Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56953
Automatic Translation
1, 1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Denne metoden beskriver kloning, uttrykk og rensing av rekombinant Nsa1 for strukturelle vilje av Røntgenkrystallografi og liten vinkel X-ray spredning (SAXS) og gjelder for hybrid strukturell analyse av andre proteiner som inneholder begge bestilte og uordnede domener.

Abstract

Fastsettelse av full lengde ribosom montering faktor Nsa1 fra Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) er utfordrende på grunn av den uordnede og protease labil C-terminus av protein. Dette manuskriptet beskriver metodene for å rense rekombinant Nsa1 fra S. cerevisiae for strukturell analyse av både Røntgenkrystallografi og SAXS. Røntgenkrystallografi ble benyttet for å løse strukturen i velordnet N-terminal WD40 domenet Nsa1, og deretter SAXS ble brukt til å løse strukturen i C-terminus av Nsa1 i løsningen. Løsning spredning data var samlet inn fra full lengde Nsa1 i løsningen. De teoretiske spredning amplituder ble beregnet fra den høyoppløselige krystallstruktur WD40 domenet, og deretter en kombinasjon av rigid kropp og ab initio modellering avslørt C-terminus av Nsa1. Gjennom denne hybrid rekonstruert kvartær strukturen av hele protein. Metodene presenteres her skal generelt gjelder for hybrid strukturelle fastsettelse av andre proteiner som består av en blanding av strukturert og ustrukturert domener.

Introduction

Ribosomes er store ribonucleoprotein maskiner som utfører den viktige rollen oversette mRNA til proteiner i alle levende celler. Ribosomer består av to underenheter som produseres i en kompleks prosess kalt ribosom, biogenesis,1,,2,,3,,4. Eukaryote ribosom montering avhengig ved hjelp av hundrevis av viktige ribosomal montering faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tilknyttet 1) er en eukaryote ribosom montering faktor som er spesielt nødvendig for produksjon av store ribosomal delenhet6, og er kjent som WD-gjenta inneholder 74 (WDR74) i høyere organismer7. WDR74 har vist seg å være nødvendig for blastocysten formasjonen i mus8og WDR74 selskapet er ofte mutert i kreft celler9. Funksjonen og presis mekanismer for Nsa1/WDR74 i ribosom samling er imidlertid fortsatt hovedsakelig ubekjent. For å begynne å avdekke rollen som Nsa1/WDR74 under eukaryote ribosom modning, ble flere strukturelle analyser utført, inkludert Røntgenkrystallografi og liten vinkel X-ray spredning (SAXS)10.

Røntgenkrystallografi, kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi, elektronmikroskop og SAXS er alle viktige teknikker for å studere macromolecular struktur. Størrelse, form, tilgjengelighet og stabilitet av makromolekyler påvirkninger metoden strukturell biologi som en bestemt Makromolekyl vil være best egnet, men kombinerer flere teknikker gjennom en såkalt "hybrid" tilnærming blir en stadig verktøy11. Spesielt er Røntgenkrystallografi og SAXS kraftig og utfyllende metoder for strukturelle besluttsomhet makromolekyler12.

Krystallografi gir høy oppløsning atomic strukturer spenner fra små molekyler til store cellulære maskiner som ribosomet, og har ført til mange gjennombrudd i forståelsen av biologiske funksjoner av proteiner og andre makromolekyler13. Videre utnytter strukturen-baserte narkotika design kraften i crystal strukturer for molekylær dokking ved beregningsorientert metoder, legge en kritisk dimensjon til narkotika og utvikling14. Til tross for anvendelse sin brede er fleksible og uordnede systemer utfordrende å vurdere krystallografi siden krystall pakking kan bli hindret eller electron tetthet kart kan være ufullstendig eller av dårlig kvalitet. Derimot er SAXS en løsning-baserte og lav strukturelle tilnærming kan beskrive fleksibel systemer spenner fra uordnede looper og termini egentlig uordnede proteiner12,15,16. Vurderer den er kompatibel med et bredt spekter av partikkel størrelser12, kan SAXS arbeide synergi med krystallografi å utvide utvalget av biologisk spørsmål som kan løses av strukturelle studier.

Nsa1 er egnet for en hybrid strukturelle tilnærming fordi den inneholder en velstrukturert WD40 domenet etterfulgt av en funksjonell, men fleksible C-terminus som ikke er mottakelig for Røntgenkrystallografi metoder. Følgende er en protokoll for kloning, uttrykk og rensing av S. cerevisiae Nsa1 for hybrid strukturelle vilje av Røntgenkrystallografi og SAXS. Denne protokollen kan tilpasses for å studere strukturer av andre proteiner som består av en kombinasjon av bestilte og uordnede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. rekombinant Protein produksjon og rensing av Nsa 1

  1. Nsa1 uttrykk plasmider Design og kloning
    1. Få eller kjøpe S. cerevisiae genomisk DNA.
    2. PCR forsterke målet sekvenser av Nsa1 (Nsa1FL, rester 1-463) og C-terminalen avkuttet Nsa1 (Nsa1ΔC, rester 1-434) med riktig primer bruker genomisk DNA isolert fra S. cerevisiae og en Smeltetemperaturen for ca 60 ° C med en utvidelse tid på 1-2 min. Følgende primerne ble brukt til å forsterke Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 i Escherichia coli (E. coli) uttrykk vektor pHMBP som inneholder en N-terminal 6 X-histidin kode etterfulgt av Maltose bindende Protein (MBP) og et tobakk Etch Virus (TEV) protease nettsted med standard kloning teknikk17 .
    4. Bruk DNA sekvensering for å bekrefte at Nsa1 ble klonet i rammen med N-terminal hans-MBP koden.
  2. Nsa1 Protein uttrykk
    1. Uttrykket plasmid(s) forvandle en egnet E. coli uttrykk stamme med et T7 promoter-basert system. Plate transformants på LB agar plater som inneholder 100 µg/mL ampicillin og Inkuber platen invertert natten på 37 ° C.
    2. Vaksinere en 50 mL kultur av LB med 100 µg/mL ampicillin fra transformasjon platen, og vokser det over natten med skjelvende på 200 rpm på 37 ° C.
    3. Vaksinere 3 x 1000 mL av LB i Fernbach flasker med 100 µg/mL ampicillin med 15 mL av natten kultur og vokse med skjelvende på 200 rpm på 37 ° C.
      Merk: Protein struktur løsning-selenomethionyl (SeMet) innlemmelse, kan oppnås ved vokser celler i M9 minimal medium som er supplert med SeMet og en aminosyre blanding for å hemme metionin produksjon før induksjon, i motsetning til LB media 18.
    4. Indusere uttrykk for Nsa1 når den OD600 når ~0.8 med tillegg av isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) i en siste konsentrasjon av 1 mM etterfulgt av inkubasjon ved 25 ° C over natten med skjelvende på 200 rpm.
    5. Høste celler med sentrifugering på 4 ° C i 15 min 5,050 x g.
      Merk: Celler kan lagret langsiktige på-80 ° C eller brukes umiddelbart for protein rensing.
  3. Nsa1 Protein rensing
    1. Resuspend cellene i 25 mL lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 10% glyserol, 10 mM MgCl2) pre kjølt på 4 ° C som inneholder en EDTA-fri protease hemmer tablett.
    2. Lyse celler av sonication på 4 ° C (tid 7 min, 2 s på syklus, 2 s av syklusen, amplitude: 70%).
    3. Klargjøre lysate med sentrifugering 26,900 x g for 45 min på 4 ° C.
    4. Bruke avklart lysate til en gravitasjon flow kolonne med 10 mL immobilisert kobolt affinitet harpiks, pre equilibrated med lyseringsbuffer.
    5. Tillate nedbryting forbi over harpiks gravitasjon flow på 4 ° C og vaske harpiks to ganger med 100 mL lyseringsbuffer.
    6. Elute Nsa1 med 20 mL elueringsbufferen (50 mM Tris-HCl pH 7.5 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5% glyserol og 200 mM imidazole).
    7. Ta 15 μL av eluate og kjøre den på en 4-15% SDS side gel å bekrefte at protein er elut fra affinitet harpiks (figur 1A).
    8. Fjerne MBP koden av TEV protease fordøyelse. Legg 1 mL av TEV protease19 (1 mg/mL stock) til Nsa1 affinitet harpiks tilsettes og ruge det på 4 ° C over natten.
    9. Konsentrat MBP kløyvde Nsa1 til ~ 5 mL bruker en sentrifugal filter med en molekylvekt kuttet av 10 kDa.
    10. Bruke MBP-kløyvde Nsa1 til en gel-filtrering kolonne, pre equilibrated i buffer en (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% glyserol og 1 mM β-mercaptoethanol) (figur 1B).
    11. Analysere kolonnen fraksjoner gel filtrering at MBP er kløyvde og atskilt fra Nsa1 ved å kjøre 15 μL eksempler på en 4-15% SDS side gel (figur 1B).
    12. Kombiner brøker som inneholder Nsa1 og konsentrere til 8 mg/mL bruker en sentrifugal filter med en molekylvekt kuttet av 10 kDa.
    13. Bestemme protein konsentrasjonen av måler absorbansen på 280 nm på et spektrofotometer bruker utryddelse koeffisienten 42530 M-1cm-1. Bruke protein umiddelbart for proteolytisk screening og krystallisering forsøk.

2. krystallisering og proteolytisk Screening av Nsa 1

  1. Spredt matrise Crystal Screening av Nsa1
    1. Sentrifuge 500 μL 8 mg/mL beholdningen av Nsa1 16.000 x g ved 4 ° C i 10 min.
    2. Oppsett krystallisering forsøk med en krystallisering robot og spredt matrise krystall skjermer. Fyll tanken av 96 godt skuffer med 30 µL personlige krystall skjerm reagensene fra spredt matrise krystallisering skjermene. Sette sittende drops robot ved å blande 250 nL godt løsningen med 250 nL protein løsningen.
    3. Forsegle krystallisering platene med tape og Inkuber dem på 25 ° C.
    4. Inspisere platene annenhver dag de første 2-3 uker med en stereomicroscope.
    5. Kontroller at potensielle krystaller treff inneholder protein med UV mikroskop.
      Merk: Hvis Nsa1 to forskjellige krystall former (kubikk og orthorhombic, figur 2A) ble oppnådd innen 1 uke fra følgende skjermer: JCSG + tilstand B11 (1,6 M natriumsitrat tribasic tørke, pH 6,5) og veiviseren Precipitant synergi skjermen blokk 2 tilstand C11 (20.1%(v/v) pinne 1500, 13.4%(v/v) pinne 400, 0.1 M Tris HEPES/natriumhydroksid, pH 7.5).
  2. Proteolytisk Screening
    Merk: Under krystallisering optimalisering, ble det oppdaget at orthorhombic krystaller av Nsa1 oppstod proteolytisk cleavage og krystaller kunne ikke dupliseres ved hjelp av full lengde protein. Bruke en kombinasjon av begrenset proteolyse kombinert med massespektrometri, ble det fastslått at C-terminus av Nsa1 var følsom for proteolyse og fjerning av C-terminalen halen var nødvendig for etterfølgende reproduksjon av orthorhombic krystall form ( Nsa1ΔC).
    1. Forberede 1 mg/mL protease lager løsninger av følgende proteaser α-chymotrypsin, trypsin, elastase, papain, subtilisin og endoproteinase Glu-C.
    2. Lag 1:10, 1: 100 og 1:1000 fortynninger av hver 1 mg/mL protease aksje med fortynning Buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM natriumklorid).
    3. Pipetter 1 μL protease lager (1:10, 1: 100 og 1:1000) i 9 μL dele protein (1 mg/mL) for hver protease å bli vist.
    4. Ruge i løsning på 37 ° C i 1 time.
    5. Stoppe reaksjonen ved å legge 10 μL 2 x SDS side eksempel buffer og varme reaksjonen på 95 ° C i 5 minutter.
    6. Analysere fordøyer ved å kjøre dem på en 4-15% SDS side gel (figur 2B).
    7. Identifisere protease motstandsdyktig domener av målet protein av i-gel massespektrometri analyse.
    8. Fjern regionene protease-labil fra målet protein ved å opprette avkortet uttrykk konstruksjoner og etter kloning, uttrykk og rensing protokollen beskrevet ovenfor.
  3. Krystallisering optimalisering
    1. Forberede eller få lager løsninger av følgende innledende krystallisering reagensene: 1,6 M natriumsitrat tribasic tørke pH 6,5 100%(v/v) pinne 400 50%(v/v) pinne 1500, 1 M HEPES/natriumhydroksid, pH 7.5.
    2. Forberede en lager løsning av Nsa1FL og Nsa1ΔC på 8 mg/mL som beskrevet ovenfor.
    3. Optimalisere Nsa1 kubikk krystallene (Nsa1FL).
      1. Forberede en 24-og rutenett-skjerm med brønner som inneholder 500 µL med en gradient 1-1.6 M natriumsitrat med pH 6,5 fra en lager løsning av 1,6 M natriumsitrat tribasic med pH 6,5.
      2. Mix 1 µL av protein med 1 µL godt løsningen og plassere blandingen inn en silikoniserte dekke lysbildet. Nøye Inverter dekke lysbildet på den pre smurt godt og sikre at det er godt forseglet, men ta vare å ikke forstyrre drop eller bryte dekke lysbildet. Gjenta denne prosessen til skuffen er fylt og deretter lagre på 25 ° C.
        Merk: Liten kubisk krystaller skal vises i 2-7 dager.
      3. Klargjør en microseed lager av kubikk krystaller. Bruke en montert nylon loop for å overføre ~ 10 liten kubisk krystaller til en 1,5 mL mikro-sentrifuge rør som inneholder en liten perle og 50 µL av 1,6 M natriumsitrat tribasic vidd pH 6,5.
      4. Vortex 1,5 mL mikro-sentrifuge røret i høy hastighet (~ 3000 rpm) for 1 min.
      5. Gjøre en rekke 10 ganger føljetong fortynninger av frø aksjen med 1,6 M natriumsitrat tribasic og virvle blandingen grundig for 5 s.
      6. Fyll hver brønn av et 24-godt rutenett, skjerm med 500 µL av 1,6 M natriumsitrat tribasic pH 6,5.
      7. Optimalisere microseeding betingelsene ved å definere dråper med varierende forhold av protein med frø lager løsninger (figur 3A). Større kubikk krystaller av høy Diffraksjon kvalitet skal vises i 2-5 dager (Figur 3 c).
    4. Optimalisere orthorhombic krystaller (Nsa1ΔC)
      1. Forberede en rutenettet skjerm med 500 µL i hver brønn med 24 ulike forhold (figur 3B) fra lager løsninger 50%(v/v) pinne 1500 og 100%(v/v) pinne 400. I tillegg til grader av PEG 1500 og PEG 400, bør hver vel også inneholde 0.1 M HEPES/natrium hydroksid pH 7.5.
      2. Bland 1 µL av protein løsning med 1 µL av godt løsning på en silikoniserte dekke lysbilde. Nøye er Inverter dekke lysbildet på den pre smurt godt og sikre at det godt forseglet. Gjenta denne prosessen til hele skuffen er fylt. Lagre magasinene på 25 ° C.
        Merk: Nsa1 orthorhombic krystaller skal vises i 2-7 dager.
      3. Videre optimere orthorhombic krystaller av microseeding som kubikk krystallene (trinn 2.3.3.3 til 2.3.3.7) med 500 µL 20.1%(v/v) pinne 1500, 13.4%(v/v) pinne 400 og 0.1 M HEPES/natrium hydroksid pH 7.5 som vel løsningen.
        Merk: Nsa1 SeMet krystaller skal være optimalisert slik som native krystaller.

3. X-ray Diffraksjon datainnsamling og Nsa 1 struktur løsning

  1. Cryo-beskyttelse av krystaller og X-ray Diffraksjon datainnsamling
    1. For orthorhombic krystaller (Nsa1ΔC), forberede en 1 mL kryoprotektant løsning som inneholder 22.5%(v/v) pinne 1500, 15%(v/v) pinne 400 og 0.1 M HEPES/natrium hydroksid pH 7.5.
    2. Fylle et skum Dewar med flytende nitrogen, og pre kul en krystall puck. Vær forsiktig når du arbeider med flytende nitrogen og bruke vernehansker og vernebriller.
    3. Nøye invertere det dekker lysbildet krystallisering godt med krystaller på scenen av en stereomicroscope.
    4. Pipetter 2 µL kryoprotektant løsningen på et nytt dekke lysbilde.
    5. Knytte en montert nylon loop riktig papirstørrelse for crystal til en magnetisk cryo tryllestav.
    6. Med hjelp av stereomicroscope, raskt overføre en krystall kryoprotektant løsningen med montert cryo løkken.
    7. La crystal equilibrate i 5 minutter i kryoprotektant løsningen.
    8. Med hjelp av stereomicroscope, raskt sløyfe krystall fra kryoprotektant løsningen og styrter frostvæske i flytende nitrogen.
    9. Vente på flytende nitrogen rundt loopen stopper koking og slipper løkken fra tryllestaven til en spesifikk plassering i crystal pucken.
    10. Kubikk Nsa1FL krystaller trenger ikke å være cryoprotected og kan være direkte flash frosset (etter trinn 3.1.8-3.1.9 ovenfor).
    11. Seal krystall pucken bruke cryo verktøy og overføre til en frakt stokk i en pre kjølt dewar. Lagre krystaller i pucker/dewars til datainnsamling.
    12. Hvis datainnsamling på en synchrotron, skipet krystaller til synchrotron med en tørr avsender.
    13. Samle X-ray Diffraksjon data etter standardmetoder20.
      Merk: For Nsa1 født og SAD (single-bølgelengde uregelrett dispersion) datasett ble samlet på 100 K på SER-CAT strålen linjene 22-ID og 22-BM avansert Foton kilde på Argonne National Laboratory (Chicago, IL). SAD Nsa1 datasettet ble samlet inn på λ = 0.97911 Å. Dataene ble spilt inn med en 1 s eksponeringstid og 0,5 ° svingninger. Mosaicity av disse krystallene var vanligvis rundt 0,3 °.
    14. Behandle og skala X-ray Diffraksjon bildene vil generere refleksjon filer for hvert datasett i gruppen passende plass.
      Merk: Nsa1 Diffraksjon datasett ble behandlet med HKL200021. Nsa1 kubikk krystallene ble behandlet i plass gruppe P213 og orthorhombic krystaller ble behandlet i plass gruppe P212121.
  2. Nsa1 struktur løsning.
    Merk: Det finnes flere programvarepakker for krystallografi som kan brukes til å løse og forbedre krystall strukturer inkludert Phenix og CCP422,23. Følgende er protokollen for Nsa1 struktur løsning ved hjelp av Phenix programvare suite22.
    1. Analysere innfødt og SAD skalert datasett med phenix.xtriage22.
    2. Løse strukturen i Nsa1 med Phenix.autosol bruker de TRISTE peak refleksjon file22,24. For å løpe programmet for AutoSol, Skriv inn antallet selenomethionine områder (områder = 9), filen fasta sekvens av Nsa1ΔC, og bølgelengde brukes for trist datainnsamling (λ = 0.97911 Å).
      Merk: Fra Nsa1 SAD datasettet phenix.autosol skal kunne bestemme eksperimentelle fasene og bygge mesteparten av modell.
    3. Gjør manuelle justeringer i modellen med Kvakk25, etterfulgt av raffinement i phenix.refine22,26.
    4. Løse strukturen i høy oppløsning innfødt orthorhombic krystall og kubikk krystall molekylær skifte med Phaser27,28.
    5. Etter vellykket struktur løsning, inspisere modellen og elektron tetthet kart i Kvakk25.
    6. Og finjustert strukturene ved å kjøre iterativ runder av raffinement i phenix.refine22,26 og modell bygning i Kvakk25.

4. SAXS innsamling, behandling og modellering

  1. Innsamling av SAXS
    Merk: SAXS data ble registrert for full lengde S. cerevisiae Nsa1 på lyskilde avansert, på høy gjennomstrømming SIBYLS beamline 12.3.1 ved Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Rense Nsa1FL følger protokollen beskrevet ovenfor. 24 timer før forsendelse av Nsa1FL til beamline, kjøre protein over en gel filtrering kolonne pre equilibrated i buffer A.
    2. Basseng brøker som inneholder Nsa1 og bestemme protein konsentrasjonen som beskrevet tidligere.
    3. Forberede 30 μl dele en konsentrasjon serie av Nsa1 fra 1 til 6,2 mg/mL bruker buffer A.
    4. Overføring 20 µL Serienavn konsentrasjon av Nsa1 til en klar full skjørt 96 godt microplate sammen med buffer A alene kontroller.
      Merk: SAXS data samles på fortynne løsninger ved hjelp av flere konsentrasjoner av renset prøve for å unngå samling, mellom partikkel frastøting og effekter av stråling skader.
    5. Sel på microplate med en silikon tetning mat og skip over natten på 4 ° C til beamline.
    6. Lagre microplate på 4 ° C til datainnsamling.
    7. Umiddelbart før datainnsamling, spinne platen 3200 x g i 10 min på 4 ° C fjerne potensielle aggregater og luftbobler.
    8. Postdataene for SAXS.
      Merk: For Nsa1, SAXS data ble registrert for bufferen før og etter hver protein konsentrasjon serie. Trettitre påfølgende skanninger av 0,3 s ble samlet inn for Nsa1FL over en konsentrasjon serien (1 til 6.2 mg/mL) på 10 ° C.
    9. Utføre buffer subtraksjon SAXS data.
      Merk: For Nsa1 buffer subtraksjon var gjort automatisk på beamline men buffer subtraksjon kan også utføres ved hjelp av data programvare som Scatter30 og ATSAS suite31. Buffer subtraksjon er en viktig del av dataanalyse for SAXS må være forsiktig å sikre at bufferen for subtraksjon er identisk med protein eksempel bufferen.
    10. Gjennomsnittlig 33 påfølgende skanner for å opprette en *ave.dat-fil for hver konsentrasjon.
      Merk: Overlappe 33 påfølgende rammer for å sammenligne kurvene. Endringer i spredning kurvene over tid er ofte om stråling skader. Ekskluder disse rammer fra snitt. Snitt av Nsa1 påfølgende skanner ble utført automatisk på SIBYLS beamline.
  2. SAXS behandling og sammenligning av konsentrasjon serien
    Merk: Det finnes flere programvarepakker som kan brukes til å analysere SAXS data. For Nsa1 radius av gyration og pair-wise avstand distribusjon funksjoner var bestemt PRIMUS32 og Gnom33 fra ATSAS 2.7.2 suite31 og forhold over alle protein konsentrasjoner å sikre det var ingen stråling skade eller konsentrasjon-avhengige mellom partikkel interaksjoner10.
    1. Åpne en terminal skall og gå til mappen som inneholder de SAXS dataene.
    2. Starte PRIMUS32 GUI fra terminal skallet.
    3. I PRIMUS GUI, laste spredning kurver (* ave.dat).
    4. Bruke AutoRg for å finne Radius av Gyration (Rg) og videresende spredning intensitet I(0), for hver spredning kurve (* ave.dat).
    5. Generere Kratky tomter for hver spredning kurve (* ave.dat), å vurdere graden av kompakthet.
    6. Bruke AutoGNOM33 til å beregne den pair-wise funksjonen (også kalt P(r)) for hver spredning kurve (* ave.dat). Angi en start DMaks ≈ 3 * Rg og optimalisere DMaks verdien for å få en jevn P(r) kurve. Under optimalisering av DMaks, kontroller at de beregnede P(r) funksjonen er forenlig med eksperimentelle spredning kurven ved å sjekke rapporterte χ2 verdien og visuelt vurdere generelt passer til spredning kurven.
    7. Beregne molekylvekt av Nsa1 fra spredning kurver med volumet av korrelasjon34.
    8. Sammenligne strukturelle parameterne for hver konsentrasjon å sikre at det er ingen stråling skader eller konsentrasjon-avhengige effekter.
      Merk: Konsentrasjon effekter kan manifestere seg som et økende Rg og DMaks i forhold til en økende protein konsentrasjon. Videre spredning I(0) delt eksempel konsentrasjonen bør også være konstant protein konsentrasjon serier.
  3. SAXS modellering
    Merk: For å bestemme plasseringen av C-terminus av Nsa1FL, den Nsa1 krystall struktur10 (PDB 5SUM) og SAXS spredning kurvene ble brukt til å utføre en kombinasjon av rigid kropp og ab initio modellering, bruker programmene HAUG 35 og Ensemble optimalisering metoden (EOM)36 fra ATSAS programvare suite31. WD40 domenet Nsa1 ble behandlet som en rigid kropp, mens C-terminus av Nsa1 med flere uordnede looper fra WD40 domenet ble formet slik at eksperimentelle SAXS data.
    1. Generer input PDB filen(e). Filen PDB må deles hver gang rester mangler hoved kjede, og filen PDB kan ikke inneholde flere konformasjonen, ligander, eller vann molekyler.
    2. Kjør programmet Pre_BUNCH35 forberede PDB inndatafilen HAUG (pre_bunch.pdb). Angi sekvensen av målet protein (*.seq), antall domener/pdb generert i 4.3.1, og hver av de enkelte PDB-filene generert ovenfor.
    3. Beregne spredning amplituder for hver enkelt PDB-fil ved hjelp av programmet CRYSOL37. Kjøre CRYSOL inn filen for personlige PDB og eksperimentell SAXS spredning kurven (*.dat). Dette vil generere en amplituder-fil (* .alm).
    4. Kjør programmet HAUG35 å modellere WD40 domenet Nsa1 mot SAXS dataene med en kombinert stive kropp og ab initio tilnærming. Input PDB filen fra Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), eksperimentell SAXS spredning kurven (*.dat) og personlige amplituden (* .alm) filer for hver delvis PDB-fil generert av CRYSOL.
    5. Sammenlign χ2 verdien fra den første PDB (5SUM) med det fra ab initio modellen generert av HAUG med eksperimentelle SAXS data.
      Merk: En vellykket HAUG modell bør ha en betydelig lavere χ2 verdi enn den starte modellen. Teoretisk spredning av HAUG modellen bør også beskrive godt eksperimentelle data som dømmes av visuell inspeksjon av overlappingen mellom teoretisk spredning av HAUG modellen SAXS dataene og χ2 verdien (Figur 4, Center rørledning).
    6. Undersøke manuelt utdatafiler fra HAUG i Pymol38 å overlappe krystallstruktur modellen HAUG, og SAXS konvolutten (Figur 4, senter rør).
    7. Kjøre HAUG 10 - 20 ganger generere uavhengig modeller for å bekrefte at modellene er like.
      Merk: For Nsa1 var det en rekke χ2 verdier ~ 1-3 fra 20 uavhengige kjører.
    8. Ensemble modellering
      Merk: som en valgfri tilnærming til HAUG kjøre EOM36 eller Minimal Ensemble søk39 (MES). EOM og MES bruker ensemble tilnærminger, som er godt egnet for proteiner med fleksible domener/områder i flere konformasjonen.
      1. Kjør programmet EOM36 med ATSAS online server. For å kjøre EOM, input PDB filene fra 4.3.1, en rekke mål protein (*.seq) og eksperimentelle SAXS data (*.dat).
      2. Sammenligne χ2 verdiene fra den første PDB (5SUM) med det fra ensemblet generert av EOM med eksperimentelle SAXS data.
        Merk: En vellykket EOM ensemble bør ha en betydelig lavere χ2 verdi enn den starte modellen. Teoretisk spredning av ensemblet bør også beskrive godt eksperimentelle data som dømmes av visuell inspeksjon av overlappingen mellom teoretisk spredning av ensemblet SAXS dataene og χ2 verdien (Figur 4, høyre rørledning). Man bør også sammenligne χ2 verdiene fra HAUG og EOM for å bestemme hvilken modell som best beskriver eksperimentelle SAXS data.
      3. Undersøke manuelt EOM conformers i Pymol38 for å overlappe krystallstruktur med conformers generert av EOM (Figur 4). Merk antall conformers og brøkdel av belegg for hver conformer som bidrar til spredning kurven. For mer rigid molekyler, som Nsa1, hvor mange conformers bør være liten (1-5) (Figur 4, rett rør)36.
      4. Kjør EOM på nytt flere ganger for å sikre konsekvent resultater.
        Merk: For Nsa1 antall conformers er vanligvis 3 til 4 med χ2 verdier mellom 0,1 og 0,3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nsa1 var PCR forsterket fra S. cerevisiae genomisk DNA og subcloned i en vektor inneholder en N-terminal 6 x-histidin affinitet kode etterfulgt av MBP og en TEV protease nettsted. Nsa1 ble forvandlet til E. coli BL21(DE3) celler og høy avkastning av protein uttrykk ble innhentet etter induksjon med IPTG og vekst ved 25 ° C over natten (figur 1A). Nsa1 var affinitet-renset på immobilisert kobolt affinitet harpiks, etterfulgt av MBP spalting med TEV protease, og til slutt løst av størrelse utelukkelse kromatografi (figur 1B). Fraksjoner størrelse utelukkelse kromatografi inneholder Nsa1 var samlet, konsentrert til 8 mg/mL og deretter brukt for krystallisering forsøk med en krystallisering robot. Første spredt matrise krystall skjermer gitt to forskjellige krystall former for Nsa1, kubikk og orthorhombic (figur 2A).

Optimalisering av kubikk og orthorhombic krystaller, ble det oppdaget at orthorhombic krystaller oppsto som følge av proteolytisk spalting av Nsa1. Begrenset proteolyse og massespektrometri ble brukt til å bestemme regionen Nsa1 som var følsom for proteolyse, og det ble observert at Nsa1 var følsom for en konsentrasjon gradient protease elastase (figur 2B). Etterfølgende massespektrometri analyse bekreftet at denne fornedrelse skyldes tap av C-terminus av Nsa1. En rekke C-terminalen truncations av Nsa1 ble generert, for å fjerne proteolytisk følsom C-terminus (figur 2C). Orthorhombic krystallene kan gjentas med Nsa1ΔC (rester 1-434) trunkering, som ble til slutt brukt til trist proteinstrukturer. Orthorhombic krystallene kan også gjentas ved å behandle Nsa1FL med elastase i 1 time ved 4 ° C før definere krystall skuffer.

Kubikk Nsa1 krystaller var optimalisert bruker Nsa1FL gjennom en kombinasjon av natriumsitrat graderinger, kombinert med microseeding (figur 3A). Dette gitt store, reproduserbare kubikk krystaller, med en Diffraksjon grense på rundt 2,8 Å oppløsning (Figur 3 c, venstre). Orthorhombic krystallene kan bare optimaliseres ved hjelp av C-terminalen trunkering variantene av Nsa1, av varierende konsentrasjon gradienter av PEG 1500 og PEG 400, kombinert med microseeding, som hadde store krystaller med en Diffraksjon grense på rundt 1.25 Å oppløsning (Figur 3A-C). Eksperimentell faser av Nsa1 ble fastsatt av SeMet-SAD fra en SeMet-avledet Nsa1ΔC10.

N-terminal syv-blader β-propell WD40 domenet Nsa1 ble også løst i begge kubikk og orthorhombic krystall strukturer, men begge strukturer manglet elektron tetthet for C-terminus av Nsa1. SAXS ble deretter brukt til å bestemme plasseringen av manglende C-terminalen domenet til Nsa1 i løsningen. Etter optimering prøve konsentrasjon for datainnsamling, ble delvis Atom-strukturen brukt til å utføre rigid kropp modellering, og generere en ab initio rekonstruksjon av de manglende komponentene. Modellen ble evaluert i godhet av passformen for de beregnede spredning kurvene til eksperimentelle data (Figur 4, center rørledning). WD40 domenet Nsa1 alene er ikke en god tilpasning av eksperimentelle SAXS data, som dokumentert av avviket mellom eksperimentelle spredning kurven med teoretisk spredning kurven, som ble generert fra krystallstruktur PDB-ID 5SUM (Figur 4, venstre rørledning). I tillegg til stive kropp modellering, ble ensemble modellering også gjort. Dette produsert et ensemble av 3 til 4 conformers av Nsa1 og resulterte i en lavere χ2 verdi (Figur 4, rett rør). Reduksjonen i modellen avvik (χ2) med ensemblet modellering avslørt conformational prøvetaking av Nsa1 C-terminalen halen i løsningen.

Figure 1
Figur 1. Uttrykk og rensing av Nsa1 med en 6 X-hans-MBP fusion kode. (A) SDS side analyse av protein uttrykk i BL21 (DE3) celler ved 25 ° C over natten og det første rensing steget med kobolt affinitet harpiks. (B) representant størrelse utelukkelse chromatogram etter TEV cleavage. Fraksjonene størrelse utelukkelse kromatografi ble analysert av SDS-side. Fraksjoner fra topp 1 inneholder Nsa1 var samlet og brukes i strukturelle analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. C-terminus av Nsa1 er følsom for proteolyse. (A) første krystallisering studier av Nsa1 gitt to forskjellige krystaller former: kubikk og orthorhombic. UV mikroskop ble brukt til å bekrefte at krystallene inneholdt protein. Vis: Synlig lys, UV: UV mikroskop. Skala bar = 50 µm i hvert vindu. (B) proteolytisk screening analysert av SDS-side. Tre fortynninger (1:10, 1: 100, 1:1000) for hver protease aksje (0.1, 0,01, 0,001 mg/mL) ble kombinert med dele protein (1 mg/mL) for å bli vist. Protease motstandsdyktig domener ble analysert i SDS side og massespektrometri etter 37 ° C inkubasjonstiden for 60 min. Nsa1-FL: frisk renset protein, Nsa1Δ: renset protein lagret på 4 ° C i 3 uker etter som en degradert form av proteinet ble observert. (C) skjematisk diagram av Nsa1 full lengde (øverst) og C-terminalen trunkering konstruere (lavere). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Nsa1 krystallisering optimalisering. (A) en frø lager var forberedt fra første små krystaller og brukes til å lage en fortynning serie (1 x ~ 1/104x) (microseeding). Ved å blande 1 µL av protein med 1 µL av utvannet frø aksjer, vokste større enkelt krystaller innen en uke. (B) precipitant konsentrasjon gradient for orthorhombic krystall optimalisering. (C) optimalisert kubikk og orthorhombic krystaller brukes for datainnsamling. Grønne sirkler angi typiske området av krystall skuffene som hadde datainnsamling kvalitet krystaller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Skjematisk av Nsa1 SAXS analyse. Oversikt over rørledningen brukes til å behandle SAXS dataene og generere modeller med HAUG (midten) og EOM (høyre). Rørledningen venstre viser avviket mellom eksperimentelle spredning kurven (røde sirkler, protein konsentrasjon: 6 mg/mL) med teoretisk spredning kurven (blå linje), som ble generert fra krystallstruktur PDB-ID 5SUM. Modellene ble vurdert ved å sammenligne eksperimentell SAXS spredning kurven (røde sirkler, protein konsentrasjon: 6 mg/mL) med spredning kurven avledet fra HAUG modellen av Nsa1 (svart linje) eller EOM conformers av Nsa1 (svart linje). I hver modell vises WD40 domenet i tegneserie farget i grønt (PDB-ID 5SUM), fleksibel C-terminus vises i sfærer farget i rødt for HAUG og grønn, magenta, cyan og gule for de personlige EOM conformers. Brøkdel av hver conformer avledet fra EOM er merket ved siden av modellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruker denne protokollen, ble rekombinant Nsa1 fra S. cerevisiae generert for strukturelle studier både Røntgenkrystallografi og SAXS. Nsa1 var godt opptrådt i løsningen og krystallisert i flere krystall skjemaer. Under optimalisering av disse krystallene, ble det oppdaget at C-terminus av Nsa1 var følsom for protease degradering. Høy oppløsning, orthorhombic krystall skjemaet kunne bare dupliseres med C-terminalen trunkering varianter av Nsa1, sannsynligvis fordi fleksibel C-terminus av Nsa1 forhindret krystall pakking. Strukturen til Nsa1 ble løst ved Røntgenkrystallografi høy oppløsning, men C-terminus kan ikke bygges i enten krystall form fordi det ikke ble bestilt. Krystallografi er det premiere teknikken for å bestemme atomic oppløsning strukturer av makromolekyler rundt størrelsen på Nsa1, men som med alle metoden, krystallografi har noen begrensninger. En av krystallografi store begrensninger er manglende evne til å løse uordnede regioner av proteiner40,41.

C-terminus av Nsa1 er viktig for riktig nucleolar lokalisering av protein, understreker behovet for å studere dens struktur10. C-terminus av Nsa1, ble løst ved SAXS, en utfyllende strukturell biologi teknikk Røntgenkrystallografi. SAXS data ble registrert for full lengde Nsa1 en konsentrasjon serier. Fra denne konsentrasjonen serien identifiserte optimal konsentrasjon for Nsa1 SAXS innsamling og behandling. SAXS data ble registrert for Nsa1 på 6, 4.5 og 3.0 mg/mL. Guinier regionen, P(r) funksjon og molekylvekt var bestemt konsentrasjon serier slik at prøven var veloppdragen og ikke samlet under eksperimentelle forhold testet. For å rekonstruere full lengde strukturen til Nsa1, teoretisk spredning amplituden var bestemt fra delvis krystallstruktur og deretter ab initio metodene ble brukt til å modellere fleksibel C-terminus. Fra denne hybrid tilnærming, ble det fastslått at fleksibel C-terminus av Nsa1 strekker seg utover fra bestilte WD40 domenet.

Fremskritt i behandlingen verktøy har drevet populariteten til SAXS for macromolecular strukturelle studier. SAXS måler X-ray spredning mønsteret fra tilfeldig orientert protein i løsning å gi lav strukturinformasjon, inkludert molekylær masse og formen. Følgelig SAXS har dukket opp som en kraftig ortogonale struktur godkjenningen verktøyet for krystallografi. Dette skyldes i stor grad utviklingen av beregningsorientert metoder for å beregne teoretisk spredning av atomic strukturer og sammenligner dem med eksperimentell SAXS data37. Med denne tilnærmingen, conformational staten, kvartær struktur og høyere orden montering i en krystall gitter kan sammenlignes de strukturelle karakteristikkene av partikkel i løsningen. Videre kan uordnede looper og termini mangler i høy oppløsning strukturer bestemmes av Røntgenkrystallografi modelleres ved hjelp av løsning spredning data. Denne hybrid strukturelle bruker krystallstruktur som en byggeblokk for SAXS-guidede modellering av manglende rester og har vist seg for å være effektive i kartlegging C-terminus Nsa110, i tillegg til andre macromolecules for eksempel influensa A-viruset M1 Matrix protein42og døde-boksen RNA chaperones43. Avanserte SAXS-baserte modellering programvare kan også ta mer komplekse systemer, som egentlig uordnede proteiner, ved å tilordne conformational landskapet av disse systemene ved hjelp av en rekke conformers som sammen bidrar til den generelle spredningen potensialet av partikkel i løsningen16,39. Tatt sammen, siste fremskritt innen SAXS samling og bearbeiding verktøy bidrar til suksess for hybrid strukturell biologi tilnærminger for å takle utfordrende biologiske systemer.

Kombinasjonen av løsningen spredning med høy oppløsning strukturer er klar til å svare på viktige spørsmål om fleksibiliteten og dynamikken i makromolekyler44. Mange proteiner, slik som Nsa1, har dynamisk regioner som er viktige for biologisk funksjon. I dette manuskriptet leveres en mal protokoll som detaljer kombinasjonen av SAXS med høy oppløsning proteinstrukturer av Røntgenkrystallografi. I tillegg til Røntgenkrystallografi SAXS kan også brukes til å kompliment annen strukturell biologi teknikker inkludert NMR, elektron spinn resonans (EPR) og fluorescens resonans energi overføring (bånd), videre fremheve betydningen av SAXS som en komplementær strukturell biologi teknikk45,46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Diffraksjon dataene ble samlet på Sørøst regionalt samarbeid tilgang Team (SER-CAT) 22-ID og 22-BM beamlines på Avansert Foton kilde (APS), Argonne National Laboratory. SAXS dataene ble samlet inn på SIBYLS beamline på forhånd lys kilde (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi ønsker å takke ansatte på SIBYLS beamline for deres hjelp med eksterne innsamling og prosessering. Vi er takknemlige til National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) masse massespektrometri forskning og støttegruppe for hjelp avgjøre domenegrenser protein. Dette arbeidet ble støttet av oss National Institute for Health Intramural forskningsprogram; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 til R. E. S.) og de kanadiske instituttene of Health Research (CIHR, 146626 til M.C.P). Bruk av APS ble støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office for energi basalfag under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38. Bruk av avansert lys kilde (ALS) ble støttet av direktør, Office of Science, Office for energi basalfag, av US Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Ekstra støtte for SIBYLS SAXS beamline kommer fra National Institute of Health prosjektet MINOS (R01GM105404) og et avansert instrumentering Grant S10OD018483. Vi vil også gjerne takke Andrea Moon og Dr. Sara Andres for deres kritisk lesning av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

Biokjemi problemet 131 Røntgenkrystallografi SAXS Hybrid metoder Protein rensing WD40 domene begrenset proteolyse ribosom montering
Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra <em>S. Cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley,… More

Lo, Y. H., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter