Summary
このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1 の精製をについて説明し、他のタンパク質のハイブリッド構造解析の適用両方を含む注文し、無秩序なドメイン。
Abstract
リボソーム アセンブリ因子 Nsa1酵母 (出芽酵母)からのフルレングスの構造の決定は、乱れたため挑戦とプロテアーゼ活性タンパク質の C 末端。本稿では、x 線回折・小角 x 線散乱による構造解析出芽酵母から遺伝子組換え Nsa1 を浄化する方法について説明します。Nsa1 のよく整理された N 末端 WD40 ドメインの構造を解決するために x 線結晶解析を用いて、小角 x 線散乱ソリューションの Nsa1 の C 末端の構造を解決する使用だった。散乱データのソリューションは、ソリューションでフルレングスの Nsa1 から採取しました。WD40 ドメインの高分解能結晶構造から算出した理論の散乱振幅と剛体と第一原理計算モデリングの組み合わせが Nsa1 の C 末端を明らかにし。このハイブリッド アプローチを通じて、全体蛋白質の第四紀構造が再建されました。紹介した方法は、他の蛋白質の構造化および非構造化ドメインのミックスの作曲のハイブリッド構造決定の一般的に適用される必要があります。
Introduction
リボソームは、mRNA にすべての生きている細胞の蛋白質翻訳の重要な役割を果す大きいリボ核蛋白質マシンです。リボソームはリボソーム生合成1,2,3,4と呼ばれる複雑なプロセスで作り出される 2 つのサブユニットで構成されます。真核生物のリボソームの組み立ては不可欠なリボソーム アセンブリ要因2,3、5の何百もの援助に依存しています。Nsa1 (Nop7 には 1 が関連付けられている)、リボソーム大サブユニット6, の生産のために特に必要がある真核生物のリボソーム アセンブリ要因であり、WD リピートとして知られているを含む 74 (WDR74) より高い有機体7で。マウス8で胚盤胞の形成のため必要となる WDR74 が示されているし、WDR74 プロモーターよく癌細胞9で変異します。ただし、関数とリボソームの組み立ての Nsa1/WDR74 の正確なメカニズムはまだ主として知られています。まず真核生物のリボソーム成熟中に Nsa1/WDR74 の役割を明らかにするため、x 線回折・小角 x 線散乱法 (SAXS)10をなど複数の構造解析は実行されました。
X 線結晶構造解析や核磁気共鳴 (NMR) 分光法、電子顕微鏡、小角 x 線散乱は、高分子の構造を勉強してすべての重要な手法です。サイズ、形状、可用性、および安定性に適した特定の高分子が最高になる構造生物学方式高分子の影響を受けて、しかしいわゆる「ハイブリッド」アプローチを通じて複数のテクニックを組み合わせることになっている、ますます有益なツール11。特に x 線回折・小角 x 線散乱は、高分子12の構造決定のための強力かつ相補的な方法です。
結晶学小分子から、リボソームなど大規模な細胞機械装置に至るまで高解像度の原子構造を提供し、蛋白質等の生体機能の理解に多くの進歩をもたらした高分子13。さらに、構造ベース創薬の発見と開発の14に重要なディメンションを追加する計算の方法によって分子ドッキングの結晶構造のパワーを活用します。柔軟で乱れたシステムにもかかわらず、広範な応用結晶学結晶の充填が妨害されたり、電子密度マップを完了できない場合がありますので、質の悪いを評価するために挑戦しています。逆に、小角 x 線散乱、ソリューション ベースと低解像度構造アプローチ天然変性タンパク質12,,1516乱れたループ テルミニからまで柔軟なシステムを記述することが可能です。粒子サイズ12の広い範囲と互換性がある考慮した、小角 x 線散乱は結晶構造の研究で対処することができます生物の質問の範囲を拡大すると相乗的に働くことができます。
続いて、機能ですが柔軟な C 末端は x 線結晶構造解析法に従う well-structured WD40 ドメインが含まれているために、Nsa1 はハイブリッド構造的アプローチに適しています。次に、クローニング、表現、およびハイブリッド x 線結晶構造解析により構造決定の出芽酵母Nsa1 ・小角 x 線散乱の浄化のためのプロトコル。このプロトコルは、秩序・無秩序領域の組み合わせで構成されていますが他の蛋白質の構造を勉強する合わせることができます。
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Protocol
1. 組換えタンパク質生産・精製 Nsa 1
- Nsa1 発現プラスミド設計とクローン作成
- 取得または出芽酵母ゲノム DNA を購入します。
- PCR 増幅 Nsa1 のターゲット シーケンス (Nsa1フロリダ、残基 1-463) と C 末端切り捨て Nsa1 (Nsa1ΔC、残基 1-434)酵母および融点の由来ゲノム DNA を使用して適切なプライマーと1-2 分の延長時間を約 60 ° C。次のプライマーを用いて Nsa1 を増幅します。
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC - N ターミナルを含むエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)式ベクトル pHMBP に Nsa1 を subclone 6 X ヒスチジンの札は続いてマルトース結合タンパク質 (MBP) と標準的なクローン技術17 を使用してタバコ Etch ウイルス (TEV) プロテアーゼ サイト.
- DNA の配列を使用して、Nsa1 のクローンが N 末端彼 MBP タグ付きフレームで作成されたことを確認します。
- Nsa1 蛋白質の表現
- エシェリヒア属大腸菌の適切な変換式 plasmid(s) 式ひずみ T7 プロモーター ベースのシステムで。100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレートに形質転換体をプレートし、37 ° C で一晩反転板を孵化させなさい
- 変換プレートから 100 μ g/mL アンピシリンと LB の 50 mL 培養に接種し、37 ° C で 200 rpm で振とうしながら一晩成長
- 一晩文化の ml の 15 ポンド、100 μ g/mL アンピシリンと Fernbach のフラスコでの 3 x 1000 mL を接種し、37 ° C で 200 rpm で振とうしながら成長
注意: 蛋白質構造ソリューションの selenomethionyl (SeMet) 設立可能である LB 媒体ではなく、誘導前にメチオニンの産生を抑制する SeMet とアミノ酸の混合物を添加した M9 最小媒体に成長している細胞18。 - 最終濃度 1 mM 200 rpm で振とうしながら一晩 25 ° c での Nsa1 の発現外径600イソプロピル β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) の添加により ~0.8 に達するとを誘発します。
- 4 ° c 5,050 × g で 15 分遠心分離によって細胞を収穫します。
注: セルが-80 ° C で長期保管されてまたは蛋白質の浄化のため、すぐに使用します。
- Nsa1 蛋白質の浄化
- 1 EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤タブレットを含む 4 ° C であらかじめ冷やして換散バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、10% グリセロール、10 mM MgCl2) の 25 の mL の細胞を再懸濁します。
- 4 ° C で超音波処理によって細胞を溶解 (時間 7 分、2 秒サイクルで、2 サイクル オフ s; 振幅: 70%)。
- 4 ° C で 45 分間 26,900 × g で遠心分離によってライセートを明確します。
- 重力流列固定化コバルトの親和性の樹脂の 10 mL を搭載するライセートを明らかにした、事前の換散バッファーで平衡を適用します。
- 4 ° C で重力流による樹脂経由で渡すし、100 mL の溶解バッファーで 2 回樹脂を洗浄する上清を許可します。
- 20 mL の溶出バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、500 mM の NaCl、5 mM MgCl2, 5% のグリセロールと 200 mM のイミダゾール) と Nsa1 を溶出します。
- 15 μ L の溶出液を取るし、親和性の樹脂 (図 1 a) からタンパク質を溶出することを確認する 4 〜 15 %sds ページのゲルの実行します。
- TEV プロテアーゼ消化によって MBP タグを削除します。Nsa1 親和性樹脂溶出に TEV プロテアーゼ19 (1 mg/mL 在庫) の 1 つの mL を追加し、一晩それを, 4 ° C で。
- 集中 MBP 切断する Nsa1 〜 5 mL 遠心フィルターを用いた分子量 10 kDa の切断します。
- MBP 切断 Nsa1 を適用ゲルろ過カラムを事前平衡バッファー内 (20 mM トリス塩酸 pH 7.5、100 mM の NaCl、1 mM MgCl2, 5% のグリセロールと 1 mM β-メルカプトエタノール) (図 1 b)。
- 列 MBP が切断、4-15 %sds ページのゲル (図 1 b) の 15 μ L のサンプルを実行して、Nsa1 から区切られたことを確認するゲル濾過分画を分析します。
- Nsa1 を含有する画分を組み合わせるし、8 mg/mL 遠心フィルターを用いた分子量 10 kDa の切断に集中。
- 280 で吸光度を測定することによりタンパク質の濃度を決定する絶滅係数 42530 M-1cm-1を使用して分光光度計の nm。タンパク質のスクリーニングと結晶化試験のためすぐにタンパク質を使用します。
2. 結晶化と Nsa 1 のタンパク質のスクリーニング
- Nsa1 の疎行列の結晶のスクリーニング
- 遠心分離機の 10 分の 4 ° C で 16,000 x g で Nsa1 の 8 mg/mL 在庫の 500 μ L。
- 結晶化ロボットとスパース マトリックス液晶画面を使用して結晶化試験をセットアップします。疎行列結晶化画面から個々 の水晶画面試薬 30 μ l、96 もトレイのリザーバーします。250 を混合することによってロボットと座っている滴をセットアップ 250 にもソリューションの nL nL 蛋白質の解決の。
- テープで結晶化プレートを封印し、25 ° C でそれらを孵化させなさい
- 検査プレート顕微鏡と最初の 2-3 週間毎の 2 日間。
- 潜在的な結晶のヒットには、UV 顕微鏡による蛋白質が含まれてを確認します。
注: Nsa1 2 つの異なる結晶形の (立方体、斜方晶、図 2 a) 次の画面から 1 週間以内が得られた: JCSG + 条件 B11 (1.6 M クエン酸ナトリウム第三脱水、pH 6.5) とウィザード沈殿相乗効果画面ブロック 2C11 の条件 (20.1%(v/v) PEG 1500、13.4%(v/v) ペグ 400、0.1 M 水酸化ナトリウム/トリス HEPES、pH 7.5)。
- タンパク質のスクリーニング
注: 結晶化の最適化中に発見された Nsa1 の斜方晶系結晶蛋白質分解開裂の結果として生じた、実物大の蛋白質を使用して結晶を複製できませんでした。限られた分解質量分析法と結合の組み合わせを使用して、それと判断した Nsa1 の C 末端は分解に敏感だった C ターミナル尾の除去の斜方晶系結晶フォーム (その後の再生に必要ですNsa1ΔC)。- 1 mg/mL の次のプロテアーゼ α-キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、パパイン、サブチリシン、および endoproteinase Glu C. プロテアーゼ溶液を準備します。
- 希釈バッファー (10 mM HEPES、pH 7.5、500 mM 塩化ナトリウム) 1 mg/mL プロテアーゼ銘柄ごとの 1: 1000 希釈、1: 100、1:10 を作成します。
- 蛋白質 (1 mg/mL) に上映されると各プロテアーゼの 9 μ 因数にプロテアーゼ株式 (1:10、1: 100、1: 1000) 1 μ L をピペットします。
- 1 h の 37 ° C でソリューションを孵化させなさい。
- 2 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 10 μ L の追加によって反作用を停止し、5 分 95 ° C で反応を熱します。
- 4-15 %sds ページのゲル (図 2 b) で実行することによって、ダイジェストを分析します。
- ゲルの質量分析によって標的タンパク質のプロテアーゼ抵抗力があるドメインを識別します。
- 切り捨てられた式の構成を作成し、次の上記のクローニング、表現、および浄化のプロトコルは、ターゲット蛋白質からプロテアーゼ不安定領域を削除します。
- 結晶化の最適化
- 準備または次の初期結晶化試薬の溶液を取得: 1.6 M クエン酸ナトリウム第三脱水 pH 7.5、1 M HEPES/ナトリウム水酸化 50%(v/v) ペグ 1500 100%(v/v) ペグ 400 pH 6.5。
- Nsa1 のストック溶液を調製 8 mg/mL 上記のようにフロリダNsa1 のΔC 。
- Nsa1 立方晶結晶の最適化 (Nsa1フロリダ)。
- PH 6.5 1.6 M ナトリウムクエン酸塩第三の原液から 6.5 pH に及ぼすクエン酸ナトリウムの 1 1.6 M の勾配で 500 μ L を含む井戸で 24 ウェル グリッド画面を準備します。
- ミックス 1 μ L 蛋白質の 1 μ もソリューションとシリコーン カバー スライド上に混合物を置く。慎重に反転、油を塗った上にカバー スライドもしてそれはよく密封、ないドロップを妨げるか、またはカバー スライドを破るように注意します。トレイがいっぱいなるまで、この手順を繰り返し、25 ° C で保存
注: 小さい立方水晶は 2-7 日に表示されます。 - 立方晶の結晶の microseed ストックを準備します。マウントされたナイロン ループを使用して、小さなビーズと 1.6 M クエン酸ナトリウム第三ウィット pH 6.5 の 50 μ L を含む 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 10 〜 小さな立方結晶を転送します。
- 渦高速で 1.5 mL マイクロ遠心チューブ (〜 3000 rpm) 1 分。
- 1.6 M ナトリウムクエン酸塩第三と渦種子在庫の 10 倍のシリアル希薄のシリーズ 5 を徹底的に混合物をする s。
- 塗りつぶしは各 24 ウェル グリッドの画面 1.6 M クエン酸ナトリウム第三 pH 6.5 の 500 μ L。
- (図 3 a) 種子在庫ソリューションが付いている蛋白質の様々 な比率と滴を設定して microseeding 条件を最適化します。回折の高品質の大きな立方結晶は 2-5 日間 (図 3) に表示されます。
- 斜方晶結晶の最適化 (Nsa1ΔC)
- 50%(v/v) ペグ 1500 と 100%(v/v) ペグ 400 の原液から 24 条件が異なる (図 3 b) の各ウェルで 500 μ L でグリッド画面を準備します。1500 のペグとペグの 400 のグラデーションに加え各も含める必要があります 0.1 M HEPES/ナトリウム水酸化 pH 7.5。
- シリコーン カバー スライドにもソリューションの 1 μ L でのタンパク質溶液 1 μ L をミックスします。慎重に反転、油を塗った上にカバー スライドもしてそれはよく密封されます。全体のトレイが充填されているまで、このプロセスを繰り返します。25 ° C でトレイに格納します。
注: Nsa1 斜方晶結晶は 2-7 日に表示されます。 - 立方結晶 (ステップ 2.3.3.3 に 2.3.3.7) のとおり microseeding による斜方晶結晶をさらに最適化もソリューションとして 0.1 M HEPES/ナトリウム水酸化 pH 7.5、13.4%(v/v) ペグ 400 20.1%(v/v) ペグ 1500 500 μ L を使用します。
注: Nsa1 SeMet 結晶はネイティブ結晶に類似して最適化する必要があります。
3. x 線回折データ収集と Nsa 1 構造ソリューション
- 結晶の x 線回折データ収集低温保護
- 斜方晶系の結晶 (Nsa1ΔC)、22.5%(v/v) ペグ 1500、15%(v/v) ペグ 400 0.1 M HEPES/ナトリウム水酸化 pH 7.5 を含む 1 mL 各種凍害保護ソリューションを準備します。
- 液体窒素で泡デュワーを記入し、あらかじめクリスタル パックを冷たい。液体窒素を使用する場合注意を払い、保護手袋とゴーグルを着用します。
- 慎重にも顕微鏡のステージ上に結晶を含む結晶のカバー スライドを反転します。
- 新しいカバー スライドに各種凍害保護液 2 μ L をピペットします。
- 低温磁気杖に結晶の適切なサイズのマウントされたナイロン ループを取り付けます。
- 個人差の援助を使用すると、すばやくマウントされているクライオ ループ各種凍害保護ソリューションに結晶を転送します。
- 各種凍害保護ソリューションで 5 分間平衡結晶ができます。
- 各種凍害保護ソリューションとプランジ凍結から結晶を輪にして液体窒素、顕微鏡の助けを使用すると、すぐに。
- 液体窒素沸騰を停止するループを待って、クリスタル パック内の特定の位置に杖からループをリリースします。
- 立方 Nsa1フロリダの結晶が cryoprotected をする必要はありません、直接フラッシュを固定できる (次の手順 3.1.8-3.1.9 上記)。
- クライオ ツールを使用してクリスタル パックをシールし、事前冷却デュワーの送料杖に転送します。データ収集までのいたずら小僧/デュアーの結晶を格納します。
- シンクロトロンでデータを収集する場合は、乾燥荷送人を用いた放射光結晶を出荷します。
- 次の標準的な技術20x 線回折データを収集します。
注: Nsa1 ネイティブと SAD の (単一波長異常分散) データセットを収集した 100 K で 22 ID および 22-BM アルゴンヌ国立研究所 (シカゴ、IL) 高度な光子源の SER 猫梁行。悲しい Nsa1 データセットは λ で収集された 0.97911 Å を =。1 秒の露出時間と 0.5 ° 振動を使用してデータが記録されました。これらの結晶の非常だった通常 0.3 ° のまわりであります。 - 処理し、適切なスペース グループの各データ セットに対して反射ファイルを生成する x 線回折像をスケールします。
注: Nsa1 回折データセットは HKL200021で処理しました。Nsa1 立方晶結晶がスペース グループ P213 で処理され、斜方晶の結晶がスペース グループ P212121で処理されました。
- Nsa1 構造のソリューションです。
注: 解決し、不死鳥と CCP422,23を含む結晶構造を調整する使用ことができますいくつかの結晶構造解析ソフトウェア パッケージがあります。次は、フェニックス ソフトウェア スイート22を使用して Nsa1 の構造解析のプロトコルです。- 分析ネイティブと SAD スケール phenix.xtriage22データセット。
- 悲しいピーク反射ファイル22,24を使用する Phenix.autosol と Nsa1 の構造を解決します。セレノメチオニン サイトの数を入力するには AutoSol のプログラムを実行すると、(サイト = 9)、Nsa1ΔCと悲しいデータ コレクションに使用する波長の fasta シーケンス ファイル (λ = 0.97911 Å)。
注: Nsa1 悲しいデータセットから phenix.autosol が実験のフェーズを決定し、ほとんどのモデルを構築することでする必要があります。 - オオバン25、phenix.refine22,26の微細化が続くとモデルを手動調整します。
- 分子置換フェイザー27,28を使用して高解像度のネイティブの斜方晶系結晶の立方晶系の結晶構造を解決します。
- 成功した構造ソリューション後検査モデルと電子密度オオバン25の地図。
- 構築し、phenix.refine22,26とオオバン25の建物モデルのリファインの反復的なラウンドを実行することによって、構造を改良します。
4. 小角 x 線散乱データの収集、処理、およびモデリング
- 小角 x 線散乱データ コレクション
注: 小角 x 線散乱データを記録したフルレングス酵母高度な光源は、高スループットの SIBYLS ビームライン ローレンス バークレー国立研究所、バークレー、カリフォルニア州2912.3.1 上で Nsa1。- 浄化 Nsa1FL上で説明したプロトコルに従います。Nsa1 の出荷前に 24 h ビームライン、ゲルろ過カラムよりタンパク質を実行するフロリダ済みバッファー A. の平衡
- Nsa1 を含有する画分をプール、前述のようにタンパク質の濃度を決定します。
- 6.2 mg/ml バッファー A. を使用して 1 から Nsa1 の濃度のシリーズの 30 μ 因数を準備します。
- Nsa1 の一連の各濃度の 20 μ l をバッファー A 単独でコントロールと共にクリア完全スカート 96 よくマイクロ プレートに転送します。
注: 小角 x 線散乱データ集計、粒子間の斥力、放射線被害の影響を避けるためにいくつかの濃度精製サンプルを使用して希薄溶液に収集されます。 - マットやビームライン 4 ° C で一晩出荷シール シリコーン マイクロ プレートをシールします。
- データ収集まで 4 ° C でマイクロ プレートを格納します。
- データ収集の前にすぐに潜在的な集計を削除し、気泡の 4 ° C で 10 分間 3200 x g でプレートをスピンします。
- 小角 x 線散乱データを記録します。
注: Nsa1 の小角 x 線散乱データ記録されたバッファーの各一連のタンパク質濃度の前後に。0.3 s は Nsa1 で収集された 30 3 連続スキャンFL 10 の ° C の (1 に 6.2 mg/mL) 一連の濃度の上 - 小角 x 線散乱データのバッファーの減算を実行します。
注: Nsa1 のバッファー減算はビームラインで自動的に行われたが、散布30など ATSAS スイート31データ削減ソフトウェアを使用して、バッファーの減算を実行できます。バッファー減算は小角 x 線散乱データ分析の重要な部分、減算に使用されるバッファーが蛋白質のサンプルバッファーと同じであることを確認する注意する必要があります。 - 平均 33 の連続した各濃度の *ave.dat ファイルを作成するスキャンします。
メモ: オーバーレイ曲線を比較する 33 の連続したフレームです。時間をかけて散乱曲線への変更は頻繁に放射線障害を示すです。平均からこれらのフレームを除外します。Nsa1 連続スキャンの平均はだった SIBYLS ビームラインでは自動的に実行されます。
- 小角 x 線散乱データ処理と一連の濃度の比較
注意: SAXS データを分析するために使用できるいくつかのソフトウェア パッケージがあります。Nsa1 の旋回と対距離分布関数の半径を求めたプリムス32と Gnom33 ATSAS 2.7.2 からを使用してスイート31と放射がないことを確認するすべてのタンパク質濃度の比較損傷または濃度依存性粒子間相互作用10。- ターミナル シェルを開き、小角 x 線散乱データを含むディレクトリに移動します。
- プリムス32から GUI ターミナルのシェル内でを起動します。
- プリムス GUI 内で散乱曲線を読み込む (* ave.dat)。
- 旋回半径 (Rg) を判断して各散乱曲線の散乱強度 I(0)、AutoRgを使用 (* ave.dat)。
- Kratky 散乱曲線のプロットを生成 (* ave.dat)、小型化の程度を評価します。
- AutoGNOM33を使用して対分布関数を計算する (各散乱曲線の P(r)) とも呼ばれます (* ave.dat)。入力開始 Dmax ≈ 3 * Rgや滑らかな P(r) 曲線を取得する D の最大価値の最適化します。D最大の最適化中に、関数が報告されている χ2値をチェックし、散乱曲線にフィットさせる全体を視覚的に評価する実験的散乱曲線と一致して計算される P(r) ことを確認します。
- 相関34のボリュームを使用して散乱曲線から Nsa1 の分子量を計算します。
- 放射線損傷または濃度依存性効果がないことを確認する各濃度の構造パラメーターを比較します。
注: 濃度の影響は、増加の Rgおよび D最大増加タンパク質濃度との関係としてマニフェストができます。前方 I(0) サンプル濃度で割った値を散乱する必要がありますも間で一定してタンパク質濃度シリーズ。
- 小角散乱によるモデリング
注: Nsa1 の C 末端の位置を決定するには、フロリダ、Nsa1 結晶構造10 (PDB 5SUM)、小角散乱曲線に使用されたリジッド ボディと第一原理計算プログラムの束を使用して、モデリングの組み合わせを実施35と ATSAS ソフトウェア スイート31からアンサンブルの最適化方法 (EOM)36 。Nsa1 の WD40 ドメインは、WD40 ドメインからいくつかの乱れたループと Nsa1 の C 末端が実験の小角 x 線散乱データに合うようにモデル化された一方、剛体として扱われました。- 入力の PDB ファイルを生成します。残基の主鎖から不足していると PDB ファイルことはできませんマルチコンフォメーション、リガンドを含むまたは水分子のたびに、PDB ファイルを分割する必要があります。
- Pre_BUNCH35束 (pre_bunch.pdb) の入力の PDB ファイルを準備するプログラムを実行します。ターゲット蛋白質 (*.seq) のドメイン/Pdb、4.3.1 で生成された数のシーケンスを入力し、上記で生成された PDB ファイルの個々 のそれぞれ。
- プログラム CRYSOL37を使用して個々 の PDB ファイルの散乱振幅を計算します。CRYSOL を実行するには、個々 の PDB ファイルと実験の小角散乱曲線 (*.dat) を入力します。これは、振幅ファイルが生成されます (* .alm)。
- 結合された堅いボディと第一原理構造アプローチを使用して小角 x 線散乱データに対する Nsa1 の WD40 ドメインをモデル化するプログラムの束35を実行します。Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb) から PDB ファイル、実験の小角散乱曲線 (*.dat) および個々 の振幅を入力 (* .alm) CRYSOL によって生成された各部分の PDB ファイルのファイル。
- それと実験の小角 x 線散乱データを用いた束によって生成された経験的モデルから開始 pdb ファイル (5SUM) から χ2値を比較します。
注: 成功した束モデル開始モデルよりも有意に低い χ2値が必要です。束モデルの理論的な散乱に関する説明も含めますよく実験データ束モデルを小角 x 線散乱データの理論的散乱と χ2値 (図 4オーバーレイの目視による判断センター パイプライン)。 - 手動で束と小角散乱によるエンベロープ (図 4、センター パイプライン) によって生成されたモデルと結晶構造をオーバーレイするソフトフェア38束から出力ファイルを調べます。
- 10-20 倍の束を再実行モデルが類似していることを確認する独立したモデルを生成します。
注: Nsa1 の 20 の独立した実行から 3 〜 1 から χ2値の範囲があった。 - アンサンブル モデリング
注: として束 EOM36または最小限のアンサンブル検索39 (MES) のいずれかを実行する省略可能なアプローチ。EOM と MES マルチコンフォメーション、柔軟なドメイン ・地域が付いている蛋白質に適していますアンサンブルのアプローチを使用します。- EOM36 ATSAS オンライン サーバーを使用してプログラムを実行します。EOM を実行するには、入力の 4.3.1、標的タンパク質 (*.seq)、および実験の小角 x 線散乱データ (*.dat) のシーケンスから PDB ファイルを実行します。
- EOM 実験 SAXS データを使用してによって生成されたアンサンブルからそれと開始 pdb ファイル (5SUM) から χ2値を比較します。
注: 正常な EOM アンサンブル開始モデルよりも有意に低い χ2値が必要です。アンサンブルの理論の散乱に関する説明も含めますよく実験データ オーバーレイ小角 x 線散乱データにアンサンブルの理論の散乱と χ2値 (図 4右の間の目視による判断パイプライン)。1 つはまた束と EOM 最高モデル説明実験の小角 x 線散乱データを決定するための χ2値を比較する必要があります。 - EOM (図 4) によって生成された conformers の結晶構造をオーバーレイするソフトフェア38 EOM コンフォーマを手動で検査します。散乱曲線に貢献する各リガンドの conformers の総数と入居率に注意してください。Nsa1 などのより堅い分子 conformers の数小さいする必要があります (1-5) (図 4、右パイプライン)36。
- EOM を再実行一貫性のある結果を確保するために数回。
注: Nsa1 conformers の数だった通常 3 に 4 の χ2値が 0.1 から 0.3 までと
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Representative Results
Nsa1 は、出芽酵母ゲノム DNA の増幅と subcloned MBP と TEV プロテアーゼ サイト続いて N ターミナル 6 x ヒスチジン親和性タグを含むベクトルに PCR をだった。Nsa1 は大腸菌BL21(DE3) 細胞に変換され、IPTG 誘導および 25 ° c 一晩 (図 1 a) 成長タンパク質発現の高収率が得られました。Nsa1 は、固定化コバルト親和性樹脂、TEV プロテアーゼと MBP の開裂によって続いて、サイズ排除クロマトグラフィー (図 1 b) 最終的に解決のアフィニ ティー精製をだった。Nsa1 を含むサイズ排除クロマトグラフィーから分数をプール、8 mg/mL に濃縮し、結晶化ロボットによる結晶化試験に使用されます。初期のスパース マトリックス液晶画面 (図 2 a) Nsa1、立方晶と斜方晶系の 2 つの異なる結晶形が得られました。
立方体、斜方晶結晶の最適化中に斜方晶の結晶が Nsa1 の蛋白質分解開裂の結果として起こったことが発見されました。限られた分解質量分析法とは、タンパク質分解に敏感だった Nsa1 の領域を決定するため使用され、Nsa1 プロテアーゼ エラスターゼ (図 2 b) の濃度勾配に敏感であったことが観察されました。その後質量分析は、この劣化が Nsa1 の C 末端の損失に起因するを確認しました。蛋白分解敏感な C 末端 (図 2) を削除する、一連の Nsa1 の C 末端切り捨てが生成されました。斜方晶系の結晶で最終的に悲しい構造を決定するために使用された Nsa1 のΔC (残基 1-434) 切り捨てで繰り返される可能性があります。斜方晶系の結晶で Nsa1 を扱うことによって繰り返される可能性も透明なクリスタル トレーを設定する前に 4 ° C で 1 時間のエラスターゼのフロリダ。
立方晶 Nsa1 結晶は Nsa1 を使用して最適化されたフロリダクエン酸ナトリウム勾配の組み合わせと相まって microseeding (図 3 a)。これは Å の解像度 (図 3、左) 約 2.8 の回折限界と大規模な再現可能な立方晶結晶をもたらした。斜方晶系の結晶は 1500 のペグとペグ 400、microseeding は、約 1.25 の回折限界と大きな結晶が得られたと組み合わせての濃度勾配を変化させることにより、Nsa1 の C 末端切り捨てバリアントを使用して最適化すること Å解像度 (図 3 a C)。Nsa1 の実験的段階は Nsa1ΔC10SeMet 誘導体から SeMet 悲しい定められました。
Nsa1 の N 末端 7 枚羽の β プロペラ WD40 ドメインは、しかし、両方の構造体は、Nsa1 の C 末端の電子密度を欠いても立方体と斜方晶系の結晶構造で解決されました。小角 x 線散乱ソリューションで Nsa1 の C 末端ドメインの位置を決定する使用されました。データ コレクションのサンプル濃度の最適化後、部分的な原子構造は剛体モデルを実行し、不足しているコンポーネントの第一原理計算の復興を生成に使用されました。モデルの実験データ (図 4、センター パイプライン) 計算される散乱曲線の適合度の観点から評価しました。結晶構造 PDB ID 5SUM から生成された理論の散乱曲線と実験的散乱曲線間の不一致によって証明されるよう WD40 ドメイン単独で Nsa1 の実験の小角 x 線散乱データの良いフィットではない (図 4、左パイプライン)。リジッド ボディのモデリングだけでなくアンサンブル モデリングも行われていた。これは Nsa1 の 3 に 4 conformers のアンサンブルを生産し、低い χ2値 (図 4、右パイプライン) で起因しました。アンサンブル モデリングを使用してモデルの不一致 (χ2) の削減ソリューションで Nsa1 C ターミナル尾の構造サンプリングを明らかにしました。
図 1。発現と精製 Nsa1 6 X 彼 MBP 融合タグと。(A) SDS-PAGE BL21 の蛋白質の表現の分析 (DE3) は 25 ° C でセル一晩とコバルトの親和性の樹脂を使用して最初の精製ステップ。(B) 代表的なサイズ排除クロマト グラム TEV 胸の谷間に続きます。サイズ排除クロマトグラフィーから分数は、SDS-PAGE によって分析されました。ピーク 1 含む Nsa1 が収集され、構造解析の使用からの分数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。Nsa1 の C 末端は分解しやすい。(Nsa1 の結晶化 A) 初期試験は 2 つの異なる結晶形をもたらした: 立方晶と斜方晶。UV 顕微鏡を用い、結晶にタンパク質が含まれていることを確認してください。Vi: 可視光、紫外線: UV 顕微鏡。スケール バー各ウィンドウで 50 μ m を =。(B) タンパク質スクリーニング SDS-PAGE によって分析します。タンパク質 (1 mg/mL) に上映されるとの因数でプロテアーゼ銘柄 (0.1、0.01、0.001 mg/mL) ごとの 3 つの希薄 (1:10、1: 100、1: 1000) に結合されました。プロテアーゼ抵抗性ドメインを分析した、SDS ページと 60 分 Nsa1-フロリダ州の 37 ° C の孵化後の質量分析法で: 新鮮な精製タンパク質、Nsa1Δ: 蛋白質蛋白質の劣化した形の観察後、3 週間のための 4 ° C で保存を精製します。(C) 回路図図 Nsa1 フルレングス (上) および C 末端切り捨て (下) を構築します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。Nsa1 結晶化最適化します。(A) の種子の在庫だった初期の小さな結晶から作製した、希釈系列を作成するために使用 (1 x ~ 1/104x) (microseeding)。希薄化後のシード株式の 1 μ L で蛋白質の 1 μ L を混合することによって大きな単結晶成長 1 週間以内。(B) 沈殿濃度勾配の斜方晶系結晶の最適化。(C) データの収集に使用される立方体と斜方晶系の結晶を最適化されています。緑の円は、クリスタル トレー品質結晶データ収集をもたらした典型的な位置を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。Nsa1 SAXS 測定の模式図。小角 x 線散乱データを処理し、束 (センター) と EOM (右) モデルを生成するために使用するパイプラインの概要。左のパイプラインは実験的散乱曲線間の不一致を示しています (赤丸、蛋白濃度: 6 mg/mL) 結晶構造 PDB ID 5SUM から生成された理論の散乱曲線 (青線) と。モデルは実験の小角散乱曲線を比較することによって評価した (赤丸、蛋白濃度: 6 mg/mL) Nsa1 の束モデルから派生した散乱曲線 (黒線) または Nsa1 の EOM コンフォーマ (黒線)。各モデルでは、WD40 ドメインは、個々 の EOM conformers の束とグリーン、マゼンタ、シアン、イエローの色の赤で球に柔軟な C 末端を示す緑 (PDB ID 5SUM) で漫画に表示されます。EOM から派生した各リガンドの割合は、モデルの隣に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルを使用すると、酵母から組換え Nsa1 は、x 線回折・小角 x 線散乱による構造研究に対して生成されました。Nsa1 は、ソリューションの行儀と複数の結晶形に結晶化されました。これらの結晶の最適化、中に Nsa1 の C 末端がプロテアーゼ分解に敏感であったことが発見されました。高解像度 Nsa1 の柔軟な C 末端が結晶の充填を妨げるために、斜方晶系の結晶形を Nsa1、可能性の C 末端切り捨てのバリエーションに複製のみでした。Nsa1 の構造の高分解能 x 線結晶学によって解決されたが、それが順序付けされていないので、C 末端をいずれかの結晶形の構築できませんでした。しかし結晶学はいくつかの制限を持って任意のメソッドと同様、結晶構造解析、Nsa1 のサイズは約高分子の原子分解能の構造を決定するためプレミア手法です。結晶学の主要な制限の 1 つは蛋白質40,41の無秩序領域を解決することができないことです。
Nsa1 の C 末端はその構造10を勉強する必要性を強調し、蛋白質の適切な核小体局在にとって重要です。Nsa1 の C 末端は、小角 x 線散乱、x 線結晶構造解析に相補的な構造生物学手法によって解決されました。小角 x 線散乱データは、一連の濃度間でフルレングスの Nsa1 に対して記録されました。この濃度シリーズから Nsa1 小角 x 線散乱データの収集と処理の最適濃度を測定しました。小角 x 線散乱データ Nsa1 6、4.5、および 3.0 mg/mL で記録しました。Guinier 地域、P(r) 関数および分子量はあったサンプルが行儀とテスト実験条件下で集計しないことを確認する一連の濃度で決定されます。部分的な結晶の構造から決定される理論の散乱振幅 Nsa1 のフルレングスの構造を再構築して、第一原理計算の方法が柔軟な C 末端をモデルに使われました。このハイブリッド ・ アプローチにより、Nsa1 の柔軟な C 末端が順序付けられた WD40 ドメインから外側に延長すると判断されました。
処理ツールの進歩は、生体高分子の構造研究の小角 x 線散乱の人気を牽引してきた。小角散乱による分子固まり全体的な形状など、低解像度の構造情報を提供するためにソリューションのランダム配向のタンパク質から x 線の散乱パターンを測定します。その結果、小角 x 線散乱は結晶学のための強力な直交構造検証ツールとして浮上しています。これは主に原子構造の理論の散乱および実験小角 x 線散乱データ37と比較することを計算する計算方法の開発のためです。このアプローチ、構造状態、第四紀構造と結晶格子にみられる高次アセンブリを使用しては、溶液中の粒子の構造特性と比較できます。さらに、乱れたループと x 線結晶構造解析によって決定された高分解能の構造に欠けているテルミニ モデリングできますソリューション散乱データを用いたします。このハイブリッド構造方法結晶構造がビルディング ブロックとして不足している残基の小角散乱によるガイド付きのモデリングに使用、インフルエンザ ウイルスの M1 など他の高分子と同様、Nsa110、C 末端をマッピングに有効であることを証明してマトリックス蛋白質42DEAD ボックス RNA そして43のシャペロンとして働きます。小角 x 線散乱を用いた高度なモデリング ソフトウェアも一緒に全体的な散乱に寄与する conformers のシリーズを使ったこれらのシステムの立体配座の風景をマッピングすることにより天然変性タンパク質などのより複雑なシステムに対応します。ソリューション16,39で粒子の可能性があります。小角 x 線散乱データの収集と処理ツールで撮影一緒に、最近の進歩は、ハイブリッド構造生物学手法による挑戦的な生物学的システムに取り組むための成功に貢献します。
高分解能構造を持つ溶液散乱の組み合わせは柔軟性および高分子44のダイナミクスに関する重要な質問にお答えする構えです。Nsa1 など、多くの蛋白質がある動的領域生物機能にとって重要であります。この原稿のテンプレート プロトコルによって提供されます小角 x 線散乱の高分解能構造の決定との組み合わせの詳細を x 線結晶構造解析。X 線結晶構造解析 SAXS はお世辞に NMR を含む他の構造生物学の手法も使用できます、に加えて電子常磁性共鳴 (EPR) と蛍光共鳴エネルギー (フレット) を転送、それ以上の小角 x 線散乱の重要性を強調として相補的構造生物学手法45,46,47。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
回折データは、東南地域共同アクセス (SER 猫) チーム 22 ID および 22 BM ビームラインの高度な光子ソース (AP)、アルゴンヌ国立研究所で収集されました。SIBYLS ビームライン事前光ソース (ALS)、ローレンス ・ バークレー国立研究所での小角 x 線散乱データを収集しました。リモート データの収集と処理の SIBYLS ビームラインでのスタッフに感謝したいと思います。タンパク質ドメインの境界を決定する助けのための環境健康科学の国立研究所 (NIEHS) 質量分析法による研究およびサポート グループに感謝しております。この作品によって、米国国立研究所の健康学内研究プログラムをサポートされていました米国立環境健康科学 (NIEHS) 研究所 (r. e. s. に ZIA ES103247) とカナダ保健研究 (機構、M.C.P に 146626) 機構。AP の使用は、米国エネルギー省、科学局、契約番号の下で基本的なエネルギー科学のオフィスによって支えられました。W-31-109-Eng-38。高度な照明のソース (ALS) の使用はディレクター、科学局、事務所のエネルギーの基礎科学、契約番号の下で米国エネルギー省によって支えられました。デ-AC02-05CH11231。追加サポート SIBYLS 小角 x 線散乱ビームラインは、国立衛生研究所からなるプロジェクト ミノス (R01GM105404) とハイエンド計装グラント S10OD018483。我々 もこの原稿の彼らの重要な読書のアンドレア ・月と博士サラ アンドレスに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
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