Vi præsenterer en ny tilgang til at karakterisere tumorceller. Vi kombineret immunfluorescens med DNA fluorescerendein situ-hybridisering til at evaluere celler taget til fange af en functionalized medicinsk wire i stand til at i vivo berigende CTCs direkte fra patientens blod.
Cirkulerende tumorceller er (CTCs) forbundet med dårlig overlevelse i metastatisk kræft. Deres identifikation, fænotyper og genotypebestemmelse kunne føre til en bedre forståelse af tumor heterogenitet og dermed lette udvælgelsen af patienter for personlig behandling. Dette er imidlertid hæmmet på grund af sjældenhed af CTCs. Vi præsenterer en innovativ tilgang til prøveudtagning en stor mængde af patientens blod og indhentning af oplysninger om tilstedeværelse, fænotype, og genet omplantning af CTCs. Metoden kombinerer immunofluorescens farvning og DNA fluorescerendein situ-hybridisering (DNA fisk) og er baseret på en functionalized medicinsk wire. Denne tråd er en innovativ enhed, der tillader i vivo -isolation af CTCs fra en stor mængde af perifert blod. Blodvolumen screenet af en 30-min administration af wiren er ca 1,5-3 L. For at bevise gennemførligheden af denne tilgang, epitelcelle vedhæftning molekyle (EpCAM) udtryk og kromosomale omplantning af ALK-genet blev fastsat i ikke-småcellet lungekræft kræft (NSCLC) cellelinjer fanget af den functionalized ledning og farves med en immuno-DNA fisk tilgang. Vores største udfordring var at udføre analysen på en 3D-struktur, den functionalized wire, og at bestemme immuno-fænotype og fisk signaler på denne støtte ved hjælp af en konventionel fluorescens mikroskop. Resultaterne viser at fange CTCs og analysere deres fænotype og kromosomal omrokering kunne potentielt repræsenterer en ny følgesvend diagnostisk tilgang og give en innovativ strategi for at forbedre personificeret kræftbehandlinger.
CTCs repræsenterer et vigtigt skridt for kræft celle formidling1. Deres tilstedeværelse i de perifere blod af patienter er forbundet med (metastatisk) tilbagefald og sygdom progression2,3. CTC isolering og karakterisering af blod af kræftpatienter er en type af non-invasiv likvide biopsi. I de seneste år, er det blevet stadig tydeligere, at overvågning af progression og svar af tumorer på forskellige behandlinger ved hjælp af denne form for analyse giver vigtige kliniske oplysninger4,5. Flydende biopsi er endnu mere nyttigt, hvor kirurgi er ikke muligt eller når primær tumor væv er ikke tilgængelig, dvs., for ikke-biopsiable læsioner. Denne tilgang er derfor lovende i bestemt kræft indstillinger som metastatisk NSCLC, hvor tilstedeværelsen af CTCs har vist sig at have en negativ prognostiske rolle6. NSCLC er en tumor, der gavner især fra målrettede terapeutiske tilgange7,8,9 designet til at fungere på specifikke molekyler (molekylære mål) kendt for at være involveret i vækst, progression, og spredning af sygdommen. Derfor er det nødvendigt påvisning af specifikke mål i løbet af sygdomsprogression. CTC undersøgelse er en yderst interessant diagnostisk tilgang til at opdage og overvåge drug mål uden behov for primær eller metastatisk væv. For eksempel er påvisning af ALK-genet omplantninger i NSCLC celler forbundet med følsomhed over for crizotinib, en specifik målrettet terapi10. Dog på nuværende tidspunkt, der påvisning af ALK omplantninger udføres kun på fine nål aspirates eller små biopsier; som et resultat, uden en tumor er væv ALK analyse ikke muligt. CTCs er en potentiel alternativ til tumor væv-baserede undersøgelser og repræsenterer en meget lovende følgesvend diagnostisk tilgang.
På trods af deres potentielle betydning er CTCs stadig genstand for stor diskussion blandt forskning, hovedsagelig på grund af deres sjældenhed (1-10 celler/mL af perifert blod11). Nuværende flydende biopsi metoder bruger en begrænset mængde af blod (dvs., 1-30 mL)12,13, men dette skaber en situation med suboptimal sensitivitet til påvisning af CTCs. derfor, forskning er berettiget til at finde tilgange og udvikle enheder til at udføre CTC-målrettet flydende biopsier på en større volumen af perifert blod.
En alternativ enhed, en functionalized medicinsk wire (Se Tabel af materialer), er blevet udviklet for at overvinde blod prøveudtagning begrænsninger og opnå et mere repræsentativt analyse af CTCs. Denne functionalized wire er et CE-godkendt medicinsk anordning, der fanger CTCs direkte fra blodbanen af kræft patienter1. Det er sammensat af en 16 cm lange rustfrit stål wire (figur 1a) med 2 cm lange functionalized spids belagt med et 0,2 µm tykt lag af guld. Laget er igen dækket af en 1-5 µm tykt strontiumpolycarboxylat hydrogel stratum kovalent kombineret med antistoffer rettet mod EpCAM, en af de mest udbredte udtrykt antigener på overfladen af CTCs14. Den functionalized spids af wiren er indført i en blodåre i armen på patienten og forbliver i position i mindst 30 min. Denne tilgang giver isolation af CTCs in vivo direkte i perifert blod, og at skærmen omkring 1.5-3.0 L blod (ca 300-fold mere end diskenhed for alternative tilgange)1.
PanTel mfl. påvist effekten af denne tilgang i isolere CTCs direkte i arm venerne i lunge cancer patienter15. De optrådte for wire immunofluorescens farvning for at identificere CTCs ved hjælp af konventionelle antistoffer rettet mod EpCAM og pan-cytokeratin og CD45 for Leukocytdepleterede påvisning. Wiren var undersøges under et optisk fluorescens mikroskop15. Forfatterne demonstreret at enheden var i stand til at isolere CTCs, men de ikke undersøge enhver terapi-relaterede mål, såsom ALK omplantninger.
Den præsenterede metode tager sigte på at identificere formodede CTCs i NSCLC cellelinjer phenotypical parametre, fx, EpCAM positivitet og tilstedeværelsen af molekylære markører, for eksempel ALK status (figur 1b). Denne 3-dag-lange procedure kombinerer en functionalized wire og immunfluorescens farvning med DNA fluorescens –in situ-hybridisering (DNA fisk), opkaldt Immuno-DNA-fisk. Eftersom CTCs er sjældne enheder, er fordelen ved denne protokol, at CTCs kan karakteriseres på den samme ledning både immunophenotypic funktioner og DNA rearrangementer.
I dette papir, for første gang, en metode, der kombinerer immunofluorescens farvning og DNA fisk, til brug med functionalized wire blev foreslået. Metoden blev kaldt Immuno-DNA fisk. Denne teknik blev udviklet til samtidige identificering af formodede CTCs på en 3D wire på grundlag af phenotypical parametre, såsom positivitet til EpCAM (event 1), og for at lette påvisning af molekylære ændringer, som ALK-genet () status Event 2). Den samtidige identifikation af de to begivenheder giver mulighed for påvisning af deres Co lokalisering. Derfor kan denne tilgang skræddersyes til at identificere og karakterisere CTCs hentet fra blodet af kræftpatienter. De potentielle virkninger af haemo-komponenter og leukocytter på farvning proceduren forstyrrer ikke normalt proceduren. Navnlig anført data, der indberettes i litteratur, at haemo-komponenter og leukocytter ikke påvirker immunofluorescens farvning af de celler, der er knyttet til tråd, det afgørende skridt til at identificere faktiske CTCs1,15.
Fluorescens lysstyrken af Immuno-DNA fisk er lidt mindre markant end med en traditionel immunophototyping assay og er resultatet af den høje temperatur behov for fisk assay. Men immunofluorescens farvning er stadig mærkbar. For eksempel, er et svagt signal stadig detekterbar i den lave EpCAM-udtrykker cellelinje, NCIH1975. Den høje temperatur kræves for fisk assay er den vigtigste begrænsende faktor i at vælge den rigtige fluorokrom knyttet til antistoffet. I denne protokol, skal antistoffer være knyttet til en termostabil fluorokrom for at tolerere DNA denaturering temperatur. Phycoerythrin, en thermosensitive fluorokrom, anbefales for eksempel, ikke i denne indstilling på grund af fluorokrom nedbrydning forårsaget af høje temperaturer. Fluorescein isothiocyanat er et godt valg og ofte fælles fluorokrom ansat på fisk sonder. Immuno-DNA fisk autofluorescence signal er meget fattige på standard 2D understøtter. På wire støtte, kan polymer lag fremkalde et lille autofluorescence signal, især på den røde kanal. I modsætning til 2D baggrunden en konkurrencehandling baggrund signal er mærkbar på wiren men påvirker ikke væsentligt kerner identifikation eller celle karakterisering.
Mikroskop evaluering af wiren er langt mere trættende end på en 2D støtte på grund af begrænsninger af et optisk mikroskop i læsning overflade af et cylindrisk formet 3D struktur. Dog kan denne vanskelighed overvindes af roterende wire indehaveren og erhverve de billeder, der er primært lokaliseret langs midterlinjen af wiren. Indehaveren af wire tillader en 360 ° rotation af wiren. Når fokuseret på kerner, holde ændre fluorescens kanaler ikke nødvendigvis fokus på målområdet. Derfor er det vigtigt at fastholde fokus på indre-celle målområdet.
Denne teknik kan skræddersyes til at opdage og karakterisere celler på forskellige slags 3D understøtter. Det kan også være muligt at bruge forskellige antistoffer og fisk sonder. Når du vælger at bruge forskellige antistoffer, er fluorokrom thermostability og udtryk niveau af target antigen på cellemembranen vigtige faktorer til at overveje. Intra-intracytoplasmatisk antigener kan også blive plettet. Når ved hjælp af forskellige fisk sonder, er det vigtigt at kontrollere dataark specifikationer for proceduren denaturering og forberede FISKEN celler assay i overensstemmelse hermed.
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |