Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي

doi: 10.3791/56936 Published: December 21, 2017

Summary

نقدم نهجاً جديداً لتمييز الخلايا السرطانية. نحن جنبا إلى جنب الفلورة مع الحمض النووي فلوري-في الموقع-التهجين تقييم الخلايا التي استولت عليها سلك طبي فونكتيوناليزيد قادر على في فيفو إثراء ريادية مباشرة من دم المريض.

Abstract

تعميم خلايا الورم (ريادية) ترتبط مع بقاء الفقراء في السرطان المنتشر. التحديد، فينوتيبينج، والتنميط يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لعدم تجانس الورم ومما يسهل اختيار المرضى للعلاج شخصية. ومع ذلك، وهذا يعوق بسبب ندرة ريادية. نقدم نهجاً مبتكراً لأخذ العينات حجماً كبيرا من دم المريض والحصول على معلومات عن إزفاء الوجود والنمط الظاهري والجيني ريادية. الأسلوب يجمع بين تلطيخ الفلورة والحامض النووي فلوريفي الموقع-التهجين (الحمض النووي الأسماك) ويستند إلى سلك طبي فونكتيوناليزيد. هذا السلك هو جهاز مبتكرة التي تسمح بالعزل في فيفو ريادية من كمية كبيرة من الدم المحيطي. حجم الدم فحص الإدارة 30 دقيقة من الأسلاك هو حوالي 1.5-3 ل. لإثبات جدوى هذا النهج، تم تحديد التعبير (ابكام) جزيء التصاق الخلايا الظهارية وازفاء الجينات كيه في الرئة الخلية الصغيرة غير خطوط خلايا السرطان (NSCLC) استولت عليها أسلاك فونكتيوناليزيد و الملون بنهج أسماك المناعية-الحمض النووي. وكان التحدي الرئيسي الذي نواجهه للقيام الفحص على هيكل ثلاثي الأبعاد، سلك فونكتيوناليزيد، وتحديد النمط الظاهري المناعية وإشارات الأسماك على هذا الدعم باستخدام مجهر الأسفار تقليدية. النتائج التي تم الحصول عليها تشير إلى أن اصطياد ريادية وتحليل النمط الظاهري، وإعادة ترتيب الكروموسومات يمكن أن يحتمل أن تمثل نهج تشخيص رفيق جديد وتقديم مبتكر شخصية استراتيجية لتحسين علاج السرطان.

Introduction

ريادية تمثل خطوة رئيسية من سرطان الخلية نشر1. وجودها في الدم المحيطي لدى المرضى مقترن (المنتشر) الانتكاس والمرض تطور2،3. عزل الإرهاب وتوصيف من الدم لمرضى السرطان نوع من خزعة سائلة غير الغازية. وفي السنوات الأخيرة، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن رصد التقدم واستجابة الأورام للمعالجات المختلفة باستخدام هذا النوع من التحليل يوفر المعلومات السريرية الهامة4،5. خزعة السائل أكثر فائدة عندما الجراحة ليس ممكناً أو عندما لا يتوفر أنسجة الورم الرئيسي، أيلآفات غير بيوبسيابل. ومن ثم فإن هذا النهج واعدة في إعدادات معينة من السرطان مثل NSCLC المنتشر، حيث ثبت وجود ريادية ل دور سلبي الذي تنبؤاتها6. NSCLC هو ورم أن يستفيد خصوصا من النهج العلاجية المستهدفة7،8،9 مصممة لتعمل على جزيئات معينة (الأهداف الجزيئية) المعروفة للمشاركة في النمو والتقدم، و انتشار هذا المرض. ومن ثم، هناك حاجة إلى الكشف عن أهداف محددة أثناء تطور المرض. التحقيق لجنة مكافحة الإرهاب نهج تشخيص للاهتمام للغاية لكشف ورصد أهداف المخدرات دون الحاجة للأنسجة الأولية أو المنتشر. على سبيل المثال، الكشف عن كيه الجينات المولدة في الخلايا NSCLC يرتبط بحساسية كريزوتينيب، علاج مستهدفة محددة10. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، يتم تنفيذ الكشف عن المولدة كيه فقط على تبين إبرة غرامة أو الخزعات الصغيرة؛ نتيجة لذلك دون وجود ورم الأنسجة كيه التحليل لا يمكن. ريادية هي بديل محتمل للورم التحقيقات المستندة إلى الأنسجة، وتمثل نهج تشخيص رفيق واعدة جداً.

على الرغم من أهميتها المحتملة، ريادية لا تزال موضوع جدل كبير بين البحوث، أساسا بسبب هذه الندرة (1-10 خلايا/مل من الدم المحيطي11). الحالي خزعة سائلة أساليب استخدام كمية محدودة من الدم (أي، 1-30 مل)12،13، ولكن هذا يخلق حالة حساسية دون المستوى الأمثل للكشف عن ريادية. وبالتالي، يبرر البحث لإيجاد النهج وتطوير الأجهزة لإجراء خزعات السائلة التي تستهدف مكافحة الإرهاب على حجم أكبر من الدم المحيطي.

جهاز بديل، سلك طبي فونكتيوناليزيد (انظر الجدول للمواد)، وقد وضعت للتغلب على أوجه القصور في أخذ عينات الدم والحصول على إجراء تحليل أكثر تمثيلاً ريادية. هذا السلك فونكتيوناليزيد هو جهاز طبي وافقت CE يلتقط ريادية مباشرة من مجرى الدم ل مرضى السرطان1. وهو يتألف من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ طوله 16 سم (الشكل 1a) مع تلميح فونكتيوناليزيد طوله 2 سم مغطاة بطبقة سمكها 0.2 ميكرون من الذهب. الطبقة بدورها تغطي طبقة المائية 1 إلى 5 ميكرومتر سميكة بوليكاربوكسيلاتي تساهمي مقترنة بالأجسام المضادة الموجهة ضد ابكام، أحد المستضدات المعرب عنها على نطاق واسع على سطح ريادية14. نصيحة فونكتيوناليزيد من الأسلاك هو عرض في الوريد من ذراع المريض، ولا تزال في موقف لمدة 30 دقيقة على الأقل. ويسمح هذا النهج عزل ريادية المجراة، مباشرة في الدم المحيطي، والشاشة حوالي 1.5-3.0 لتر من الدم (حوالي 300-fold أكثر من وحدة التخزين المستخدمة للنهج البديلة)1.

بانتيل وآخرون. أثبتت فعالية هذا النهج في عزل ريادية في عروق الذراع ل مرضى سرطان الرئة15مباشرة. فأدوا الفلورة سلك تلطيخ تحديد ريادية باستخدام الأجسام المضادة التقليدية الموجهة ضد عموم-سيتوكيراتين، ابكام و CD45 للكشف عن ليوكوسيتي. وكان فحص الأسلاك تحت مجهر الأسفار ضوئية15. أثبت المؤلفون أن الجهاز قادراً على عزل ريادية، إلا أنها لم تحقق أي من الأهداف المتصلة بالعلاج، مثل كيه المولدة.

طريقة عرض يهدف إلى تحديد ريادية المفترضة في خطوط الخلايا NSCLC استناداً إلى معلمات الشكلية، مثلاً، ابكام الإيجابية، ووجود المؤشرات الحيوية الجزيئية، على سبيل المثال مركز كيه (الشكل 1b). يجمع هذا الإجراء استغرقت 3 أيام بين أسلاك فونكتيوناليزيد والفلوره تلطيخ مع الحمض النووي fluorescenceفي الموقع-التهجين (الحمض النووي الأسماك)، يدعى المناعية-الحمض النووي-الأسماك. نظراً لأن ريادية كيانات نادرة، الاستفادة من هذا البروتوكول أنه يمكن وصف ريادية في نفس السلك من حيث الميزات إيمونوفينوتيبيك والحمض النووي ترتيبات جديدة.

Protocol

1-المناعية-الحمض النووي الأسماك في ساترة 2D

  1. خلية إعداد وتمسكا ساترة البذر
    ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت غطاء تدفق الصفحي في ظروف معقمة.
    1. تزج ساترة في الإيثانول 100% لتطهير لهم.
      ملاحظة: نحن نستخدم 12 ملم × 12 ملم المدعومة من السيليكون التربيعية كوفيرسليبس (يتم سرد كافة الكواشف في الجدول للمواد).
    2. المكان كوفيرسليبس في طبق بتري (بقطر 100 ملم). استخدام الجاف أجبر تدفق الهواء لمدة 5 دقائق.
    3. أغسل صحن بيتري مع فوسفات 15 مل معقمة 1 × دولبيكو مخزنة المالحة (PBS).
    4. أغسل صحن بيتري مع 10 مل متوسطة كاملة (انظر الجدول 1).
    5. بذور الخلايا ملتصقة (عد الخلايا 1,650,000 حوالي 10 مل من المتوسطة، بتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية) بإسقاط بلطف بتعليق خلية على طبق بيتري للحصول على خلية موحدة الطلاء (حوالي 30,000 الخلايا/سم2).
      ملاحظة: بالنسبة ~ التقاء 70%، تمسكا ينبغي أن استزراع الخلايا في كوفيرسليبس لمالا يقل عن 48 ساعة.
  2. التثبيت وبيرميبيليزيشن
    تنبيه: هو الأسيتون الاشتعال وغضب مادة متفجرة. استخدام اللدائن فقط الأسيتون المقاوم أو حاويات زجاجية (لا البلاستيكية أو PVDF).
    ملاحظة: هذه الخطوات تحت غطاء الأبخرة كيميائية.
    1. إزالة المتوسطة ثقافة استخدام بيبيت يسفط المتاح.
    2. أغسل صحن بيتري مع 1 × برنامج تلفزيوني.
    3. استخدام الملقط، تغسل في كوفيرسليبس التي تستنزف منهم كوب زجاج الذي يحتوي على 5 مل من 1 × برنامج تلفزيوني.
    4. جاف كوفيرسليبس على ورق نشاف.
    5. إصلاح الخلايا على ساترة بغمر أنه في حل الأسيتون 100% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. إزالة ساترة واسطة ملاقط. ساترة الجافة باستخدام تدفق هواء قسري لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة. يجب أن يتم تخزين ساترة عند-20 درجة مئوية.
  3. الفلورة يوم 1
    ملاحظة: هذه المرحلة ينطوي حضانة (O/N) بين عشية وضحاها (~ ح 16).
    1. تغسل في كوفيرسليبس في 1 × برنامج تلفزيوني مرتين.
    2. قطره 100 ميليلتر من جسم إضعاف المخزن المؤقت (انظر الجدول 1 لمزيد من التفاصيل) على ساترة واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
      ملاحظة: ينبغي تعديل حجم الحل استناداً إلى السطح ساترة بغية تغطية ساترة كامل وتجنب خطر تجاوز السعة.
    3. إعداد مزيج الأجسام المضادة (الجدول 1) استخدام 01:20 إضعاف [مونوكلونل] جسم الابتدائي مترافق مع المخزن تمييع فلوروتشرومي والأجسام المضادة، كما هو محدد في ورقة البيانات المقدمة من الشركة المصنعة.
      ملاحظة: ينصح بشدة باستخدام الأجسام المضادة مترافق مع فلوروتشرومي الحرارة. إذا كان يتم استخدام فلوروتشرومي غير الحرارة، قد تلحق الضرر fluorochrome درجة الحرارة المستخدمة خلال الخطوات الحمض النووي-الأسماك من البروتوكول وإطفاء الانبعاثات الفلورسنت. في هذا البروتوكول، اخترنا لجسم ابكام-فيتك (01:20 إضعاف)، التي لم تظهر أي مشاكل كبيرة مع درجة الحرارة المستخدمة.
    4. شطف في كوفيرسليبس مرتين في 1 × برنامج تلفزيوني.
    5. مكان كوفيرسليبس الخلية-الجانب حتى في رطبة الدائرة وإسقاط ميليلتر 100 من مزيج الأجسام المضادة على ساترة.
      ملاحظة: ينبغي تعديل حجم الحل على أساس السطح ساترة لتغطية ساترة كامل ويقلل من خطر تجاوز السعة.
    6. احتضان O/N (~ ح 16) في الظلام في 4 درجات مئوية.
  4. الفلورة يوم 2
    1. كتلة جسم الحضانة بالغسيل في كوفيرسليبس في 1 × برنامج تلفزيوني مرتين.
      ملاحظة: مخزن كوفيرسليبس مغمورة في 100 ميليلتر من 1 × برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية في دائرة مع البيئة الرطبة ثابتة في الظلام حتى يتم إجراء فحص الأسماك.
  5. 2 يوم في 2D الحمض النووي-الأسماك
    تنبيه: يجب إيلاء اهتمام خاص لدرجات الحرارة العالية في الصكوك وقاعة الرطبة.
    1. قم بإعداد فرن التهجين وفرن الحرارة الجافة (~ ح 3 قبل بدء تشغيل البروتوكول الحمض النووي-الأسماك). تعيين الفرن التهجين عند 75 درجة مئوية وتعيين الفرن الحرارة الجافة عند 37 درجة مئوية وباردة الحل SSC 0.4 × (الرقم الهيدروجيني = 7.0 ± 0.1) (SSC وصفه انظر الجدول 1) إلى 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: حالة الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة للأسماك الحاسمة: درجة الحموضة = 7.0 ± 0.1.
    2. أغسل ساترة ثلاث مرات في المثلج 0.4 × SSC الحل.
    3. جاف ساترة تحت غطاء الأبخرة كيميائية لمدة 10 دقائق في الظلام.
    4. دوامة لمدة 10 ق وأداء تدور سريعة إلى أسفل (معدل الحد الأقصى) للتحقيق من الجدار للتحقيق-الأنبوب.
    5. وضع الجانب الخلية ساترة لأسفل على قطره 5 ميليلتر المسبار الأسماك على الشريحة وختم جميع حواف ساترة مع الأسمنت المطاطي.
      تنبيه: الخطوتين التاليتين تنطوي على درجات حرارة عالية. ارتداء قفازات واقية.
    6. وضع الشريحة في دائرة رطبة مظلمة في الفرن التهجين ل 8 دقيقة عند 75 درجة مئوية لاكتمال الحمض النووي تمسخ.
    7. تحريك الدائرة الرطبة في الفرن الحرارة الجافة في 37 ° ج س/أ.
  6. الحمض النووي – الأسماك في 2D يوم 3
    1. تعيين حمام المياه عند 72 درجة مئوية ثم ضع جرة تلطيخ الشريحة مع المخزن المؤقت للتعاون بين بلدان الجنوب × 0.4 إلى أنه (الجدول 1). وبعد 30 دقيقة، التحقق من درجة حرارة المخزن المؤقت 0.4 × التعاون بين بلدان الجنوب، والتي يجب أن تكون في 72 ± 1 درجة مئوية.
    2. إعداد قنينة الزجاج اثنين: واحد مع 2 × SSC + 0.05% توين المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني = 7.0 ± 0.1) (الجدول 1) وثانية واحدة مع الماء المقطر.
    3. إزالة الدائرة الرطبة من الفرن، بعناية إزالة الأسمنت المطاط من الشريحة وفصل ساترة مع ملاقط.
    4. أغسل ساترة بالغمس في 0.4 × SSC لمدة 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    5. أغسل ساترة بالغمس في 2 × SSC + 0.05% توين المخزن المؤقت لمدة 30 ثانية.
    6. شطف ساترة في الماء المقطر.
    7. جاف كوفيرسليبس تحت غطاء الأبخرة كيميائية لمدة 10 دقائق في الظلام.
    8. جبل ساترة في تركيب السائل المتوسطة مع 1.5 ميكروغرام/مل من 4´، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) كونتيرستين الحمض النووي المجموع. وضع الجانب الخلية ساترة لأسفل على قطره 5 ميليلتر من المتوسطة المتصاعدة على شريحة، اضغط الملاقط على ساترة للحصول على الهواء خارجاً، وختم بطلاء الأظافر.
      ملاحظة: تركيب متوسطة الحجم ينبغي تعديل استناداً إلى حجم السطح ساترة.
  7. مجهر 2D المراقبة والتحليل
    ملاحظة: يمكن الحصول على صور مع أنظمة المجهر مختلفة.
قمنا باستخدام مجهر فلورسنت تقليدية وهبت مع برمجيات تجارية قياسية للحصول على الصور (جدول المواد).
  1. الحصول على الصور باستخدام كاميرا رقمية 12 بت و 20 ×/0.50 نا والهدف نا ×/0.65 40 مع عوامل التصفية المناسبة للاحمر (الإثارة: 599 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 588 nm) الخضراء (الإثارة: 509، الانبعاثات: 524)، والأزرق (الإثارة: 367 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 452 نانومتر) يسبر.
  2. تحليل الصور باستخدام أداة البرامج المفضلة.
    ملاحظة: تقييم تلطيخ الفلورة والتعريب كيه-التحقيق، قمنا باستخدام إيماجيج. ويمكن تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية في الظلام لمدة أقصاها 3 أسابيع. لتخزين طويلة، نود أن نقترح استخدام المتوسطة التركيب المحددة للتخزين على المدى الطويل.

2-المناعية-الحمض النووي الأسماك على الأسلاك

  1. خلية سبايك في خط الأسلاك (دعم ثلاثي الأبعاد)
    ملاحظة: الإعداد الأولية ينطوي على دقة اختيار ملتصقة خلايا الخطوط استناداً إلى ابكام-الإيجابية. هو فونكتيوناليزيد السلك مع الأجسام المضادة-ابكام حيث أن الخلايا ابكام الإيجابية فقط ملطخة.
    ملاحظة: لا تلمس الجزء فونكتيوناليزيد من الأسلاك لتجنب أي ضرر.
    ملاحظة: جميع الخطوات ينبغي أن يتم تحت غطاء الاندفاق الصفحي في ظروف معقمة.
    1. ريسوسبيند كامل محتويات قارورة T75 (التقاء 80 في المائة) في قنينة 5 مل باستخدام 4 مل متوسطة كاملة؛ لأداة واحدة سبايك، ينصح الخلايا حوالي 2,000,000 إلى أقصى حد التصاق الخلايا بالأسلاك.
    2. إزالة الأسلاك من عبوته الزجاجية.
    3. وتراجع الجزء الذهب فونكتيوناليزيد من الأسلاك إلى القنينة، والتأكد من أن الأسلاك-السدادة ماء صالح للقنينة. ختم مع الفيلم المختبر.
      ملاحظة: يوصي باستخدام أنبوب 5 مل للسماح لتطابق صحيح بين الأسلاك-السدادة والقنينة.
    4. احتضان مدة 30 دقيقة في RT في المدورة أنبوب (0-120 زاوية).
    5. شطف السلك ثلاث مرات في 1 × برنامج تلفزيوني الحل باستخدام 3 قنينات نظيفة مختلفة.
  2. التثبيت وبيرميبيليزيشن
    تنبيه: هو الأسيتون مادة قابلة للاشتعال يمكن أن تهيج الجهاز التنفسي. استخدام البلاستيك المقاوم الأسيتون أو حاويات زجاجية (لا البلاستيكية أو PVDF) فقط.
    ملاحظة: هذه الخطوات تحت غطاء الأبخرة كيميائية.
    1. أيردري السلك.
    2. إصلاح الخلايا عن طريق غمس السلك في الأسيتون الحل 100% لمدة 10 دقائق في استخدام الرايت أنبوب 5 مل.
      ملاحظة: الأسلاك-السدادة يجب أن لا تتلامس مثبت.
    3. أيردري السلك لمدة 5 دقائق في الرايت
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يجب أن يتم تخزين الأسلاك في-20 درجة مئوية. عند التعبئة الأسلاك للتخزين على المدى الطويل، ضع السلك-سداده بجوار الحافة فونكتيوناليزيد وإدراج السلك بعناية في أنبوب الزجاج التخزين، مع الحرص على عدم الأضرار نصيحة فونكتيوناليزيد. إغلاق الزجاج تخزين وتخزين (عمودياً أو أفقياً) في-20 درجة مئوية.
  3. الفلورة يوم 1
    ملاحظة: هذه المرحلة ينطوي احتضان O/N (~ ح 16).
    1. تغسل مرتين في 1 × برنامج تلفزيوني الحل باستخدام أنبوب 5 مل.
    2. احتضان الأسلاك في جسم إضعاف المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة في الرايت استخدام أنبوب 5 مل.
    3. إعداد 150 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة مع إضعاف [مونوكلونل] جسم الابتدائي مترافق مع فلوروتشرومي في جسم إضعاف المخزن المؤقت، كما هو محدد في ورقة البيانات. على سبيل المثال، تم استخدام جسم فيتك ابكام مع 01:20 إضعاف.
    4. استخدام تلميح p200 القيام بالحضانة، على النحو التالي: استخراج السلك من الأسلاك-السدادة، وإدراج السلك من خلال ثقب أكبر من التلميح بلطف. تضاف في نهاية أونفونكتيوناليزيد أولاً وسحب السلك ببطء من خلال ثقب أصغر حتى الجزء الذهب أبعد من مجرد حفرة كبيرة.
    5. إسقاط بلطف 150 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة (على سبيل المثال مكافحة EpCAM_FITC جسم 01:20 المخفف) في التلميح. لتجنب خطر تشكيل فقاعة، بلطف برم السلك حتى الجزء فونكتيوناليزيد وسقطت تماما.
    6. ختم حتى الحفرة الحافة. يمكن أن تساعد التفاف الفيلم المختبر حول الحفرة.
    7. احتضان عمودياً O/N (~ ح 16) في الظلام في 4 درجات مئوية.
  4. الفلورة يوم 2
    1. كتلة جسم الحضانة قبل الغسيل الأسلاك مرتين في 1 × برنامج تلفزيوني.
    2. إعادة إدراج السلك السلك-السدادة.
      ملاحظة: مخزن في 1 X برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية في 5 مل فيال حتى يتم إجراء فحص الأسماك.
  5. 3D الأسماك الحمض النووي يوم 2
    تنبيه: يجب إيلاء اهتمام خاص لدرجة حرارة عالية للصكوك والدائرة الرطبة.
    1. قم بإعداد فرن التهجين وفرن الحرارة الجافة (~ ح 3 قبل بدء تشغيل البروتوكول الحمض النووي-الأسماك). تعيين الفرن التهجين عند 75 درجة مئوية وتعيين الفرن الحرارة الجافة عند 37 درجة مئوية وباردة الحل SSC 0.4 × (الرقم الهيدروجيني = 7.0 ± 0.1) إلى 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: مركز الأس الهيدروجيني مخازن الأسماك أمر بالغ الأهمية ويجب أن تكون 7.0 ± 0.1.
    2. يغسل السلك 3 مرات في المثلج 0.4 × SSC الحل.
      ملاحظة: الاحتفاظ الأسلاك في الظلام لتجنب فوتوبليتشينج fluorochrome أثناء الإجراءات التالية.
    3. جاف لمدة 10 دقائق في الظلام تحت خزانة الأبخرة.
    4. دوامة وتدور المسبار 5 s.
    5. إسقاط 10 ميليلتر للتحقيق في microtubes ثيجلاس. تغطية مع الفيلم المختبر.
    6. تدور microtubes كما يلي: التفاف microtube في وضع ورقة ماصة، وجفاف في أنبوب 50 مل، وتدور بإيجاز.
    7. بعناية وضع سلك المجفف في microtube وإدراج السلك-السدادة. ختم بالأسمنت المطاطي.
      تنبيه: الخطوتين التاليتين تنطوي على درجات حرارة عالية.
ارتداء قفازات واقية.
  • وضع الأسلاك في غرفة مظلمة رطبة في الفرن التهجين لمدة 8 دقائق عند 75 درجة مئوية للحصول على كامل الحمض النووي تمسخ.
  • تحريك الدائرة الرطبة في فرن حرارة جافة في 37 ° ج س/أ.
  • 3D الأسماك الحمض النووي يوم 3
    1. وضع شريحة تلطيخ جرة مع الحل SSC × 0.4 في حمام مائي وتعيين عند 72 درجة مئوية.
    2. فحص درجة حرارة 0.4 × SSC الحل حتى يصل إلى 72 ± 1 درجة مئوية.
    3. إعداد قنينة الزجاج اثنين، واحد مع 2 × SSC + 0.05% توين (الرقم الهيدروجيني = 7.0 ± 0.1) الحل والثانية مع الماء المقطر.
    4. إزالة الدائرة الرطبة من الفرن الحرارة الجافة، بعناية إزالة الأسمنت المطاط من الأسلاك-السدادة باستخدام الملقط، وإخراج السلك.
      ملاحظة: بعناية سحب نهاية السلك عن طريق في السدادة، مع الحرص على عدم الأضرار نصيحة فونكتيوناليزيد غير مصقول.
    5. تراجع السلك إلى حل SSC 0.4 × 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    6. يغسل السلك 2 × SSC + 0.05% توين الحل لمدة 30 ثانية في الرايت
    7. أغسل الأسلاك في الماء المقطر في الرايت
    8. الجاف للأسلاك تحت غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في الظلام.
    9. إعداد حل DAPI أسهم من 1.43 مليميكرون مل 2 × 1 برنامج تلفزيوني.
    10. احتضان طرف السلك مع الحل DAPI في قنينة 2 مل ح 1 في الظلام في الرايت فونكتيوناليزيد
    11. شطف الأسلاك مرتين في 1 × برنامج تلفزيوني وأيردري.
  • مجهر 3D المراقبة والتحليل
    1. ضع السلك في سلك حامل. عناية إدراج تلميح فونكتيوناليزيد عن طريق نقطة الدخول في حامل خاص، حتى التلميح يطابق النقطة اقتران. أن الحرص على عدم الأضرار نصيحة فونكتيوناليزيد (الشكل 1a).
    2. مكان صاحب الخاصة في مرحلة المجهر. ضبط تركيز المجهر استخدام عدسة 20 ×. أولاً خشونة التركيز على الدعم الخاص، ثم قم بضبط ناعما على الخلايا التي تظهر مشرقة في DAPI-القناة.
    3. وضعت فقط في التركيز الخلايا المركزية للعدسة.
      ملاحظة: يمكن الحصول على صور مع أنظمة المجهر مختلفة. في هذا الإعداد، ونحن استخدام مجهر فلورسنت تقليدية وهبت مع برمجيات تجارية قياسية للحصول على الصور.
    4. الحصول على الصور باستخدام كاميرا رقمية 12 بت و 20 ×/0.50 نا والهدف نا ×/0.65 40 مع عوامل التصفية المناسبة للاحمر (الإثارة: 599 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 588 nm) الخضراء (الإثارة: 509، الانبعاثات: 524)، والأزرق (الإثارة: 367 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 452 نانومتر) يسبر.
      ملاحظة: يمكن تصور الصور باستخدام مختلف الأدوات والبرمجيات. نحن نستخدم إيماجيج لتقييم تلطيخ الفلورة والتعريب كيه-التحقيق.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يجب أن يتم تخزين الأسلاك في-20 درجة مئوية. عند التعبئة الأسلاك للتخزين على المدى الطويل، ضع السلك-سداده بجوار الحافة فونكتيوناليزيد وإدراج السلك بعناية في أنبوب الزجاج التخزين، مع الحرص على عدم الأضرار نصيحة فونكتيوناليزيد. إغلاق الزجاج تخزين وتخزين (عمودياً أو أفقياً) في-20 درجة مئوية.
  • Representative Results

    استخدام الإجراء الموضح أعلاه، فمن الممكن لتنفيذ مقايسة المناعية-الحمض النووي "الأسماك" ريادية (أو خلايا أخرى تعادل) أثري السلك فونكتيوناليزيد. قبل إعداد هذا البروتوكول، تم التوافق بين الطريقتين العزم (المناعية-الأسفار مع السمك) على يدعم 2D القياسية. وتم اختيار هذين الخطين الخلية NSCLC المختلفة معربا عن ابكام (مطلوب للانضمام إلى سلك مقترنة مع الأجسام المضادة ضد ابكام). لديهم حالة كيه مختلفة، ومفيدة لاختبار مختلف ظروف البدء. الأولى، NCI-H1975، يكون نوع البرية (WT) كيه الجينات، بينما الثاني، NCI-H3122، يتميز بكية المولدة.

    تم استخدام نظام لكشف كسر حدة جينات كيه لفحص الأسماك. يتألف النظام من المسابر اثنين، واحد (برتقالي) التهجين في المنطقة الدانية داخل كيه في 23 ف 2 وواحدة (الأخضر) التهجين القاصي لكية. في 2D يدعم، توفر "الأسماك" المناعية-الحمض النووي إشارات محددة تحديداً جيدا لكل من الأجسام المضادة والتحقيق (الشكل 2). على وجه الخصوص، كل خلية خطوط أظهر التعريب غشاء ابكام محددة تحديداً جيدا. وعلاوة على ذلك، ظهرت إشارات التحقيق مشرق وحادة: NCI-H1975 الخلايا أظهرت تداخل المسابير البرتقالي والأخضر، تؤكد حالة wildtype الجينات كيه (الشكل 2 أ، ب). على العكس من ذلك، أظهرت الخلايا NCI-H3122 إشارات متداخلة والنقاط الخضراء واحد، مما يعكس حذف لكية الجينات (الشكل 2 ج، د). عندما تم إجراء المقايسة المناعية-الحمض النووي "الأسماك" في 3D دعم سلك فونكتيوناليزيد، إشارات جسم والتحقيق كانت عموما أقل معرفة من 2D دعم. تلوين ابكام كان مرئياً. وكانت كيه مسبار إشارات أقل معرفة ولكن ما زال يعكس حالة كيه المتوقعة (الشكل 3). وأظهرت النتائج أن تلطيخ الفلورة لا تتداخل مع إشارات "الأسماك الحمض النووي". المسابير المهجنة على وجه التحديد مع أهدافها. خط الخلية NCI-H3122 أظهرت شاذة مركز جينات كيه (الشكل 3b)، على النقيض من NCI-H1975، مع جين كيه نوع البرية (الشكل 3a).

    Figure 1
    الشكل 1 : فونكتيوناليزيد الأسلاك، ترتيب التخطيطي لكية المسابير كسر حدة، المخطط للأنماط المتوقعة لإعادة ترتيب كيه، وحامل الخاصة. () الأحمر مربعات تسليط الضوء على ثلاثة أجزاء رئيسية من الأسلاك: فونكتيوناليزيد نصيحة وسلك سداده، ونصيحة فونكتيوناليزيد الأمم المتحدة. نصيحة فونكتيوناليزيد هو الجزء الأكثر حساسية من الأسلاك، ويجب أن لا يلمس أثناء التعامل مع تجنب مفرزة الخلية أو الضرر. (ب) كل من المسابر الأخضر والأحمر على التوالي الربط بتسلسل المنبع والمصب من المكاني للجينات كيه (على اليسار). على اليمين، تظهر أنماط اكسيمبليفيكاتيفي ترتيبات كيه. الإشارات الحمراء والخضراء ومسلم المشارك في الخلايا الطبيعية؛ فصل الإشارات الخضراء والحمراء تشير إلى كيه الجينات كروموسوم فاصل (إزفاء الجين كيه) وإشارة واحدة أخضر-أورانج كولوكاليزيشن (الخلية الشاذة-1). إشارة حمراء واحدة واشارتين خضراء تشير إلى فقدان إشارة حمراء واحدة، مما يوحي إزفاء وحذف (الخلية الشاذة-2). (ج) سلك حامل؛ مربعات حمراء تسليط الضوء على المجالات التي تحتاج إلى الرعاية عند التعامل مع السلك أثناء التحليل المجهري. السلك يمكن الخضوع لإجراء تحليل 360 ° عن طريق تحويل محور دوار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    الشكل 2 : فحص الأسماك المناعية-الحمض النووي في 2D الدعم (ساترة)- (، ب) NCI-H1975 الخلايا إيجابية ضعيفة ابكام. وكانت إشارات فيتك ابكام ملموس. المسابر البرتقالي والأخضر لكية فاصل-عدا متراكبة، تؤكد حالة WT الجينات كيه في خط الخلية NCIH1975. خلايا عرض اثنين أو أكثر من الإشارات المزدوجة كانت موجودة بسبب ما انيوبلويدي. (ج، د) في السطر خلية NCIH3122 الإعراب عن ابكام عالية، كانت إشارات الفلورة مشرق، التي قد تبرز في تقاطعات خلية خلية. الأسماك تحليلات الحذف المؤكدة من الجينات كيه، نموذجية من هذا خط الخلية. وتبين الأسهم الحمراء واحد المسابير الخضراء (دون تحقيقات البرتقال المقابلة)، مما يعكس حذف الجينات كيه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3: "الأسماك" المناعية-الحمض النووي الاعتداء باستخدام السلك فونكتيوناليزيد كدعم 3D- () ممثل صورة خلايا NCI-H1975 على السلك. على الرغم من أن الشكل الثلاثي الأبعاد للخلايا بالأسلاك تجعل من الصعب على الحصول على الصور تماما في التركيز، إشارة ابكام أيضا مرئية في كافة الخلايا. (ب) ممثل الصورة من الخلايا NCI-H3122 على السلك. وأظهرت تحقيقات كيه الجينات الحذف (الأسهم الحمراء)، كما سبق أن ينظر في 2D دعم. الإشارات الخلفية مرئية على الأرجح بسبب وجود طبقة البوليمر. بيد أنه لم يؤثر إلى حد كبير خلية التحليل تحديد الهوية أو الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    المخزن المؤقت تكوين ملاحظة الأرصدة
    خلية كاملة الثقافة المتوسطة ربمي 1640 + 2 مم الجلوتامين + 5-10% مصل بقرى الجنين (FBS). ربمي: 4 درجة مئوية؛ الجلوتامين، FBS:-20 درجة مئوية
    الجسم المضاد ديلويشن المخزن المؤقت 1% جيش صرب البوسنة، X-100 تريتون 0.3% في برنامج تلفزيوني 1 x ختم الرايت مع الفيلم المختبر.
    20 x حل التعاون بين بلدان الجنوب م 3 كلوريد الصوديوم، سترات صوديوم 300 مم حله في ddH20 تصفية الحل ودرجة الحموضة = 7.0 +/-0.1 مع HCl ختم الرايت مع الفيلم المختبر.
    0.4 × الحل SSC تمييع الأسهم 20 x SSC في المقطر ح2س تصفية الحل ودرجة الحموضة = 7.0 +/-0.1 مع HCl الرايت
    ختم مع الفيلم المختبر. 2 × SSC + 0.05% توين 20 الحل تمييع الأسهم 20 × التعاون بين بلدان الجنوب في المقطر ح2س + 0.05% 20 توين تصفية الحل ودرجة الحموضة = 7.0 +/-0.1 مع HCl ختم الرايت مع الفيلم المختبر. DAPI الحل 30 نانومتر تمييع ميكرومتر الأسهم 1.43 في برنامج تلفزيوني 1 x -20 درجة مئوية في حالة الظلام جاهزة للاستخدام اليكووتي

    الجدول 1: وصفات الحلول.

    Discussion

    في هذه الورقة، لأول مرة، أسلوب الجمع بين تلطيخ الفلورة و "الأسماك الحمض النووي"، للاستخدام مع السلك فونكتيوناليزيد اقترح. تم استدعاء الأسلوب "الأسماك" المناعية-الحمض النووي. ووضعت هذه التقنية تسمح تحديد المتزامن ريادية المفترضة على سلك 3D على أساس المعايير الشكلية، مثل الإيجابية إلى ابكام (الحدث 1)، وتيسير الكشف عن التعديلات الجزيئية، مثل (مركز الجينات كيه الحدث 2). تحديد واحد من هذين الحدثين يتيح الكشف عن تلك الترجمة المشارك. ومن ثم، يمكن تكييف هذا النهج تحديد وتوصيف ريادية استردادها من الدم لمرضى السرطان. الآثار المحتملة حمو-مكونات والكريات البيضاء في الإجراء المصبوغة لا تتدخل عادة في الإجراء. على وجه الخصوص، أشارت البيانات المبلغ عنها في الأدب إلى أن هايمو-مكونات والكريات البيضاء لا تؤثر الفلورة تلطيخ الخلايا المرفقة إلى الأسلاك، خطوة حاسمة لتحديد1،ريادية الفعلي15.

    سطوع fluorescence الأسماك المناعية-الحمض النووي ملحوظ أقل قليلاً من إيمونوفوتوتيبينج التقليدية الاعتداء ونتيجة لدرجة الحرارة العالية اللازمة لفحص الأسماك. ومع ذلك، الفلورة تلطيخ لا يزال ملموسا. على سبيل المثال، إشارة باهتة قابلاً للاكتشاف لا يزال في خط الخلية معربا عن ابكام منخفضة، NCIH1975. درجة الحرارة العالية اللازمة لفحص الأسماك هو العامل الرئيسي الذي يحد في اختيار fluorochrome الحق ترتبط الجسم. في هذا البروتوكول، يجب ربط الأجسام المضادة فلوروتشرومي الحرارة من أجل تحمل درجة الحرارة تمسخ الحمض النووي. على سبيل المثال، فيكوريثرين، فلوروتشرومي ثيرموسينسيتيفي، غير مستحسن في هذا الإعداد بسبب تدهور فلوروتشرومي بسبب ارتفاع درجة الحرارة. Fluorescein isothiocyanate هو خيار جيد و fluorochrome المشتركة كثيرا ما يعملون في تحقيقات الأسماك. إشارة أوتوفلوريسسينسي "الأسماك" المناعية-الحمض النووي ضعيف للغاية على يدعم 2D القياسية. على دعم الأسلاك، طبقة البوليمر قد حمل إشارة طفيفة أوتوفلوريسسينسي، لا سيما في القناة الحمراء. على عكس الخلفية 2D، إشارة خلفية أسبيسيفيك ملحوظ على السلك لكن لا تؤثر تأثيراً كبيرا على توصيف الهوية أو خلية الأنوية.

    مجهر التقييم من الأسلاك فاتيجوينج أكثر بكثير مما في 2D دعم بسبب حدود المجهر البصري في القراءة على السطح من بنية ثلاثية الأبعاد على شكل أسطواني. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه الصعوبة بالتناوب صاحب الأسلاك، والحصول على الصور التي يتم ترجمة أساسا على طول خط الوسط الأسلاك. حامل سلك يسمح بدوران 360 درجة للأسلاك. مرة واحدة تركز على الأنوية، تغيير القنوات الأسفار ليس بالضرورة الحفاظ على التركيز في المنطقة المستهدفة. ولهذا السبب، من الضروري للحفاظ على التركيز على المنطقة الداخلية-الخلية المستهدفة.

    ويمكن تكييف هذه التقنية لكشف وتوصيف الخلايا في أنواع مختلفة من يدعم 3D. كما قد يكون من الممكن استخدام الأجسام المضادة المختلفة ويَسْبِر الأسماك. عند اختيار استخدام الأجسام المضادة المختلفة، ثبات فلوروتشرومي ومستوى التعبير مستضد المستهدفة في غشاء الخلية من العوامل الهامة للنظر. يمكن أيضا أن تكون الملون المستضدات داخل الهيولية. عند استخدام الأسماك المختلفة تحقيقات، من المهم التحقق من مواصفات ورقة البيانات للإجراء تمسخ وإعداد الخلايا للأسماك الاعتداء عليه.

    Disclosures

    الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ethanol Carlo Erba # 414605
    Tween 20 BIO RAD # 1706531
    PBS (Phosphate Buffered Saline)  Medicago # 09-9400-100
    Acetone Sigma Aldrich # 534064-500ML
    BSA Sigma Aldrich # A7906
    Triton X-100 Detergent BIO RAD # 1610407
    RUBBERCEMENT Royal Talens # 95306500
    Vysis 20X SSC (66g) Abbott Molecular Inc.  # 30-804850 powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended
    RPMI 1640 Gibco # 31870-025
    FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco # 10270-098
    L-Glutamine (200mM) Gibco # 25030-024
    Penicillin-Streptomycin Gibco # 15140-122
    H20 MilliPore
    XT ALK BA MetaSystems Probes # D-6001-100-OG
    DAPI, FluoroPure grade Invitrogen # D21490
    SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Life Technologies # S36973
    EpCAM-FITC (clone: HEA-125) Mitenyi # 130-080-301
    Micro tubes M-Tube18 Gilupi Nanomedizin
    Detektor CANCER01 EpCAM Gilupi Nanomedizin Functionalized wire
    STAR FROST Microscope Slides Knittel GLÄSER VS1117# 076FKB
    SecureSlip Silicone Supported Coverglass GRACE BIO-LABS # 104112
    ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop  ZEISS
    Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software Nikon BR 4.11.00
    Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera Nikon DS-QiMc

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41, (4), 1241-1250 (2012).
    2. Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. 1-8 (2017).
    3. Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7, (February), 43424 (2017).
    4. Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10, (3), 408-417 (2016).
    5. Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2, (11), 108 (2014).
    6. Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8, (11), e78070 (2013).
    7. Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362, (25), 2380-2388 (2010).
    8. Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368, (25), 2385-2394 (2013).
    9. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373, (17), 1627-1639 (2015).
    10. Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33, (17), 1881-1888 (2015).
    11. Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (41), 16580-16585 (2013).
    12. Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18, (20), 5711-5718 (2012).
    13. Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21, (13), 2883-2885 (2015).
    14. Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11, (8), 1-14 (2016).
    15. Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22, (9), 2197-2206 (2016).
    تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).More

    Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter