáncer en varios tipos de cáncer como el cáncer de mama, cáncer de próstata, tumores cerebrales, mieloma múltiple y osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs son células multipotentes que residen en varios tejidos adultos y fetales, incluyendo médula ósea, tejido adiposo, placenta, cordón umbilical y otros8,9. En respuesta a señales inflamatorias generadas por cáncer, MSCs migran hacia sitios de tumor, incorporan en el microambiente del tumor y finalmente se diferencian en células de apoyo de cáncer10. Estas MSCs asociada con el cáncer proporcionan factores esenciales (es decir, factores de crecimiento, quimiocinas, citoquinas y mediadores inmunosupresores) para la progresión del tumor actuando sobre las células tumorales y el estroma circundante2, 3 , 11 , 12 , 13. mientras el tumor-promover efectos de MSCs asociada con el cáncer han sido investigados en numerosos modelos de cáncer, son poco conocidos los mecanismos por los cuales las células del tumor reprogramar MSCs para dar forma a un nicho de promoción de cáncer. Aquí describimos la generación de un modelo de xenoinjerto de orthotopic que permite específicamente el estudio de la interacción pro-tumorigenic entre las células de cáncer de hueso y MSCs mediante vesículas extracelulares (EVs).
EVs son mediadores cruciales de la comunicación intercelular entre el tumor y las células stromal14. EVs llevar biomoléculas funcionales de la célula de origen, incluyendo proteínas, lípidos y RNAs reguladoras. Una vez liberado en el espacio extracelular, estas vesículas pueden ser tomadas por las células circundantes o llevaron a sitios distantes por medio de la sangre o la circulación linfática y profundamente pueden influir el comportamiento de la célula blanco. 15 , 16 , 17 por ejemplo, absorción de cáncer EVs por fibroblastos del estromales puede resultar en miofibroblastos diferenciación apoyo angiogénesis y acelerar el tumor crecimiento en vivo18,19, internalización por endotelial las células pueden estimular la angiogénesis tumoral y aumentar la permeabilidad vascular16,20, y la interacción con las células inmunes podría conducir a la supresión de la respuesta inmune antitumoral21.
Recientemente demostramos, usando un modelo de ratón de xenoinjerto bioluminiscente orthotopic del osteosarcoma, que las células tumorales liberan gran cantidad de EVs que MSCs para adquirir un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Este efecto es debido a un cambio drástico en el perfil de expresión de citoquinas MSC (denominado "Educación MSC") y puede prevenirse mediante la administración de un anticuerpo de terapéutica del receptor de la interleucina 6 (IL-6R)7. Nuestro trabajo demostró que el cáncer EVs son moduladores cruciales del comportamiento MSC, así proporcionando un análisis razonado para enfoques dirigidos a microambiente detener la progresión de osteosarcoma. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar la MSC de tumor EV-mediada interacción en vivo. Este modelo se pretende: 1) específicamente definir las alteraciones de cáncer EV-inducido del comportamiento MSC en el microambiente tumoral, 2) evaluar cómo esta interacción contribuye a crecimiento de tumor de hueso y formación de metástasis y 3) estudio si interferir con la interferencia mediada por EV en vivo previene la progresión del cáncer.
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Protocol
Tejidos adiposos humanos para aislamiento de células madre mesenquimales fueron obtenidos del Departamento de cirugía plástica del Hospital de Tergooi (Hilversum, Holanda) después de la aprobación por el Comité institucional de ética y consentimiento informado por escrito. MSCs adiposos GFP-positivas fueron obtenidos del Departamento de medicina y Ciencias quirúrgicas para niños y adultos (Universidad de Modena y Reggio Emilia).
Los experimentos con animales se realizaron conforme a la Ley holandesa sobre experimentación animal, y el protocolo fue aprobado por la Comisión de experimentación animal del centro médico universitario VU, Ámsterdam, Países Bajos.
1. aislamiento de las vesículas extracelulares secretadas por el Tumor.
- Preparar EV-agotado fetales de bovino suero (FBS) por centrifugación FBS a 70.000 x g durante la noche (16 horas), sin freno, a 4 ° C utilizando un rotor cubo ultra que hace pivotar (esperar 1 h para la desaceleración). Recoger cuidadosamente el sobrenadante (EV-agotado FBS) sin perturbar el pellet. Filtro de la FBS EV-agotado con un filtro de 0,22 μm.
- Preparar medio de cultivo EV-agotado por suplir medio (IMDM modificado Dulbecco de Iscove) con 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, glutamina 2 mM (1 x P/S/G) y 5% FBS EV-agotado.
- 3 x 106 143B células en2 frascos de 175 cm de la semilla y de la cultura en EV-agotado el medio de cultivo en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Cuando las células confluentes de 80-90% (normalmente después de 36 h a 48 h), recoger el sobrenadante de 8 x 175 cm2 frascos (28 mL/frasco) para el aislamiento de EV.
- Pre-eliminar el sobrenadante de células para eliminar las células y restos celulares por centrifugación diferencial (centrifugación el sobrenadante de la vuelta anterior cada vez) según el siguiente protocolo:
- Centrifugar el sobrenadante dos veces a 500 x g por 10 min.
- Centrifugar el sobrenadante dos veces a 2000 x g durante 15 minutos.
- Centrifugar el sobrenadante dos veces a 10.000 x g por 30 min.
- Realizar todos los centrifugados a 4 ° C con máxima aceleración y desaceleración velocidad ajustes. Después de cada paso, recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene el EV, dejando alrededor de 1 mL. Proceder inmediatamente al paso 1.5 o tienda previamente despejado acondicionado medio a-80 ° C hasta aislamiento de EV.
- Aislar EVs por centrifugación el medio condicionado previamente despejado una vez a 70.000 x g durante 1 h, lento freno, a 4 ° C en tubos de centrífuga de ultra (volumen final 38.5 mL/tubo) usando un rotor de cubo ultra que hace pivotar.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante, dejando alrededor de 1 mL detrás, resuspender los pellets que contiene EV en el volumen restante, piscina todo en un tubo de ultracentrífuga y agregar solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta tubo completa (volumen final mL 38,5).
- Centrifugar nuevamente a 70.000 x g durante 1 h a 4 ° C, sin freno (esperar 1 h para la desaceleración). Cuidadosamente Quite el sobrenadante sin perturbar el sedimento y dejar 100-200 μl.
- Resuspender el precipitado de EV y ajustar el volumen final a 200 μL con PBS (estandarizado para todo EV-aislamientos). Utilice la preparación EV inmediatamente o almacenar a-80 ° C hasta uso22.
Nota: EVs puede ser almacenado 6 meses a-80 ° C.
2. EV caracterización.
EVs purificadas pueden visualizarse por microscopía electrónica (TEM) de transmisión23.
- Prepara mezcla EV con un volumen igual de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato.
- Capa 200 malla rejillas de níquel TEM Formvar recubiertas de carbón con 5 μl de la suspensión de la EV por 20 min a temperatura ambiente.
- Para fijar las muestras EV en rejillas TEM con glutaraldehído al 1% en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.0), contraste con oxalato de uranilo (pH 7.0) e integrar en una mezcla de 4% uranilo acetato y 2% metil celulosa en una proporción de 1:9 en el hielo.
- Quitar las rejillas con aros de acero inoxidable y secar el exceso de líquido con papel de filtro para garantizar un adecuado espesor de la película de celulosa de metilo.
- Después del secado, examinar las rejillas con un microscopio electrónico de transmisión y captura imágenes con una cámara digital juntada con el correspondiente software de imagen.
3. Educación de MSCs por tumor derivado de la EVs.
- Preparar medio de cultivo MSC por suplir medio esencial mínimo de alfa (alfa-MEM) con 4% EV-agotado humano lisado plaquetario (hPL)24, heparina (10 U/mL) y 1 x P/S/G.
Nota: EV-agotado hPL se obtiene siguiendo el procedimiento descrito en el punto 1.1. - Semillas 1.4 x 106 origen adiposo MSCs cada frasco de 75 cm2 y cultura EV-agotado MSC-medio de cultivo en un incubador a 37 ° C y 5% de CO2.
- Cuando las células alcanzan confluencia de 70%, añadir 143B osteosarcoma - o control de fibroblastos humanos (hf)-EVs, 10 μl EV preparación/cm2 del frasco de cultivo. Incubar durante 24 horas y agregar la misma cantidad de EVs para 6 horas adicionales. Nota: Fibroblastos humanos se cultivan en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) 10% FBS y EVs están aislado como se describe en la sección 1.
- Recoger el sobrenadante MSC, Centrifugue 1 x a 500 x g durante 5 min a 4 ° C (con máxima aceleración y ajustes de la velocidad de desaceleración), transferir a un tubo nuevo y guarde el sobrenadante despejado a-80 ° C para permitir el análisis del futuro del cytokine (sección 5).
- In vivo experimentos (sección 6), educar GFP-positivas MSCs25 descrito en las secciones 3.1 a 3.3, recoger las células y les vuelva a suspender en PBS a una concentración final de 106 células por 100 μl. mantener las células en hielo hasta la inyección.
4. EV internalización ensayo.
Para visualizar la absorción EV por MSCs, EVs con un tinte verde fluorescente vinculador (GFLD) (comercialmente disponible) siguiendo el protocolo del fabricante de la etiqueta:
- Brevemente, añadir 180 μl de diluyente a la preparación de EV de 200 μl. Diluya 1 μl de colorante GFLD en 50 μl de diluyente y añadir 20 μl de colorante diluido a la preparación EV diluida.
- Suavemente mezclar mediante pipeteo e incubar 3 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Añadir 5 mL de 0.1% de BSA en PBS, transferencia a tubos de centrífuga de ultra y llenar el tubo con PBS (volumen final 38.5 mL/tubo).
- Centrifugar 1 x 70.000 x g durante 1 h a 4 ° C, sin freno (esperar 1 h para la desaceleración). Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de EV etiquetado en un volumen final de 200 μl (ajustar volumen con PBS).
- Añadir el etiqueta EVs a la cultura MSC o almacenar a-80 ° C. Después de la incubación durante la noche, evaluar la interiorización de la vesícula por microscopía de fluorescencia y flujo cytometry7.
5. evaluación del perfil de expresión de citoquinas MSC.
- Para la cuantificación múltiplex de Interleucina-8 (IL-8), interleucina-1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), factor de necrosis tumoral (TNF) y los niveles de la proteína interleucina - 12p 70 (IL - 12p 70) en el MSC acondicionado medio (ver paso 3.4), utilizar un matriz de grano cytometric comercialmente disponibles (CBA) de las citoquinas inflamatorias humanas siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Brevemente, el conjugado de anticuerpo de captura los granos de la mezcla y añadir a todos los tubos de ensayo. Añadir las diluciones estándar de citocinas o las muestras de medio condicionadas a los tubos.
- Añadir el reactivo de detección e incubar 3 horas a TA.
- Lavar los granos con la solución de lavado suministrado. Medir las muestras usando un citómetro de flujo y analizar los datos según las instrucciones del fabricante.
6. generación de un modelo de ratón de Orthotopic xenoinjerto de Osteosarcoma.
- Permiten ratones Athymic Nude-Foxn1nu seis semanas de edad, mujer, para aclimatarse al menos una semana antes de iniciar los procedimientos experimentales.
- Un día antes del procedimiento quirúrgico y como analgesia perioperatoria añadir paracetamol para el agua potable. "Solución de paracetamol para niños" diluido (véase Tabla de materiales) con agua para obtener una concentración final de 2 mg/mL. Basado en un consumo promedio de agua de 150 mL/kg/día, y un peso promedio de 20 g, esta dosis es suficiente para llegar a una dosis de 6 mg/ratón/día (300 mg/kg/día).
- Continuar tratamiento analgésico hasta 24 horas después de la operación, o más si los animales muestran signos de dolor.
- En el día de la intervención quirúrgica, recoger luciferase-positivo (Fluc) 143B las células cultivadas (previamente generadas por transducción lentivirales) por centrifugación a 300 x g durante 10 min y resuspender las células a una concentración de 2 x 105 células/μl de PBS. Mantener la suspensión de células en hielo 6 horas.
- Equipo quirúrgico de la autoclave. Preparar y limpiar la zona de trabajo y las tijeras estériles y pinza en hojas estériles. 20 min antes del procedimiento quirúrgico (paso 6.8), se inyectan los animales por vía subcutánea con buprenorfina (0,05 mg/kg, diluido en solución salina al 0.9%) como analgésico usando jeringas de insulina 0,5 mL (aguja de calibre 29).
- Justo antes de anestesiar cada animal, llene una jeringa de 10 μl con al menos 1 μl de la suspensión concentrada de células (Fluc) 143B (ver paso 6.4).
- Anestesiar el animal con la anestesia de inhalación isoflurano (2-3% de oxígeno). Compruebe el nivel de anestesia del dedo del pie-pellizcando el animal. Cuando el animal no reacciona a pellizcos, es decir, que es profundamente anestesiado, aplicar ungüento en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Colocar el animal sobre su espalda con la cabeza en una máscara de la anestesia y con las piernas hacia el operador. Flexión de la rodilla izquierda. Limpie la piel con etanol al 70% y aplicar lidocaína (2%) con una punta de algodón 3 veces como analgésico local.
- Use un cuchillo quirúrgico estéril para hacer una pequeña incisión (de aproximadamente 5 mm) en la piel justo debajo de la rodilla para exponer la tibia. Perfore un agujero de alfiler en la tibia, aproximadamente 2 mm por debajo de la rodilla usando un taladro de torcedura micro 0,8 mm. Tener cuidado no a perforar ambas corticales de tibia.
- Inyectar la suspensión de células de 1 μl (aproximadamente 2 x 105 células) lentamente (en aproximadamente 5 segundos) en el agujero con una aguja de calibre 26. Cerrar el orificio con una gota de pegamento de tejido para evitar el contraflujo de la suspensión.
- Cierre la piel con suturas monofilamento y una gota de pegamento de tejido. Deje que el animal se recupera en un ambiente bien climatizado (uso de una lámpara de calor). No descuide los animales hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Sólo después de que los animales se recuperan totalmente de la anestesia, devolverlos a sus jaulas.
- Dos días después de la inoculación del tumor, inyectar EV educado o ingenuo GFP-positivas MSCs (106 células en 100 μl de PBS, vea paso 3.5) por vía intravenosa con una jeringa de insulina de 0,5 mL en la vena de la cola de los ratones.
- Seguir el crecimiento del tumor por bioluminiscencia imagen26 dos veces a la semana. Para ello, inyectar el i.p. de ratones con 150 μL de D-luciferin (30 mg/mL) con una jeringa de insulina. Diez minutos después de la inyección, la posición de los animales en la bioluminiscencia sistema de imagen y medir el flujo de fotones generado por las células tumorales.
- Además, mida el diámetro del tumor de hueso primario con una pinza. Calcula el volumen del tumor (en mm3) ancho x largo2 x 0.5.
- Nota: Criterios de valoración humanas se definición como diámetro tumoral > pérdida de 15 mm o peso > 15%.
7. evaluación del número de nódulo pulmonar
- Cuando uno de los animales alcanza el extremo humano definido en el paso 6.14 (en aproximadamente 3-4 semanas), terminar el experimento y recoger y analizar todos los tejidos correspondientes.
- Diez minutos antes euthanization, inyectar 150 μL D-luciferin (30 mg/mL) con una jeringa de insulina de 0,5 mL.
- Anestesiar los animales con la anestesia de inhalación isoflurano (ver paso 6.7). La profundidad de la anestesia para confirmar la ausencia de reacciones del ratón a pellizcos del dedo del pie. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical27.
- Recoger los pulmones, hígado, bazo y riñones con pinzas y tijeras estériles. Lave los órganos en el PBS para eliminar restos de sangre y ponerlos en una placa Petri.
- Coloque el plato Petri con los órganos en la bioluminiscencia sistema de imagen. Medir la señal de la bioluminiscencia en ambos lados de los órganos. Inmediatamente después de medir, sumergen a los órganos en formol al 4% para los fijar (24-72 horas, a temperatura ambiente) para futuro análisis histológico.
- Procesar las imágenes obtenidas con software de imagen apropiado por umbralización manual. Contar el número de nódulos pulmonares en cada fotografía. Contar el número total de nódulos pulmonares en ambos lados de los pulmones.
8. histológico análisis
- Para el análisis histológico de los tejidos pulmonares:
- Integrar los órganos fijados con formol en parafina y preparar los portaobjetos de tejido de 6 μm.
- Deparaffinate el tejido pulmonar las diapositivas y realizar recuperación de antígeno hirviéndolos durante 15 minutos en tampón de citrato de 0.01 M (pH 6).
- Incube los portaobjetos horizontal a temperatura ambiente con anti-humanos vimentina anticuerpo (200 μg/mL) diluido 1: 150 en anticuerpo-diluyente (disponible comercialmente) y posteriormente con el anticuerpo secundario, marcado con HRP (0.5 mg/mL, dilución 1: 500). Manchar los tejidos con 3'-diaminobenzidina (DAB) y tinción de hematoxilina contador.
- Observe los portaobjetos de tejido manchado usando un microscopio óptico acoplado a la cámara correspondiente y el software de imágenes.
- Para evaluar la presencia de GFP-positivas MSCs en tibias de ratón:
- Descalcifique la tibia en ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 0,24 M, pH 7.2-7.4. Actualizar tampón EDTA cada otro día hasta que los huesos se convierten en flexibles (aproximadamente 1 semana).
- Deshidratarse osificados e infiltrarse con parafina. Incrustar las tibias (incluyendo tejido de osteosarcoma) en bloques de parafina.
- Utilizar un micrótomo para preparar secciones de parafina de 6 μm. Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio. Después de secar, almacenar diapositivas durante la noche a temperatura ambiente.
- Realizar recuperación de antígeno mediada por calor con tampón citrato (ver 8.1.2) y teñir los tejidos con el anticuerpo anti-GFP (antisuero entero) en una dilución de 1:900 en diluyente de anticuerpos. Contratinción los tejidos con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observe los portaobjetos de tejido con un microscopio de fluorescencia juntado al software de proyección de imagen correspondiente.
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Representative Results
En este estudio, se analizó la capacidad de osteosarcoma secretada EVs para educar MSCs hacia un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico. Demostramos que las células de osteosarcoma liberan exosomas como EVs que se internalizan por MSCs. Mide la alteración del perfil de expresión de citoquinas MSC inducida por cáncer EVs y se evaluó el efecto de las MSCs EV-educado en crecimiento del tumor y la formación de metástasis. La representación general del diseño de estudio se ilustra en la figura 1.
EVs liberada por las células de osteosarcoma 143B o fibroblastos humanos de control fueron purificados por centrifugación diferencial. Pureza de la EV fue confirmado por microscopia electrónica, que reveló que las preparaciones contienen principalmente vesículas con un diámetro que oscila entre 40-100 nm (figura 2A). Para determinar si el cáncer EVs interactúan con MSCs, había etiquetado las vesículas con un tinte verde fluorescente lipofílico linker (GFLD) y se incubó toda la noche con las células diana. Por microscopía de fluorescencia se observa captación eficiente de EV por MSCs (figura 2B). Por otra parte, el análisis de citometría de flujo mostró que EVs osteosarcoma y control se internalizan con eficacia comparable (figura 2C). Para investigar si el osteosarcoma EVs alteran las propiedades inmunomoduladoras de MSCs, se utilizó un inmunoensayo de múltiplex del cytokine basados en grano, que demostró que el tumor EVs determinan un aumento de 2 dobleces en la producción de IL-8 e IL-6 comparado con fibroblastos humanos control de EVs (figura 2D, E).
Para investigar si el osteosarcoma EVs educan MSCs a adoptar un fenotipo pro-tumorigenic y pro-metastásico, se empleó un modelo de ratón de xenoinjerto bioluminiscente, ortotópico de osteosarcoma. Todos los experimentos en animales fueron realizados por un operador. 143B-Fluc metastásico de células fueron transplantadas en la tibia de ratones desnudos atímicos y, después de dos días, osteosarcoma-investigaciones ratones fueron sometidos a una sola administración de GFP-positivas educado EV MSCs. ratones recibiendo no MSCs o ingenuo (no educación) MSCs se usaron como grupos de control. Ningún animal murió antes de los extremos descritos. Hemos demostrado por la medición del calibre e imágenes de bioluminiscencia (BLI) que los ratones tratados con MSCs educado EV habían acelerado el crecimiento del tumor en comparación con grupos control (figura 3A). Imágenes representativas del tamaño del tumor de cada brazo de tratamiento se muestran en la figura 3C. Nuestros datos indican que una administración i.v. única de MSCs educadas afecta a la progresión del tumor tan pronto como el día 10 después de la inoculación (figura 3B). Además, cuatro días después de la inyección sistémica de la educación/ingenuo MSCs expresando GFP (figura 4A), nos podríamos visualizar células GFP-expresando en la médula ósea (figura 4B) y en el tejido del tumor (figura 4 C), demostrando maestría autoguiado hacia el blanco para el sitio del tumor.
Ex vivo Análisis BLI de pulmones, hígado, riñón y bazo (datos no mostrados) mostró formación de nódulo pulmonar exclusivamente en los pulmones en los ratones de todos los brazos de tratamiento (figura 4D-F). Sorprendentemente, ratones recibiendo educación EV MSCs había mayor número de metástasis de pulmón en comparación con los ratones que recibieron no-educado MSCs o no MSCs (figura 4G), lo que sugiere que en el microambiente tumoral educado MSCs aumento el metastásico potencial de osteosarcoma de células en vivo7.
Figura 1 . Representación esquemática del estudio diseño. MSCs primarios humanos son educados con EVs aislados de células de osteosarcoma metastásico cultivadas (143B). Cáncer EV pureza es evaluada por microscopía electrónica, e internalización por MSCs es visualizada por microscopía de fluorescencia y analizada por citometría de flujo. Cambios en el perfil de expresión de citoquinas MSC son evaluados por citometría matriz de grano (CBA). Para definir el papel de EV educado MSC en crecimiento del tumor y la formación de metástasis, rodamiento de osteosarcoma ratones son inyectados con EV-educado (o ingenuo) MSC. El crecimiento del tumor es seguido por imágenes de bioluminiscencia (BLI) y medición del calibre, mientras que la formación de metástasis se evalúa en el punto final experimental por ex vivo BLI y análisis histológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Purificación de EVs y su interacción con MSCs. (A) micrografía de microscopia electrónica de transmisión de vehículos eléctricos aislados de células 143B (barra de escala: 100 nm). (B) absorción de GFLD etiquetado 143B EVs por MSCs evaluadas por microscopía de fluorescencia (barra de escala: 10 μm). (C) internalización de GFLD etiquetado 143B EVs (naranjas) o control (fibroblastos humanos, hf) EVs (verde) de MSCs como analizadas por citometría de flujo. (D) múltiplex detección de citoquinas inflamatorias en los sobrenadantes de MSCs expuestos a 143B (143B EV-MSC) o SVE hf (hf EV-MSC) por matriz de grano de citometría. 143B-MSC expresan niveles más altos de IL-6 e IL-8 en comparación con el control (no tratados y hF tratados con EV) MSCs. Las líneas punteadas indican el cambio en la producción de citoquinas. (E) IL-8 e IL-6 concentración de proteína en los medios condicionados de MSCs EV-tratados como analizadas por citometría matriz de grano, expresado como el doble de la inducción con respecto al control sin tratar. Los datos se expresan como media ± SD, n = 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Modelo de ratón xenoinjerto de bioluminiscente, ortotópico de osteosarcoma. (A) estimación de volumen de tumor mediante medidas de pinza y (B) el crecimiento del tumor medido por bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen. Tamaño del tumor es expresado como flujo de fotones (fotones/s). p < 0.01, MSC no educado (n = 6) vs educación MSC (n = 6), desapareado t-test. Los datos se expresan como promedio ± imágenes SEM. (C) representante BLI de ratones con tumores establecidos osteosarcoma (panel superior). Gamas de barra de escala de color de 7.7 x 107 (violeta) a 2.6 x 108 (rojo) fotones/seg. En el panel inferior, el área del tumor se visualiza sin superposición BLI. Las flechas indican la mayor parte del tumor. Barras de escala: 0,6 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Proyección de imagen de MSCs y ex vivo el tejido pulmonar. (A) imagen de microscopia de la fluorescencia de GFP-positivas cultivadas adiposo derivados de MSCs (verde). (B) tinción de inmunofluorescencia de MSCs de GFP-positivas en la médula ósea y (C) en tejido tumoral de los ratones receptores de MSC (verde: MSCs, azul: DAPI manchado núcleos; escala de la barra 10 μm). (D-F) Ex vivo bioluminiscencia (BLI) que muestra mayor número de focos metastáticos en ratones recibiendo educación EV MSCs (F) en comparación con los ratones recibiendo ingenuo MSC (E) o no MSC (D)la proyección de imagen. Barra de escala de color se extiende de 1 x 106 (violeta) a 1.5 x 106 (rojo) fotones/s. (G) cuantificación del número de metástasis de pulmón como visualizado por BLI (las líneas representan la mediana; * p < 0.05, prueba de t de una cola). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Vesículas extracelulares secretadas por el tumor (EVs) pueden alterar la fisiología de las células mesenquimales locales y distantes para generar un ambiente propicio para el tumor. Aquí se describe la generación de un modelo de ratón preclínica de osteosarcoma que permite la disección de las interacciones mediadas por EV entre células tumorales y células madre mesenquimal (MSCs) en vivo. Nos muestran que la inyección sistémica de tumor humano educado EV MSCs en ratones fuertemente xenoinjertos de osteosarcoma promueve formación crecimiento y metástasis del cáncer mediante la activación de la IL-6/STAT3 señalización vía7.
Estudios recientes han demostrado que EVs de cáncer pueden ayudar en la formación del nicho previamente metastásico alterando el comportamiento de células estromales de médula ósea o local16,28,29. Estos estudios se han realizado sobre todo inyectando directamente las vesículas derivadas de cáncer en el ratón receptor, que complica la identificación de los tipos de células responsables de los efectos de promover por el tumor. En nuestro protocolo, la educación de MSCs con cáncer EVs ocurre en vitro antes de la inyección de MSC. Este enfoque permite abordar la contribución específica de la interferencia de tumor-MSC a la progresión del cáncer y minimiza la confusión efectos indirectos del cáncer de EVs en otros componentes del ambiente local o sistémico.
Para evaluar si el MSCs educadas alberga el sitio del tumor, inyectan sistémicamente MSCs GFP-positivas en la vena de la cola de los ratones con tumores. Inyecciones de vena de la cola son cruciales, pero técnicamente difícil paso en muchos protocolos experimentales. Para asegurar la mínima variación entre inyecciones debe realizarse el procedimiento por investigadores experimentados. Correcta administración intravenosa se puede confirmar visualmente observando el movimiento del fluido a través de la vena. Si aparece una zona blanca en la cola o se encuentra resistencia durante la inyección, no se logró el acceso vascular. En este caso debe repetirse el procedimiento insertando la aguja sobre el primer sitio de la inyección. Porque MSCs fácilmente Zafarrancho el tumor, puede confirmarse la administración exitosa de MSCs (GFP-positivas) manchando de la inmunofluorescencia de la médula y tejido tumoral cuatro días después de la inyección (figura 4B, C).
Mostramos que EVs secretada cáncer inducen un fenotipo tumoral-apoyo en MSCs alterando la producción de citoquinas inflamatorias. Este hallazgo es particularmente relevante desde la modulación inmune y evasión inmune del tumor son mecanismos claves en la progresión maligna. Nuestros datos sugieren que cáncer EVs puede directamente, como por estudios independientes21,30,31,32,33, o indirectamente (a través de MSCs) influencia a inmune innato o adaptativo componentes. Sin embargo, el uso de un modelo de xenoinjerto (inmunocomprometidos) limita la posibilidad de investigar este aspecto de los vehículos eléctricos. Por lo tanto, enfoques similares en modelos de ratón inmunocompetente o humanizado necesitan realizar para definir el papel de las interacciones de la célula de tumor-MSC-inmune mediada por EV en cáncer.
Por último, porque MSCs pueden ser reclutados de la médula ósea u otras fuentes de tejido a los tumores, nuestro método no se limita al estudio de los cánceres de hueso, pero puede aplicarse para investigar el papel de tumor MSCs EV-educado en cáncer múltiple tipo2, 3 , 4 , 5 , 6, como los estudios recientes en modelos de melanoma y linfoma confirman34.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
S.R. Baglio fue apoyado por una beca por la Associazione Italiana por la Ricerca sul Cancro (AIRC) cofinanciado por la Unión Europea. Además, este proyecto ha recibido no financiación del programa de investigación e innovación de horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie 660200 (a S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
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