Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

هذا الأسلوب يصف الاستنساخ، والتعبير، وتنقية Nsa1 المؤتلف للتصميم الهيكلي البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية (ساكسس)، وقابلاً للتطبيق لتحليل البروتينات الأخرى الهيكلية الهجين يحتوي على كل أمر واضطرابه المجالات.

Abstract

تحديد طول بنية الريبوسوم الجمعية عامل Nsa1 من Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) يشكل تحديا بسبب اضطرابه وحوزتي مجا تيرمينوس ج من البروتين. هذه المخطوطة يصف الأساليب لتنقية Nsa1 المؤتلف من S. cerevisiae للتحليل الهيكلي ساكسس بعلم البلورات بالأشعة السينية. علم البلورات بالأشعة السينية واستخدم حل بنية المجال WD40 الطرفي ن أمر جيد من Nsa1، وثم استخدمت ساكسس لحل هيكل ج-محطة Nsa1 في الحل. الحل تشتت بيانات جمعت من كامل طول Nsa1 في الحل. ثم كشفت مزيجاً من هيئة جامدة و أساسه النمذجة ج-محطة Nsa1، وحسبت ستريك نثر النظرية من هيكل كريستال عالية الدقة للمجال WD40. من خلال هذا النهج الهجين أعيد هيكل رباعي من البروتين الكامل. الأساليب المقدمة هنا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق عموما لتحديد الهيكلية الهجين من غيرها من البروتينات التي تتكون من خليط مجالات منظم وغير منظم.

Introduction

ريبوسوم هي الآلات ريبونوكليوبروتين الكبيرة التي تضطلع بالدور الأساسي لترجمة مرناً إلى البروتينات في جميع الخلايا الحية. ريبوسوم تتكون من وحدتين فرعيتين التي تنتج في عملية معقدة ووصف الريبوسوم نشوء حيوي1،2،،من34. الجمعية الريبوسوم التوكسينات تعتمد على معونة مئات من الجمعية ريبوسومال أساسي العوامل2،،من35. Nsa1 (Nop7 المرتبطة 1) هو عامل الجمعية الريبوسوم التوكسينات مطلوب على وجه التحديد لإنتاج وحدة فرعية ريبوسومال كبيرة6، وهي المعروفة باسم WD-كرر تتضمن 74 (WDR74) في أعلى الكائنات الحية7. لقد ثبت WDR74 أن تكون مطلوبة من أجل تشكيل الكيسة في الفئران8وهو كثيرا ما تحور المروج WDR74 في خلايا السرطان9. ومع ذلك، الدالة واليات دقيقة من Nsa1/WDR74 في الريبوسوم الجمعية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. للبدء في الكشف عن دور Nsa1/WDR74 أثناء النضج الريبوسوم حقيقية النواة، أجريت تحليلات هيكلية متعددة، بما في ذلك علم البلورات بالأشعة السينية، وزاوية صغيرة بالأشعة السينية ونثر (ساكسس)10.

مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) والمجهر الإلكتروني، علم البلورات بالأشعة السينية وساكسس تقنيات هامة لدراسة بنية الجزيئات. الحجم والشكل، وتوافر واستقرار الجزيئات تأثيرات تناسب أسلوب الأحياء الهيكلية التي ستكون أفضل جزيء ضخم خاص، غير أن الجمع بين تقنيات متعددة من خلال اتباع نهج ما يسمى "هجينة" أصبح 11من أداة مفيدة على نحو متزايد. لا سيما علم البلورات بالأشعة السينية وساكسس أساليب قوية ومتكاملة للتصميم الهيكلي للجزيئات الكبيرة12.

علم البلورات توفر هياكل الذرية ذات الدقة العالية بدءاً من الجزيئات الصغيرة إلى الآلية الخلوية الكبيرة مثل الريبوسوم، وقد أدى إلى تحقيق إنجازات عديدة في فهم الوظائف البيولوجية للبروتينات وغيرها 13من الجزيئات الكبيرة. وعلاوة على ذلك، يسخر تصميم الأدوية على أساس هيكل سلطة هياكل الكريستال للالتحام الجزيئية بطرق حسابية، مضيفاً بعدا حاسما ل اكتشاف وتطوير العقاقير14. على الرغم من انطباق واسع النطاق، نظم مرنة واضطرابه تحديا لتقييم علم البلورات حيث يمكن أن تعوق التعبئة كريستال أو إلكترون كثافة الخرائط قد تكون ناقصة أو من نوعية رديئة. على العكس من ذلك، ساكسس نهجاً هيكلي القائم على الحل ومنخفضة الدقة قادرة على وصف نظم مرنة تتراوح بين الحلقات اضطرابه وتيرميني البروتينات جوهريا اضطرابه12،،من1516. معتبرا أنها متوافقة مع مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات12، ساكسس العمل تآزر مع علم البلورات لتوسيع نطاق الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تتناولها الدراسات الهيكلية.

Nsa1 مناسبة لاتباع نهج هيكلية هجين لأنه يحتوي على مجال WD40 جيد التنظيم متبوعاً الوظيفية، ولكن مرنة ج-محطة التي ليست قابلة لأساليب علم البلورات بالأشعة السينية. التالي بروتوكول للاستنساخ، والتعبير، وتنقية Nsa1 S. cerevisiae لتحديد الهيكلية الهجين بعلم البلورات بالأشعة السينية وساكسس. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة هياكل غيرها من البروتينات التي تتكون من خليط من مناطق مرتبة واضطرابه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إنتاج البروتين المؤتلف وتنقية لضمانات الأمن السلبية 1

  1. Nsa1 التعبير بلازميد التصميم والاستنساخ
    1. الحصول على أو شراء S. cerevisiae المجينية الحمض النووي.
    2. [بكر] تضخيم متواليات مستهدفة من Nsa1 (Nsa1فلوريدا، بقايا 1-463) واقتطاع ج-محطة Nsa1 (Nsa1ΔC، وبقايا 1-434) مع الإشعال المناسبة باستخدام الحمض النووي المعزولة من S. cerevisiae ودرجة حرارة ذوبان حوالي 60 درجة مئوية مع وقت تمديد من 1-2 دقيقة. واستخدمت أجهزة الإشعال التالية تضخيم Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: جاتكجااجكجككجكتااككتككتتتتتجكتككك
    3. سوبكلون Nsa1 في فمبب ناقلات التعبير الإشريكيّة القولونية () التي تحتوي على N-مبنى رقم 6 X-الحامض الأميني العلامة التي تليها مالتوس ملزمة البروتين (MBP) وموقع حوزتي فيروس أحفر التبغ (TEV) باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية17 .
    4. استخدام تسلسل الحمض النووي للتحقق من أنه تم استنساخ Nsa1 في الإطار مع العلامة صاحب MBP الطرفي ن.
  2. تعبير البروتين Nsa1
    1. تحويل plasmid(s) التعبير مناسبة كولاي سلالة التعبير مع نظام يستند إلى مروج T7. لوحة ترانسفورمانتس على ألواح أجار رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان لوحة مقلوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. تلقيح ثقافة مل 50 رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين من لوحة التحويل، وأنها تنمو بين عشية وضحاها مع الهز 200 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. تطعيم 3 × 1000 مل رطل في قوارير فيرنباتش مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين مع 15 مل الثقافة بين عشية وضحاها، وأنها تنمو مع الهز 200 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: للبروتين بنية الحل، إدراج سيلينوميثيونيل (سمية) يمكن أن يتحقق بزراعة الخلايا في M9 المتوسطة الدنيا التي تستكمل مع سمية وخليط من الأحماض الأمينية تمنع إنتاج الميثيونين قبل التعريفي، بدلاً من وسائل الإعلام رطل 18.
    4. حمل التعبير عن Nsa1 عندما يصل القطر الخارجي600 ~0.8 بإضافة الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوبيرانوسيدي β-د-1 (إيبتج) بتركيز 1 ملم تليها الحضانة عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز 200 لفة في الدقيقة الأخيرة.
    5. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 5,050 س ز.
      ملاحظة: يمكن تخزين طويل الأجل في-80 درجة مئوية خلايا أو استخدامها فورا لتنقية البروتين.
  3. تنقية البروتين Nsa1
    1. ريسوسبيند الخلايا في 25 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 10 مم مجكل2) مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية الذي يحتوي على قرص المانع حوزتي خالية يدتا واحد.
    2. الخلايا التي سونيكيشن عند 4 درجة مئوية (الوقت 7 دقيقة، 2 s على دورة، 2 s إيقاف دورة؛ السعة: 70%).
    3. توضيح ليستي بالطرد المركزي في 26,900 س ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. تطبيق توضيح إلى عمود تدفق جاذبية محملة 10 مل راتنج تقارب الكوبالت المعطل تداولها، وقبل متوازن مع تحلل المخزن المؤقت.
    5. السماح بتمرير أكثر من الراتنج بتدفق الجاذبية عند 4 درجات مئوية وتغسل الراتنج مرتين مع 100 مل من المخزن المؤقت لتحلل المادة طافية.
    6. الوت Nsa1 مع 20 مل من شطف المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl pH 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 5 مم مجكل2، 5% والغليسيرول وايميدازول 200 ملم).
    7. تأخذ 15 ميكروليتر من النذرة وتشغيله على جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15% للتحقق من أن البروتين هو التيد من الراتنج تقارب (الشكل 1A).
    8. قم بإزالة العلامة MBP بحوزتي TEV الهضم. إضافة 1 مل TEV حوزتي19 (الأوراق المالية 1 ملغ/مل) شطف راتنج تقارب Nsa1 واحتضان أنه في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    9. تركز MBP المشقوق Nsa1 إلى ~ قص 5 مل باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع وزن الجزيئي الخروج من كاتشين 10.
    10. تطبيق Nsa1 المشقوق MBP لعمود هلام ترشيح، قبل اكويليبراتيد في المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5، 100 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم مجكل2والجلسرين 5% 1 مم β-mercaptoethanol) (الشكل 1B).
    11. تحليل كسور العمود من هلام الترشيح للتحقق من أن MBP المشقوق وفصل من Nsa1 بتشغيل 15 ميكروليتر عينات على جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15 ٪ (الشكل 1B).
    12. الجمع بين الكسور التي تحتوي على Nsa1 والتركيز على 8 ملغ/مل باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع وزن الجزيئي قص الخروج من كاتشين 10.
    13. تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي استخدام انقراض معامل م 42530–1سم–1. استخدام البروتين فورا للمحاكمات الفرز وتبلور بروتيوليتيك.

2-بلورة والفحص بروتيوليتيك من وكالة الأمن القومي 1

  1. مصفوفة متناثر الكريستال الفرز من Nsa1
    1. الطرد المركزي 500 ميكروليتر من رصيد 8 ملغ/مل Nsa1 في 16,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. إعداد المحاكمات تبلور استخدام روبوت تبلور وشاشات الكريستال مصفوفة متفرق. ملء الخزان من 96 الصواني جيدا مع 30 ميكروليتر من الكواشف شاشة كريستال الفردية من شاشات تبلور مصفوفة متفرق. إعداد قطرات الجلوس مع الروبوت بمزج 250 nL الحل جيدا مع 250 nL الحل البروتين.
    3. ختم لوحات تبلور مع الشريط واحتضانها لهم عند 25 درجة مئوية.
    4. فحص اللوحات كل يومين في الأسابيع الأولى 2-3 مع ستيريوميكروسكوبي.
    5. تحقق من أن يضرب بلورات المحتملة تحتوي على البروتين مع مجهر الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: بالنسبة Nsa1 كريستال مختلفة نموذجين (مكعب و orthorhombic، الشكل 2 ألف) تم الحصول عليها خلال أسبوع واحد من الشاشات التالية: جكسج + شرط B11 (1.6 م سترات الصوديوم tribasic يذوي، الرقم الهيدروجيني 6.5) ومعالج مرسب التآزر الشاشة بلوك 2 شرط C11 (20.1%(v/v) ربط 1500، 13.4%(v/v) ربط 400، هيدروكسيد الصوديوم حبيس تريس/0.1 متر، ودرجة الحموضة 7.5).
  2. فحص بروتيوليتيك
    ملاحظة: أثناء تبلور الأمثل، فإنه اكتشف أن بلورات أورثورهومبيك من Nsa1 نشأ نتيجة proteolytic الانقسام والبلورات يمكن أن تتكرر لا استخدام البروتين كامل طول. باستخدام مزيج من بروتيوليسيس المحدودة إلى جانب الطيف الكتلي، اتضح أن ج-محطة Nsa1 الحساسة إلى بروتيوليسيس وإزالة الذيل ج-الطرفية المطلوبة للاستنساخ اللاحقة (شكل بلوري Nsa1ΔC).
    1. إعداد 1 ملغ/مل حوزتي الحلول الأسهم التالية البروتياز α-تشيموتريبسين، التربسين، elastase، باباين، سوبتيليسين، واندوبروتيناسي غلو-جيم
    2. إنشاء 01:10، 1: 100، وتخفيف 1: 1000 من كل الأسهم في حوزتي 1 ملغ/مل مع "إضعاف المخزن المؤقت" (10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم 500 مم).
    3. "الماصة؛" ميكروليتر 1 من الأسهم في حوزتي (01:10، 1: 100 و 1: 1000) في 9 ميكروليتر مختبرين للبروتين (1 ملغ/مل) لكل مبطلات فحص.
    4. احتضان الحل في 37 درجة مئوية ح 1.
    5. وقف رد الفعل بإضافة 10 ميكروليتر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة x 2 عينة المخزن المؤقت والحرارة رد فعل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. تحليل النبذ بتشغيلها في جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15 ٪ (الشكل 2).
    7. تحديد المجالات مقاومة حوزتي من البروتين المستهدف بالتحليل في جل الطيف الكتلي.
    8. إزالة المناطق حوزتي مجا من البروتين المستهدف بإنشاء تعبير مبتوراً بنيات واتباع بروتوكول الاستنساخ، والتعبير، وتنقية الموصوفة أعلاه.
  3. تبلور الأمثل
    1. إعداد أو الحصول على حلول الأسهم من الكواشف تبلور الأولية التالية: 1.6 م سترات الصوديوم tribasic يذوي درجة الحموضة 6.5، 100%(v/v) ربط 400، 50%(v/v) ربط 1500، هيدروكسيد الصوديوم حبيس/1 م، ودرجة الحموضة 7.5.
    2. إعداد حل أسهم من Nsa1فلوريدا و Nsa1ΔC في 8 ملغ/مل كما هو موضح أعلاه.
    3. تحسين بلورات مكعب Nsa1 (Nsa1فلوريدا).
      1. إعداد شاشة شبكة 24-جيدا مع الآبار التي تحتوي على 500 ميليلتر مع تدرج 1-1.6 متر من سترات الصوديوم مع درجة الحموضة 6.5 من حل أسهم من 1.6 متر سترات الصوديوم تريباسيك مع درجة الحموضة 6.5.
      2. ميكس 1 ميليلتر من البروتين مع 1 ميليلتر الحل جيدا ومكان الخليط إلى شريحة غلاف سيليكونيزيد. مختومة بعناية عكس الشريحة غطاء رأس مدهون مسبقاً جيدا والتأكد من أنها كذلك ولكن رعاية لا تخل الإسقاط أو كسر غطاء الشريحة. كرر هذه العملية حتى يتم ملء العلبة ومن ثم تخزين عند 25 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب أن تظهر بلورات مكعب صغير في 2-7 أيام.
      3. إعداد مخزون ميكروسد من بلورات مكعب. استخدم حلقة نايلون محملة لنقل بلورات مكعب صغير ~ 10 إلى أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل تحتوي على حبة صغيرة و 50 ميليلتر من 1.6 متر سترات الصوديوم فيت تريباسيك الرقم الهيدروجيني 6.5.
      4. دوامة أنبوب 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية (~ 3000 لفة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة.
      5. جعل سلسلة من تخفيف المسلسل إذ مخزون البذور مع 1.6 متر سترات الصوديوم تريباسيك ودوامه الخليط جيدا ل 5 ق.
      6. ملء كل جيدا لشبكة 24-حسنا، شاشة مع 500 ميليلتر من 1.6 متر سترات الصوديوم تريباسيك الرقم الهيدروجيني 6.5.
      7. تحسين ظروف ميكروسيدينج بإعداد قطرات مع نسب متفاوتة من البروتين مع حلول الزريعة (الشكل 3A). يجب أن تظهر بلورات مكعب أكبر من حيود عالية الجودة في 2-5 أيام (الشكل 3).
    4. تحسين بلورات أورثورهومبيك (Nsa1ΔC)
      1. إعداد شاشة شبكة مع 500 ميليلتر في كل بئر بظروف مختلفة 24 (الشكل 3B) من حلول الأسهم 50%(v/v) ربط 1500، وربط 400 100%(v/v). بالإضافة إلى التدرجات من ربط 1500 وربط 400، كل جيدا ينبغي أن تتضمن أيضا 0.1 م حبيس/الصوديوم هيدروكسيد درجة الحموضة 7.5.
      2. يخلط 1 ميليلتر من حل البروتين 1 ميليلتر الحل جيدا على شريحة غلاف سيليكونيزيد. بعناية عكس الشريحة غطاء رأس مدهون مسبقاً جيدا والتأكد من أنها مختومة جيدا. كرر هذه العملية حتى تم شغل الدرج بأكمله. تخزين علب الورق عند 25 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب أن تظهر بلورات أورثورهومبيك Nsa1 في 2-7 أيام.
      3. مواصلة تحسين بلورات orthorhombic ميكروسيدينج كما هو موضح لبلورات مكعب (الخطوات 2.3.3.3 إلى 2.3.3.7) باستخدام 500 ميليلتر 20.1%(v/v) ربط 1500 و 13.4%(v/v) ربط 400 م 0.1 حبيس/الصوديوم هيدروكسيد درجة الحموضة 7.5 كحل جيد.
        ملاحظة: بلورات سمية Nsa1 ينبغي أن يكون الأمثل مماثلة لبلورات الأصلي.

3-حيود الأشعة السينية جمع البيانات ووكالة الأمن القومي 1 بنية الحل

  1. Cryo-الحماية من بلورات وجمع البيانات حيود الأشعة السينية
    1. لبلورات أورثورهومبيك (Nsa1ΔC)، إعداد محلول كريوبروتيكتانت 1 مل يحتوي على 22.5%(v/v) ربط 1500 و 15%(v/v) ربط 400 م 0.1 حبيس/الصوديوم هيدروكسيد درجة الحموضة 7.5.
    2. ملء رغوة ديوار مع النتروجين السائل، وتبريد قبل عفريت كريستال. توخي الحذر عند العمل باستخدام النتروجين السائل وارتداء قفازات واقية ونظارات واقية.
    3. بعناية عكس الشريحة غطاء لبلورة أيضا تحتوي على بلورات على خشبة المسرح من ستيريوميكروسكوبي.
    4. "الماصة؛" 2 ميليلتر من محلول كريوبروتيكتانت على شريحة جديدة من غطاء.
    5. إرفاق حلقة نايلون محملة من الحجم المناسب للبلورة بعصا cryo مغناطيسي.
    6. استخدام المعونة من ستيريوميكروسكوبي، بسرعة نقل كريستال في حل كريوبروتيكتانت مع الحلقة المحملة من البرد.
    7. واسمحوا الكريستال حجته لمدة 5 دقائق في حل كريوبروتيكتانت.
    8. استخدام المعونة من ستيريوميكروسكوبي، بسرعة حلقة الكريستال من حل كريوبروتيكتانت وتجميد يغرق في نيتروجين سائل.
    9. الانتظار للنتروجين السائل حول الحلقة لوقف الغليان وثم حرر في الحلقة من العصا إلى مكان محدد داخل عفريت كريستال.
    10. Nsa1 مكعب بلوراتفلوريدا لا تحتاج إلى أن تكون كريوبروتيكتيد، ويمكن أن تكون مباشرة فلاش المجمدة (عقب 3.1.8-3.1.9 الخطوات أعلاه).
    11. ختم عفريت كريستال باستخدام أدوات البرد ونقل عصا النقل البحري في ديوار مبردة مسبقاً. تخزين البلورات في كرات الصولجان/dewars حتى جمع البيانات.
    12. إذا كان جمع البيانات في السنكروتروني، السفينة البلورات إلى السنكروتروني استخدام الشاحن جافة.
    13. جمع البيانات حيود الأشعة السينية عقب التقنيات القياسية20.
      ملاحظة: أصلي Nsa1 والساحل ومجموعات البيانات (طول موجي واحد تشتت الشاذة) جمعت في 100 ك خطوط شعاع SER-القط معرف-22 و 22-BM مصدر فوتون متقدمة في "مختبر أرغون الوطني" (شيكاغو). تم تجميعها في dataset Nsa1 حزين في λ = 0.97911 Å. تم تسجيل البيانات باستخدام وقت تعرض 1 s وذبذبات 0.5°. وكانت موسيسيتي من هذه البلورات عادة حوالي 0.3 درجة.
    14. وعملية تغيير حجم الصور حيود الأشعة السينية لإنشاء ملفات انعكاسا لكل مجموعة بيانات في مجموعة الفضاء الملائمة.
      ملاحظة: تم تجهيز مجموعات البيانات الحيود Nsa1 مع HKL200021. تم تجهيز البلورات Nsa1 مكعب في الفضاء مجموعة P213 وجهزت بلورات orthorhombic في الفضاء مجموعة P212121.
  2. Nsa1 بنية الحل.
    ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج البلورات التي يمكن استخدامها لحل وتحسين هياكل الكريستال بما في ذلك فينيكس و CCP4،من2223. التالي هو بروتوكول Nsa1 بنية الحل باستخدام مجموعة برامج فينيكس22.
    1. تحليل أصلي وحزين تحجيم مجموعات البيانات مع phenix.xtriage22.
    2. حل بنية Nsa1 مع Phenix.autosol استخدام الذروة حزينة انعكاس الملف22،24. لتشغيل برنامج أوتوسول، إدخال عدد المواقع selenomethionine (مواقع = 9)، ملف تسلسل فاستا Nsa1ΔC، وطول الموجه المستخدمة لجمع البيانات حزين (λ = 0.97911 Å).
      ملاحظة: من dataset Nsa1 SAD، ينبغي أن يكون phenix.autosol قادرة على تحديد المراحل التجريبية وبناء أكثر من النموذج.
    3. التعديلات اليدوية إلى النموذج مع أبله25، تليها الصقل في phenix.refine،من2226.
    4. حل هيكل بلوري الأصلية ذات الدقة العالية وبلوري مكعب باستبدال الجزيئية باستخدام فيزر27،28.
    5. بعد حل هيكل الناجحة، وفحص النموذج وكثافة الإلكترونات الخريطة في الكاحل25.
    6. بناء وصقل الهياكل عن طريق تشغيل جولات متكررة من الصقل في phenix.refine،من2226 ونموذج بناء في الكاحل25.

4-ساكسس جمع البيانات وتجهيزها، والنمذجة

  1. ساكسس جمع البيانات
    ملاحظة: تم تسجيل البيانات ساكسس لكامل طول S. cerevisiae Nsa1 في "مصدر الضوء المتقدم"، على بيمليني العرافات الفائق 12.3.1 في "مختبر لورنس بيركلي الوطني"، بيركلي، كاليفورنيا29.
    1. تنقية Nsa1فلوريدا عقب البروتوكول، المذكورة أعلاه. 24 ساعة قبل شحن Nsa1فلوريدا إلى بيمليني، دهس البروتين عمود هلام ترشيح متوازن مسبقاً في مخزن مؤقت أ
    2. تجمع الكسور التي تحتوي على Nsa1 وتحديد تركيز البروتين كما هو موضح سابقا.
    3. إعداد 30 ميكروليتر مختبرين في تركيز سلسلة من Nsa1 من 1 إلى 6.2 ملغ/مل باستخدام مخزن مؤقت أ
    4. نقل 20 ميكروليتر من سلسلة تركيز كل من Nsa1 إلى تنورة واضحة كامل 96 ميكروسكوبية جيدا جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت بوحدة التحكم.
      ملاحظة: جمع البيانات ساكسس عن تمييع الحلول استخدام تركيزات العديد من عينة المنقي لتجنب التنافر بين الجسيمات والتجميع، وآثار أضرار الإشعاع.
    5. ختم الصفيحة مع سيليكون ختم حصيرة والسفينة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية إلى بيمليني.
    6. تخزين الميكروسكوبية في 4 درجات مئوية حتى جمع البيانات.
    7. مباشرة قبل جمع البيانات، وتدور اللوحة في 3200 x ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية إزالة الركام المحتملة وفقاعات الهواء.
    8. سجل ساكسس البيانات.
      ملاحظة: ل Nsa1، تم تسجيل بيانات ساكسس للمخزن المؤقت قبل وبعد كل سلسلة تركيز البروتين. مسح متتالية ثلاثة وثلاثين من 0.3 ثانية جمعت ل Nsa1فلوريدا أكثر من تركيز سلسلة (6، 1 إلى 2 مغ/مل) في 10 درجة مئوية.
    9. تنفيذ الطرح المخزن المؤقت لبيانات ساكسس.
      ملاحظة: ل Nsa1 تم الطرح المخزن المؤقت تلقائياً في بيمليني لكن الطرح المخزن المؤقت يمكن أن يؤديها أيضا استخدام برامج الحد من البيانات مثل مبعثر30 و31جناح أتساس. المخزن المؤقت للطرح جزء هام من تحليل البيانات ساكسس وينبغي الحرص على ضمان أن يكون المخزن المؤقت المستخدم للطرح مطابق للعينة البروتين المخزن المؤقت.
    10. متوسط 33 على التوالي بمسح لإنشاء ملف *ave.dat لكل تركيز.
      ملاحظة: تراكب الإطارات 33 على التوالي مقارنة المنحنيات. التغييرات إلى منحنيات ونثر على مر الزمن في كثير من الأحيان يدل على أضرار الإشعاع. استبعاد هذه الإطارات من المتوسط. وأجرى في المتوسط من الأشعة على التوالي Nsa1 تلقائياً في بيمليني العرافات.
  2. ساكسس تجهيز البيانات ومقارنة سلسلة تركيز
    ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج التي يمكن استخدامها لتحليل البيانات ساكسس. ل Nsa1 حددت دائرة نصف قطرها gyration والمسافة لبير توزيع المهام باستخدام بريموس32 و33 من غنوم من أتساس 2.7.2 جناح31 والمقارنة عبر جميع تركيزات البروتين لضمان وجود لا إشعاع الضرر أو التفاعلات بين الجسيمات تعتمد على تركيز10.
    1. فتح المحطة طرفية قذيفة، وانتقل إلى الدليل الذي يحتوي على البيانات ساكسس.
    2. إطلاق بريموس32 واجهة المستخدم الرسومية من داخل المحطة الطرفية shell.
    3. ضمن "واجهة المستخدم الرسومية بريموس"، تحميل منحنيات نثر (* ave.dat).
    4. استخدم كاتبز لتحديد دائرة نصف قطرها Gyration (صز) وللأمام كثافة نثر I(0)، لكل منحنى ونثر (* ave.dat).
    5. توليد المؤامرات كراتكي لكل منحنى ونثر (* ave.dat)، لتقييم درجة اﻻكتناز.
    6. استخدام أوتوجنوم33 لحساب دالة التوزيع لبير (تسمى أيضا P(r)) لكل منحنى ونثر (* ave.dat). أدخل انطلاق دماكس ≈ 3 * صز د قيمةالحد الأقصى للحصول على منحنى P(r) سلس على النحو الأمثل. خلال الاستفادة المثلى من دماكس، تأكد من أن P(r) المحسوبة دالة يتسق مع المنحنى التجريبي ونثر بالتحقق من قيمة2 χ المبلغ عنها وتقييم مجمل تلائم المنحنى نثر بصريا.
    7. حساب الوزن الجزيئي ل Nsa1 من نثر المنحنيات باستخدام حجم ارتباط34.
    8. مقارنة المعلمات الهيكلية لكل تركيز التأكد من أنه لا توجد أي أضرار الإشعاع أو الآثار تعتمد على التركيز.
      ملاحظة: يمكن أن تظهر آثار تركيز كزيادة صز ودكحد أقصى بالنسبة زيادة تركيز بروتين. إلى الأمام نثر I(0) مقسوماً على تركيز العينة ينبغي أيضا تظل ثابتة عبر سلسلة تركيز البروتين.
  3. ساكسس النمذجة
    ملاحظة: لتحديد موضع ج-محطة Nsa1فلوريدا، Nsa1 كريستال الهيكل10 (PDB 5SUM) والمنحنيات ونثر ساكسس استخدمت للقيام بالجمع بين هيئة جامدة و أساسه النمذجة، واستخدام البرامج باقة 35 و الأسلوب الأمثل فرقة (الانتخابات)36 من جناح البرمجيات أتساس31. مجال WD40 Nsa1 يعامل كهيئة جامدة، بينما كانت على غرار ج-محطة Nsa1 جنبا إلى جنب مع عدة حلقات اضطرابه من المجال WD40 لاحتواء البيانات ساكسس التجريبية.
    1. إنشاء ملفات PDB الإدخال. يجب تقسيم الملف PDB كل مرة بقايا مفقودة من السلسلة الرئيسية، ولا يمكن أن تحتوي على عدة والتشكلات، يغاندس، ملف PDB أو جزيئات المياه.
    2. قم بتشغيل برنامج Pre_BUNCH35 لإعداد ملف PDB الإدخال لمجموعة (pre_bunch.pdb). إدخال تسلسل البروتين المستهدف (*.seq)، العدد من المجالات/بدبس التي تم إنشاؤها في 4.3.1، وكل من ملفات PDB الفردية التي تم إنشاؤها أعلاه.
    3. حساب الاتساع ونثر لكل ملف PDB الفردية باستخدام برنامج كريسول37. لتشغيل الإدخال كريسول ملف PDB الفردية ومنحني نثر ساكسس التجريبية (*.dat). سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف ستريك (*.alm).
    4. تشغيل باقة البرنامج35 نموذج المجال WD40 من Nsa1 ضد ساكسس البيانات باستخدام نهج الهيئة و منذ البداية جامدة مجتمعة. إدخال ملف PDB من Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb)، ومنحني نثر ساكسس التجريبية (*.dat)، والسعة الفردية (*.alm) ملفات لكل ملف PDB الجزئية التي تم إنشاؤها بواسطة كريسول.
    5. مقارنة القيمة2 χ من PDB انطلاق (5SUM) مع أن من طراز أصلها المتولدة عن مجموعة باستخدام البيانات ساكسس التجريبية.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون نموذجا ناجحاً من مجموعة قيمة2 χ أقل بكثير من طراز انطلاق. بعثرة النظري لنموذج مجموعة يجب أيضا أن تصف أيضا البيانات التجريبية كما يحكم بالفحص البصري للتراكب بين بعثرة النظري لنموذج مجموعة البيانات ساكسس وقيمته2 χ (الشكل 4، مركز خطوط الأنابيب).
    6. فحص ملفات الإخراج من باقة في بيمول38 تراكب بنية بلورية مع نموذج المتولدة عن حفنة، والمغلف ساكسس (الشكل 4، مركز خط الأنابيب) يدوياً.
    7. أعد تشغيل باقة 10-20 ضعفا لتوليد نماذج مستقلة التأكد من أن النماذج مماثلة.
      ملاحظة: ل Nsa1 كان هناك نطاق من القيم2 χ من ~ 1 إلى 3 من يدير مستقلة 20.
    8. فرقة النمذجة
      ملاحظة: كنهج اختياري لمجموعة تشغيل أما من بعثة مراقبة الانتخابات36 أو "الحد الأدنى فرقة البحث"39 (MES). بعثة لمراقبة الانتخابات، ومس استخدام نهج الفرقة، وأيضا مناسبة للبروتينات مع مرونة المجالات/المناطق التي في والتشكلات متعددة.
      1. قم بتشغيل برنامج مراقبة الانتخابات36 استخدام الخادم على شبكة الإنترنت أتساس. لتشغيل بعثة لمراقبة الانتخابات، ملفات PDB من 4.3.1، تسلسل البروتين المستهدف (*.seq)، والبيانات التجريبية ساكسس (*.dat) الإدخال.
      2. مقارنة القيم2 χ من PDB انطلاق (5SUM) مع أن من الفرقة التي تم إنشاؤها باستخدام البيانات التجريبية ساكسس بعثة لمراقبة الانتخابات.
        ملاحظة: ينبغي أن يكون فرقة مراقبة الانتخابات ناجحة قيمة2 χ أقل بكثير من طراز انطلاق. بعثرة النظرية للفرقة يجب أيضا أن تصف أيضا البيانات التجريبية كما يحكم بالفحص البصري للتراكب بين بعثرة النظرية للفرقة إلى البيانات ساكسس وقيمته2 χ (الشكل 4، حق خط الأنابيب). أحد يجب أيضا مقارنة القيم2 χ من باقة وبعثة مراقبة الانتخابات لتحديد النموذج الذي أفضل وصف البيانات ساكسس التجريبية.
      3. افحص يدوياً كونفورميرس بعثة لمراقبة الانتخابات في بيمول38 تراكب بنية بلورية مع كونفورميرس التي تم إنشاؤها بواسطة بعثة لمراقبة الانتخابات (الشكل 4). ملاحظة العدد الإجمالي من كونفورميرس وجزء صغير من شغل لكل الامتثال أن يسهم في تشتت المنحنى. لجزيئات أكثر تشدداً، مثل Nsa1، ينبغي أن يكون عدد كونفورميرس الصغيرة (1-5) (الشكل 4، أنابيب الحق)36.
      4. إعادة تشغيل مراقبة الانتخابات عدة مرات لضمان الحصول على نتائج متسقة.
        ملاحظة: ل Nsa1 من كونفورميرس وكان العدد عادة 3 إلى 4 مع χ2 قيم تتراوح من 0.1 إلى 0.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان Nsa1 بكر تضخيم من الحمض النووي S. cerevisiae وسوبكلونيد إلى ناقل التي تحتوي على علامة تقارب العاشر 6-الحامض الأميني الطرفي ن تليها MBP وموقع البروتياز TEV. وتحولت Nsa1 إلى خلايا BL21(DE3) كولاي وعالية الغلة من التعبير البروتين تم الحصول عليها بعد التعريفي مع إيبتج والنمو عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها (الشكل 1A). وكان Nsa1 تنقية تقارب راتنج تقارب الكوبالت المعطل تداولها، متبوعاً بانشقاق MBP بحوزتي TEV، وأخيراً حل بحجم الاستبعاد اللوني (الشكل 1B). كسور من حجم الاستبعاد اللوني الذي يحتوي على Nsa1 المجمعة، تتركز على 8 ملغ/مل وثم استخدامها لبلورة التجارب مع روبوت تبلور. شاشات الكريستال مصفوفة متناثر الأولية أسفرت عن أشكال كريستال مختلفة اثنين من Nsa1، أورثورهومبيك ومكعب (الشكل 2A).

وخلال الاستفادة المثلى بلورات مكعب و orthorhombic، اكتشف أن بلورات orthorhombic نشأت كنتيجة للانقسام بروتيوليتيك من Nsa1. واستخدمت بروتيوليسيس المحدودة والطيف الكتلي لتحديد منطقة Nsa1 التي كانت حساسة ل proteolysis، ولوحظ أن Nsa1 الحساسة لتدرج التركيز من elastase البروتياز (الشكل 2). وأكد تحليل الطيف الكتلي اللاحقة أن هذا التدهور نتيجة لفقدان ج-محطة Nsa1. تم توليد سلسلة من ترونكيشنز ج--المحطة الطرفية من Nsa1، لإزالة حساسية proteolytic ج-المحطة (الشكل 2). ويمكن تكرار بلورات orthorhombic بالاقتطاعΔC (بقايا 1-434) Nsa1، الذي كان يستخدم في نهاية المطاف لتصميم هيكل حزينة. ويمكن أيضا تكرار بلورات orthorhombic بعلاج Nsa1فلوريدا مع الستسي لمدة ساعة عند 4 درجة مئوية قبل إعداد الصواني الكريستال.

بلورات Nsa1 مكعب كانت الأمثل باستخدام Nsa1فلوريدا من خلال مجموعة من التدرجات سترات الصوديوم، مقرونة مع ميكروسيدينج (الشكل 3A). أسفر هذا عن بلورات مكعب كبير، واستنساخه، مع حد حيود حوالي 2.8 قرار (الشكل 3، اليسار). بلورات أورثورهومبيك يمكن أن يكون الأمثل فقط استخدام المتغيرات اقتطاع ج--المحطة الطرفية من Nsa1، بمختلف التدرجات تركيز 1500 ربط وربط 400، جنبا إلى جنب مع ميكروسيدينج، التي أسفرت عن بلورات كبيرة مع حد حيود حوالي 1.25 القرار (الشكل 3 أ-ج). حددت المراحل التجريبية ل Nsa1 بالساحل سمية ومن سمية-مشتق من Nsa1ΔC10.

تم حل المجال WD40 سبعة البيضاء β-المروحة الطرفي ن من Nsa1 جيدا في كل هياكل الكريستال مكعب و orthorhombic، بيد أن كلا هياكل تفتقر إلى كثافة الإلكترون ج-محطة Nsa1. ثم استخدمت ساكسس لتحديد موضع المجال ج-الطرفية مفقود من Nsa1 في الحل. بعد التحسين لتركيز العينة لجمع البيانات، استخدم الهيكل الذري الجزئي لتنفيذ النمذجة هيئة جامدة، وتولد إعادة إعمار منذ البداية من المكونات المفقودة. تم تقييم النموذج فيما يتعلق بالخير الملاءمة للمنحنيات نثر المحسوبة على البيانات التجريبية (الشكل 4، مركز خط الأنابيب). مجال WD40 Nsa1 وحدها ليس مناسباً من البيانات التجريبية ساكسس، كما يدل على ذلك التناقض بين المنحنى نثر تجريبية مع منحنى نثر النظرية، التي تم إنشاؤها من هيكل كريستال 5SUM معرف PDB (الشكل 4، أنبوب الأيسر). وبالإضافة إلى النمذجة هيئة جامدة، كما فعلت فرقة النمذجة. هذا أنتجت فرقة من 3 إلى 4 كونفورميرس من Nsa1، وأدت إلى انخفاض قيمة2 χ (الشكل 4، أنابيب الحق). التخفيض في نموذج التناقض (χ2) استخدام النمذجة فرقة كشفت العينات conformational الذيل Nsa1 ج--المحطة الطرفية في الحل.

Figure 1
رقم 1. التعبير وتنقية Nsa1 مع علامة X صاحب MBP انصهار 6- (أ)-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل التعبير البروتين في BL21 (DE3) الخلايا عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها وتنقية الخطوة الأولى باستخدام راتنج تقارب الكوبالت. (ب) ممثل حجم الاستبعاد chromatogram عقب انشقاق TEV. تم تحليل الكسور من حجم الاستبعاد اللوني بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة. الكسور من ذروة Nsa1 التي تحتوي على 1 تم جمعها واستخدامها للتحليل الهيكلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. ج-محطة Nsa1 حساس إلى بروتيوليسيس- (A) تبلور أولى محاكمات Nsa1 أسفرت عن شكلين بلورات مختلفة: مكعب وأورثورهومبيك. واستخدمت للتحقق من أن يتضمن البلورات البروتين مجهر الأشعة فوق البنفسجية. مقارنة: الضوء المرئي، الأشعة فوق البنفسجية: الأشعة فوق البنفسجية مجاهر. شريط المقياس = 50 ميكرومتر في كل إطار. (ب (proteolytic فحص تحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. تم الجمع بين تخفيف ثلاث (01:10، 1: 100، 1: 1000) لكل سهم مبطلات (0.1، 0.01، 0.001 مغ/مل) مع مختبرين للبروتين (1 ملغ/مل) فحص. تم تحليل المجالات مقاومة حوزتي صفحة الحزب الديمقراطي الصربي والطيف الكتلي بعد الحضانة 37 درجة مئوية للحد الأدنى 60 Nsa1-فلوريدا: الطازجة تنقية البروتين، Nsa1Δ: تنقية البروتينات المخزنة في 4 درجات مئوية لمدة 3 أسابيع بعد ذلك لوحظ شكل متدهورة من البروتين. (ج) التخطيطي الرسم التخطيطي لكامل طول Nsa1 (العلوي) والاقتطاع ج-الطرفية تشييد (السفلي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. التحسين بلورة Nsa1. (أ) مخزون البذور وأعد من البلورات الصغيرة الأولية وتستخدم لجعل سلسلة تمييع (س 1 ~ 1/104x) (ميكروسيدينج). عن طريق خلط 1 ميليلتر من البروتين مع 1 ميليلتر من الزريعة المخفف، نما بلورات مفردة أكبر في غضون أسبوع. (ب) مرسب الانحدار تركيز للتحسين بلوري. (ج) تحسين بلورات مكعب و orthorhombic المستخدمة لجمع البيانات. دوائر خضراء تشير إلى منطقة نموذجية علب الكريستال التي أسفرت عن جمع البيانات النوعية البلورات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. التخطيطي للتحليل ساكسس Nsa1. نظرة عامة على خط الأنابيب المستخدمة في معالجة البيانات ساكسس وإنشاء نماذج مع مجموعة (في الوسط) وبعثة لمراقبة الانتخابات (يمين). خط الأنابيب الأيسر يظهر التناقض بين المنحنى التجريبي ونثر (دوائر حمراء، وتركيز البروتين: 6 مغ/مل) مع النظرية ونثر المنحنى (الخط الأزرق)، التي تم إنشاؤها من هيكل كريستال 5SUM معرف PDB. النماذج التي قيمت بمقارنة المنحنى نثر ساكسس التجريبية (دوائر حمراء، وتركيز البروتين: 6 مغ/مل) مع منحنى نثر مستمدة من طراز حفنة من Nsa1 (خط أسود) أو كونفورميرس بعثة مراقبة الانتخابات من Nsa1 (خط أسود). في كل نموذج، ويبين المجال WD40 الكرتون الملون باللون الأخضر (5SUM معرف PDB)، يظهر المرونة ج-المحطة في المجالات الملونة باللون الأحمر لحفنة والأخضر والبنفسجي والسماوي والأصفر كونفورميرس بعثة مراقبة الانتخابات الفردية. يسمى جزء صغير من كل الامتثال المتأتية من بعثة مراقبة الانتخابات بجوار الطراز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام هذا البروتوكول، ولدت الدراسات الهيكلية Nsa1 المؤتلف من S. cerevisiae ساكسس بعلم البلورات بالأشعة السينية. وقد تصرفت بشكل جيد في حل Nsa1 وتبلورت في أشكال بلورية متعددة. وخلال الاستفادة المثلى من هذه البلورات، اكتشف أن ج-محطة Nsa1 كانت حساسة لتدهور حوزتي. عالية الدقة، يمكن فقط تكرار نموذج بلوري مع المتغيرات اقتطاع ج--المحطة الطرفية من Nsa1، من المحتمل نظراً للمرونة ج-المحطة من Nsa1 منعت التعبئة كريستال. هيكل Nsa1 تم حلها عن طريق البلورات بالأشعة السينية بدقة عالية، ولكن لا يمكن بناء ج-المحطة في شكل كريستال أما لأنه لم يؤمر. علم البلورات هو تقنية العرض لتحديد هياكل القرار الذري من الجزيئات حول حجم Nsa1، ولكن كما هو الحال مع أي أسلوب، علم البلورات ببعض القيود. واحد أوجه القصور الرئيسية في علم البلورات هو عجز عن حل المناطق اضطرابه من البروتينات40،41.

ج-محطة Nsa1 المهم التعريب النوية المناسبة من البروتين، مما يؤكد الحاجة إلى دراسة الهيكل10. ج-محطة Nsa1، وكان يحلها ساكسس، تقنية بيولوجيا هيكلية تكميلية لعلم البلورات بالأشعة السينية. وسجلت البيانات ساكسس لكامل طول Nsa1 عبر سلسلة تركيز. من هذه السلسلة التركيز، تقرر تركيز الأمثل ساكسس Nsa1 جمع البيانات وتجهيزها. وسجلت البيانات ساكسس ل Nsa1 في 6 و 4.5 و 3.0 مغ/مل. حددت المنطقة جينر، والدالة P(r) والوزن الجزيئي عبر سلسلة التركيز لضمان حسن تصرف ولا مجمعة تحت الظروف التجريبية اختبار العينة. لإعادة بناء هيكل كامل طول Nsa1، مصممة مطال تشتت النظرية من هيكل الكريستال الجزئية، وثم استخدمت الطرق منذ البداية نموذج مرن ج-المحطة. من هذا النهج الهجينة، تقرر أن المرونة ج-المحطة من Nsa1 يمتد إلى الخارج من المجال WD40 مرتبة.

ودفعت السلف في تجهيز أدوات شعبية ساكسس للدراسات الهيكلية الجزيئات. ساكسس تدابير نمط تبعثر الأشعة السينية من البروتين المنحى عشوائياً في إيجاد حل لتوفير المعلومات الهيكلية ذات الدقة المنخفضة، بما في ذلك الكتلة الجزيئية والشكل العام. ونتيجة لذلك، برز ساكسس كأداة التحقق من صحة بنية متعامد قوية لعلم البلورات. هذا إلى حد كبير نتيجة لتطور الطرق الحسابية لحساب بعثرة النظرية الذرية الهياكل ومقارنتها ب البيانات ساكسس التجريبية37. يمكن مقارنته باستخدام هذا النهج، كونفورماشونال الدولة وهيكل رباعي، والجمعية أعلى ترتيب في شعرية كريستال بالخصائص الهيكلية للجسيمات في الحل. علاوة على ذلك، الحلقات اضطرابه تيرميني في عداد المفقودين في الهياكل ذات دقة عالية يحددها علم البلورات بالأشعة السينية يمكن أن تكون على غرار واستخدام الحل تشتت البيانات. هذا النهج الهيكلية الهجين يستخدم بنية بلورية كلبنة للنمذجة الإرشادية ساكسس المخلفات مفقود وقد ثبت أن تكون فعالة في رسم الخرائط ج-المحطة Nsa110، فضلا عن الجزيئات الأخرى مثل فيروس الإنفلونزا أ M1 مصفوفة البروتين42، والجيش الملكي النيبالي الميت-مربع مشرفات43. البرمجيات النمذجة المتقدمة على أساس ساكسس يمكن أيضا معالجة نظم أكثر تعقيداً، مثل البروتينات اضطرابه جوهريا، عن طريق تعيين المشهد كونفورماشونال لهذه النظم باستخدام سلسلة من كونفورميرس التي تسهم مجتمعة إلى بعثرة الشاملة الإمكانات للجسيمات في الحل16،39. التقدم معا، والأخيرة المتخذة في أدوات جمع وتجهيز البيانات ساكسس يسهم في نجاح النهج الأحياء الهيكلية الهجين للتصدي لتحدي النظم البيولوجية.

مزيج نثر الحل مع هياكل عالية الدقة تستعد للإجابة على أسئلة هامة حول المرونة وديناميات الجزيئات44. وقد العديد من البروتينات، مثل Nsa1، المناطق الحيوية الهامة للوظيفة البيولوجية. في هذه المخطوطة يرد بروتوكول قالب الذي تفاصيل تركيبة ساكسس بتصميم هيكل عالي الاستبانة حسب علم البلورات بالأشعة السينية. بالإضافة إلى الأشعة السينية علم البلورات ساكسس يمكن أن تستخدم أيضا لمجاملة تقنيات البيولوجيا الهيكلية الأخرى بما في ذلك الرنين المغناطيسي النووي، إلكترون باراماجنيتيك الرنين (EPR)، والأسفار الطاقة الرنين نقل (الحنق)، وكذلك إبراز أهمية ساكسس كعلم الأحياء هيكلية تكميلية تقنية45،،من4647.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وجمعت البيانات حيود في "جنوب شرق الإقليمي وصول الفريق التعاوني" (SER-القط) 22-معرف و 22-BM بيملينيس في المتقدم فوتون المصدر (الجزائرية)، "مختبر أرغون الوطني". وجمعت البيانات ساكسس على بيمليني العرافات في تقدم الضوء المصدر (ALS)، "مختبر لورنس بيركلي الوطني". ونود أن نشكر الموظفين في بيامليني العرافات لمساعدتهم بجمع بيانات الاستشعار عن بعد ومعالجة. ونحن ممتنون لبحوث قياس الطيف الكتلي الكتلة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (نيس) وفريق الدعم للحصول على مساعدة في تحديد حدود المجال البروتين. وأيد هذا العمل "لنا المعهد من البرنامج الصحي الوطني داخلية البحوث"؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (نيس) (ES103247 ضياء أن ر. أ. س.) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا، 146626 إلى M.C.P). استخدام لوكالة الأنباء الجزائرية يدعمه مكتب علوم الطاقة الأساسية تحت "رقم العقد" ومكتب العلوم ووزارة الطاقة الأمريكية ث-31-109-إنكلترا-38. وأيده الاستخدام من مصدر الضوء المتقدم (ALS) مدير مكتب العلوم بمكتب علوم الطاقة الأساسية، من "وزارة الطاقة الأميركية" تحت "رقم العقد" دي-AC02-05CH11231. دعم إضافي بيمليني "ساكسس العرافات" يأتي من "المعهد الوطني للصحة" مشروع مينوس (R01GM105404) والراقية الأجهزة منحة S10OD018483. ونود أيضا أن أشكر القمر أندريا والدكتور أندريس سارة قراءة نقدية لهذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية، 131 قضية، البلورات بالأشعة السينية، ساكسس، أساليب الهجين، وتنقية البروتين، WD40 المجال، بروتيوليسيس محدودة، والجمعية الريبوسوم
الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من <em>سيريفيسيا س.</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter