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Bioengineering

Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für großflächige Scan Sonde Nanolithografie durch die iterative Ausrichtung der Sonde Arrays sowie die Nutzung von lithographischen Mustern für Zelloberfläche Wechselwirkungsstudien aktiviert.

Abstract

Rastersondenmikroskopie ermöglichte die Schaffung einer Vielzahl von Methoden für die konstruktive (Additiv) Top-Down-Herstellung der Nanometer-Skala Features. Historisch gesehen wurde ein großer Nachteil des Scannens Sonde Lithographie intrinsisch niedriger Durchsatz der einzelnen Tastsysteme. Dies hat durch die Verwendung von Arrays mit mehreren Sonden, erhöhte Nanolithografie Durchsatz ermöglichen in Angriff genommen worden. Um solche parallelisierte Nanolithografie zu implementieren, die präzise Ausrichtung der Sonde Arrays mit der Substratoberfläche ist entscheidend, damit alle Sonden machen Kontakt mit der Oberfläche gleichzeitig wenn lithografischen Strukturierung beginnt. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Polymer-Stift-Lithographie Nanometerskala Funktionen über Zentimeter große Bereiche, erleichtert durch den Einsatz eines Algorithmus für die schnelle, präzise und automatische Ausrichtung der Sonde Arrays zu produzieren. Nanolithografie Thiole auf gold Substraten zeigt, die Erzeugung von Funktionen mit hoher Gleichmäßigkeit. Diese Muster sind dann mit Fibronektin für den Einsatz im Rahmen der Oberfläche gerichtet Zelle Morphologie Studien funktionalisiert.

Introduction

Fortschritte in der Nanotechnologie ist abhängig von der Entwicklung der Techniken in der Lage, effizient und zuverlässig Herstellung nanoskaliger Merkmale auf Oberflächen. 1 , 2 erzeugen solche verfügt über große Flächen (mehrere cm2) zuverlässig und bei relativ geringen Kosten ist ein nicht triviales Unterfangen. Die meisten vorhandenen Techniken, abgeleitet von der Halbleiter-Industrie vertrauen auf ablative Photolithographie, "harte" Materialien zu fabrizieren. In jüngerer Zeit, haben Lithographische Techniken abgeleitet Rastersondenmikroskopie (SPM) als eine bequeme und vielseitige Ansatz für das rapid Prototyping von nanoskaligen Designs entstanden. 3 SPM-basierte Techniken sind in der Lage, bequem und schnell "beliebige benutzerdefinierte Muster schreiben". Die bekannteste davon ist Dip-Pen Nanolithografie (DPN), vorangegangen durch Mirkin Et Al.,4 wo eine Scan-Sonde als "Stift" verwendet wird, um eine molekulare "Tinte" zur Herstellung von Funktionen in einer Weise analog zu schreiben Oberfläche übertragen. Unter Umgebungsbedingungen, wie eine Sonde über eine Oberfläche gescannt wird die "Tinte" Moleküle werden übertragen auf der Oberfläche über eine Wasser-Meniskus, die zwischen der Sonde und der Oberfläche (Abbildung 1) bildet. DPN erlaubt somit die nanolithographischer Abscheidung einer breiten Palette von Materialien, einschließlich "weiche" Materialien wie Polymere und Biomoleküle. 5 Verwandte Techniken mit Sonden entwickelt mit Kanälen für flüssige Lieferung verschiedentlich genannt "Nanopipettes" und "Nano-Füllfederhalter", berichtet wurde. 6 , 7 , 8

Das Haupthindernis für die breitere Anwendung der SPM stammenden Lithographie ist Durchsatz, da sie eine übermäßig lange Zeit auf Muster-Zentimeter-Skala-Bereiche mit einer einzigen Sonde erfordert. Frühe Bemühungen zur Behebung dieses Problems konzentrierte sich auf die Parallelisierung der Cantilever-basierte DPN mit "One-dimensional" und "zweidimensionale" (2D) Sonde-Arrays für die Lithographie Zentimeter große Gebiete gemeldet wird. 5 , 9 jedoch diese Freischwinger-Arrays werden durch relativ komplexen mehrstufigen Fertigungsverfahren hergestellt und sind relativ empfindlich. Die Erfindung des Polymer Stift Lithographie (PPL) Thema dieses ersetzt die standard SPM Kragträgern mit einem 2D-Array weichen Siloxan Elastomer Sonden auf einen Glasobjektträger gebunden. 10 einfache Sonde Setup verringert erheblich die Kosten und Komplexität der Musterung Großflächen, Öffnung der Nanolithografie für ein breiteres Spektrum von Anwendungen. Dieser Freischwinger-freie Architektur wurde auch auf harte Spitze weiche Feder Lithografie,11 erweitert bietet eine Mischung aus weichem Elastomer Unterstützung mit harten Silizium-Tipps geben verbesserte Auflösung im Vergleich zu Mustern mit weichen hergestellt Elastomer-Tipps.

Ein entscheidender Faktor bei der Ausführung dieser 2D Array-Technologien ist, dass das Array Sonde exakt parallel zur Oberfläche Substrat sein, damit beim Lithographie genutzt wird, die Sonden mit der Oberfläche in Kontakt kommen gleichzeitig. Sogar eine kleine Schiefstellung kann einen großen Unterschied in der Größe von einer Seite des Arrays zum anderen, da einige Sonden früher während des Abstiegs des Arrays, mit der Oberfläche in Kontakt kommen werden, während andere später oder überhaupt nicht in Berührung kommen werden. 12 exakte Ausrichtung ist besonders wichtig mit PPL aufgrund der Verformbarkeit von weichem Elastomer-Sonden, wo werden die Sonden, die Kontakt mit der Oberfläche bereits komprimiert, auf der Oberfläche einen größeren Fußabdruck hinterlassen.

Die frühe Arbeiten auf PPL beschäftigt rein visuelle Inspektion, führen den Alignment-Prozess, mit Hilfe einer Kamera über das Array, um die Verformung der pyramidalen Sonden zu beobachten, wie sie mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wurden. 10 Ausrichtung wurde beurteilt, indem Sie beobachten, welche Seite der Sonden kam in Kontakt mit der Oberfläche zuerst, dann Einstellung des Winkels und iterativ den Vorgang wiederholen, bis die Differenz in Kontakt auf jeder Seite der Sonde war das Auge nicht zu unterscheiden. Da diese Ausrichtung Verfahren stützt sich auf subjektive visuelle Inspektion durch den Betreiber, ist Reproduzierbarkeit gering.

Anschließend wurde ein objektiverer Ansatz entwickelt, bestehend aus einen Kraftsensor unter das Substrat zur Messung der Krafteinwirkung beim Kontakt der Sonden auf der Oberfläche angebracht. 12 Ausrichtung wurde somit erreicht durch eine Anpassung der Neigungswinkel zur Maximierung der der Kraft ausgeübt, die zeigten, dass die Sonden gleichzeitig in Kontakt waren. Diese Methode zeigte, dass Ausrichtung innerhalb von 0,004 ° der Oberfläche Parallel möglich. Diese "Force Feedback Nivellierung" wurde jetzt in vollautomatischen Anlagen in zwei unabhängige Berichte umgesetzt. 13 , 14 sowohl verwenden Sie einen Dreiklang von Kraftsensoren montiert unter dem Substrat oder über das Array und Messen Sie die Menge der Kraft, die beim Kontakt zwischen der Sonde Arrays und Oberfläche. Diese Systeme bieten hohen Präzision, Berichterstattung Fehlstellungen von ≤0.001 ° über 1 cm Längenskala,14 oder ≤ 0,0003 ° über 1,4 cm.13 diese automatische Justage-Systeme bieten auch bedeutende Einsparungen bei Bedienerzeit und Gesamtzeit in Anspruch genommen die Lithographie-Prozess.

Eine wichtige Anwendung von Hochdurchsatz-Oberfläche Fertigung ermöglicht durch diese Technologie ist die Generation der Zelle Kultursubstrate. Es ist inzwischen gut etabliert, dass Zelle Phänotyp manipuliert werden, indem Sie steuern die erste Interaktion zwischen Zellen und Oberflächeneigenschaften, und dies kann im Nanobereich verbessert werden. 15 insbesondere Sonde Lithographie Scanmethoden nachweislich eine einfache Methode, um eine Vielzahl von Nanofabricated Flächen für solche Zelle Kultur Experimente produzieren werden. 16 induziert z. B. Oberflächen präsentieren Nanoscale Muster der selbstgebaute Monolagen und extrazelluläre Matrix, die Proteine, die durch PPL und DPN templated verwendet wurden, um das Potenzial von Nano-modifizierten Materialien im Material Differenzierung der Stammzellen. 17

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines modifizierten Rasterkraft-Mikroskop (AFM)-Systems, das großflächige PPL ermöglicht. Wir ausführlich die Erkennung von Kraft mit mehreren Kraftsensoren als Mittel zur Bestimmung der Sonde-Fläche-Kontakt, zusammen mit einem Algorithmus, der die iterative Alignment-Prozess automatisiert. Nachfolgende Funktionalisierung von diesen Mustern mit der extrazellulären Matrix Protein Fibronektin und die Kultur des humanen mesenchymalen Stammzellen (Stammzellenreserve) werden als eine Demonstration der PPL-fabrizierten Oberflächen angewendet für die Zellkultur bezeichnet.

Protocol

1. Herstellung des PPL-Stift-Arrays

  1. Polydimethylsiloxan (PDMS) Copolymer Mischung vorbereiten:
    1. Fügen Sie 10 µL des Platins (0) - 1,3 - Divinyl-1,1,3,3-Tetramethyldisiloxane komplexe Lösung und 172 µL 1,3,5,7-Tetramethyl-1,3,5,7-Tetravinylcyclotetrasiloxane bis 250 g (ca. 7-8 % w/w Vinylmethylsiloxane)-Dimethylsiloxane Co-Polymer. Mischen Sie diese Komponenten gründlich auf ein drehrührwerk für 7 Tage um homogene Durchmischung zu gewährleisten.
      Achtung: Platin (0) - 1,3 - Divinyl-1,1,3,3-Tetramethyldisiloxane ist giftig. Bitte lesen Sie MSDS, bevor Sie mit dieser Lösung arbeiten. Sicherheitseinrichtungen muss getragen werden, beim Umgang mit der Chemikalie.
    2. Fügen Sie 0,5 g (25-35 % w/w Methylhydrosiloxane)-Copolymer Dimethylsiloxane 1,7 g auf einen Teil der Mischung aus Schritt 1.1.1 in ein mit einem Gewicht von Boot und mit einem Spatel mischen.
    3. Entgasen Sie diese Mischung durch Übertragung auf ein Vakuum Exsikkator und die Mischung zu niedrigem Druck (200 mTorr, 0,3 mBar) für 20 min auszusetzen, bis die Gasblasen verflüchtigt haben.
  2. Ein Objektträger 13 x 13 mm in einer Plastik Schraube-Spitze Durchstechflasche mit 20 mL 2-Propanol, gefüllt dann Ort das Fläschchen in einem Ultraschallbad für 10 min, großen Ablagerungen zu entfernen. Die Folien durch Eintauchen der Folien in frischen 2-Propanol (100 mL) waschen und Trocknen unter dem Strahl des Stickstoff-Gas.
  3. Eine Silizium-master-18 in einer Petrischale 4 cm Durchmesser geben Sie und ausreichend entgast PDMS prepolymer Mischung (aus Schritt 1.1) bis vollständig abgedeckt. In der Regel ist 100 µL für ein 20 x 20 mm-Meister erforderlich. Ort der Meister mit dem prepolymer Gemisch in einem Vakuum Exsikkator. Entgasen Sie das Polymer für weitere 5 min, Gasblasen gebildet während der Übertragung des Gemisches zu entfernen. O2 Plasma-Behandlung von Glas-Objektträger (Schritt 1.4 unten) sollte durchgeführt werden, während die Entgasung stattfindet.
  4. Behandeln Sie die Glas-Quadrate mit O2 Plasma (600 mTorr) bei maximaler RF-Leistung für 1 min um organische Verunreinigungen zu entfernen und eine gleichmäßige Oxidschicht auf dem Glas für die Haftung des Elastomers zu generieren. 19 Verwendung des Plasmas Folien sofort im nächsten Schritt behandelt.
  5. Legen Sie vorsichtig die quadratische Objektträger (aus Schritt 1.4) über das Prepolymer auf dem Master (ab Schritt 1.3) mit der Plasma gereinigt Seite nach unten. Drücken Sie vorsichtig Glas Rutschen auf der Silizium-Meister, um eingeschlossene Luft zu entfernen und um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiger Film von PDMS zwischen dem Master und der Folie eingeklemmt ist.
  6. Ort das Sandwich PDMS-Array von oben Schritt in einer Petrischale mit dem Silizium beherrschen am unteren (d. h., mit der Rückseite nach oben Glas-Folie) und legen Sie die Schale in einem Ofen bei 70−80 ° C für 24−48 h die PDMS thermisch zu heilen.
  7. Nehmen Sie das ausgehärtete Array aus dem Ofen und lassen Sie Cool für 15 min, dann mit einer Rasierklinge vorsichtig entfernen jede überschüssige PDMS von der Rückseite und Seiten des Glases schieben und einen Strom von trockenem Stickstoff verwenden, um jeglichen losen PDMS Schmutz wegblasen.
    Hinweis: darauf achten Sie, nicht zu kratzen der Silizium-Meister mit der Rasierklinge, da dies die Antihaftbeschichtung beschädigen kann.
  8. Keil eine Rasierklinge in die Ecke des Arrays in einer Tiefe von 1 mm und vorsichtig Hebeln das Array neben der Meister. Führen Sie diese Aktion in einem Rutsch kontinuierliche heben; lassen Sie sich nicht die Arrays auf dem Master zurückgreifen.
  9. Sorgfältig geschnitten und 0,5 mm von der PDMS entfernt an den Rändern des Arrays mit einer Rasierklinge zu kratzen. Verwenden Sie einen Strom von trockenem Stickstoff, um jeglichen losen PDMS Schmutz wegblasen.
    Hinweis: Es möglicherweise einfacher, diesen Schritt Trimmen unter Stereoskop oder eine Lupe auszuführen. Achten Sie darauf nicht zu verkratzen der Silizium-Meister mit der Rasierklinge, da dies die Antihaftbeschichtung beschädigen kann.

(2) array-Vorbereitung und Substrat Montage

  1. Generieren Sie eine hydrophile Oberfläche auf dem Array Sonde durch Plasmabehandlung O2 :
    1. Die PPL-Stift-Array in einer Petrischale in Plasmakammer dann 600 mTorr zuweisen Sie Vakuum. Schalten Sie den plasmagenerator (maximale Einstellung) für 30 s.
    2. Lassen Sie das Vakuum, entfernen Sie das Array zu und kontrollieren Sie ihre Hydrophilie fallen 20 µL deionisiertes Wasser auf das Array und beobachten, ob es gibt sogar Verteilung des Wassers auf der Oberfläche. Ist dies nicht der Fall, unterliegt das Array in eine zweite Runde der Plasmabehandlung. Danach trocknen Sie das Array gründlich mit einem Strom von trockenem Stickstoffgas.
  2. Doppelseitige Carbon Band zu verwenden, legen Sie das Array auf die Mitte des Sondenhalter. Montieren Sie den Taster-Halter auf den AFM Kinematische Halter (Abbildung 2).
  3. Laden Sie das PPL-Array mit 16-Mercaptohexadecanoic Säure (MHA) ("Freihand"):
    1. Bereiten Sie 1 mM 16-Mercaptohexadecanoic Säure (MHA) Lösung durch Auflösen von 8,6 mg in 30 mL Ethanol in einer Röhre und stellen Sie es in ein Ultraschallbad für 10 min die Verbindung vollständig aufzulösen.
      Achtung: 16-Mercaptohexadecanoic-Säure ist giftig. Bitte lesen Sie MSDS, bevor Sie mit dieser Lösung arbeiten. Sicherheitseinrichtungen muss getragen werden, beim Umgang mit der Chemikalie.
    2. Mit Hilfe einer Mikropipette, Anzahlung 20 µL Tropfen die MHA-Lösung auf dem Array. Vermeiden Sie den Kontakt der Pipettenspitzen mit Arrays. Lassen Sie es über das Array verteilt, dann lassen das Ethanol unter Umgebungsbedingungen verdunstet.
      Hinweis: Der PPL-Array kann alternativ eingefärbt werden, nachdem die Angleichung stattgefunden hat. 10
  4. Sobald die MHA-Lösung getrocknet ist, befestigen Sie die Sonde Halterung mit dem PPL-Array auf die AFM.

3. Vorbereitung des gold Substrate für PPL.

  1. Gold Substrate können entweder gekauft, oder hausgemacht durch thermische oder Electron beam Deposition, und bestehen aus einer 2 nm Titan Adhäsion Schicht gefolgt von 20 nm Gold auf einem Glas oder Silizium-Wafer. 18
  2. Gegebenenfalls reinigen Sie die Substrate von Sauerstoff Plasmabehandlung mit den Parametern im Schritt 1.4 beschrieben.
  3. Legen Sie das gold Substrat in der Mitte der AFM-Probentisch und befestigen Sie mit Klebeband um die Grenzen des Substrates (Abbildung 2). Die Bühne, um die richtige Höhe einstellen, wie in der Bedienungsanleitung des Herstellers mit der Z-Achse-Controller.

4. automatische Ausrichtung der Stift array

  1. Öffnen und führen die Bühne Controller Setup-Programm (SetupNSF.exe) auf dem Computer zurücksetzen ("Null") alle Achsen und Winkel zu einem vorkalibrierten Nullpunkt, dann verwenden Sie die Stufe X/y-Achse Controller-Konsole, um das Substrat in die gewünschte Ausrichtung zu verschieben / Druckerei Lage. Um optimale Ergebnisse zu erzielen sollte das Substrat in der Nähe der Mitte der Bühne, zwischen der Bühne Kraftsensoren platziert werden.
    Hinweis: bei einigen Modellen des Computers, die X/y-Achse-Controller USB-Signal beeinträchtigen, die von der Z-Achse-Controller. Wenn dies auftritt, trennen Sie die X/y-Achse Controller USB Kabel nach diesem Schritt. Es sollte dann nach der Ausrichtung Verfahren (Schritt 4.7) wiederhergestellt werden.
  2. Schalten Sie den Entriegelungshebel Bühne um dem Probentisch freizugeben und die Triade von Kraftsensoren zu aktivieren, wie durch die AFM des Herstellers angegeben. Kraftsensoren, mindestens 15 min lang equilibrate zu ermöglichen. Können Sie um optimale Ergebnisse zu erzielen 30-50 min.
  3. Die Höhe der z-Achse um das Array in unmittelbarer Nähe mit dem Substrat zu bringen, indem Sie visuell die Sonde Array und Oberfläche zu erhöhen.
    Hinweis: Je näher das Array ist an die Oberfläche, die weniger Iterationen sind erforderlich für die Alignment-Prozess spart Zeit.
  4. Öffnen/Ausführen das Programm automatische Ausrichtung (Auto Alignment v16.exe) und geben Sie entsprechenden Ausrichtung Parameter in das Programm ein.
    1. Geben Sie die gewünschte "Winkel Schritt" Parameterwert, in der Regel 0,15 °. Dieser Parameter ist der Offset Winkel aus den "optimalen" Winkel für jede Achse, die durch das Programm bestimmt ist. Setzen Sie diesen Parameter zwischen 0,1 und 0,2 °, wie Winkel niedriger als dieser Bereich nicht eindeutig nachweisbar Kraft Unterschied beim Ansatz der Sonden an die Oberfläche führen.
      Hinweis: Software akzeptiert Werte in Millidegrees (d. h., 1 x 10-3 °). Beispielsweise sollte für 0,15 ° Benutzer "150." geben
    2. Eingabe der gewünschten grobe Schritt "Parameterwert, in der Regel 0,6 µm. Dieser Parameter ist die z-Achse-Schrittweite von der Bühne verwendet, da es nähert sich die Sonden in die erste grobe Ausrichtung. Setzen Sie diesen Parameter zwischen 0,2 und 1 µm. größere Größen verringert den Zeitaufwand für die Alignment-Prozess Schritt aber die Genauigkeit der Ausrichtung, und erhöhen den Verschleiß an der Prüfpunkte.
      Hinweis: Software akzeptiert Werte von groben Schritten in Mikrometer. Beispielsweise sollten Benutzer für 0,6 µm "0,6" geben.
    3. Geben Sie den gewünschten "Feinen Schritt" Parameterwert, in der Regel 0,2 µm. Dieser Parameter ist die z-Achse-Schrittweite für die Feinjustierung der optimalen Ausrichtung verwendet. Für die meisten Anwendungen setzen Sie diesen Parameter zwischen 0,1 und 0,4 µm. größeren Wert Schrittweiten verringern den Zeitaufwand für die Alignment-Prozess werden aber verringern die Qualität der Justierung.
      Hinweis: Software akzeptiert Werte von feinen Schritten in Mikrometer. Beispielsweise sollte für 0,2 µm, Benutzer "0.2." geben
    4. Konfigurieren Sie den Excel Dateipfad und befestigen Sie eine unveränderte Kopie der mitgelieferten Tabelle Template-Datei durch das Symbol "Ordner" verwenden, navigieren zum Speicherort Datei und drücken "OK". Diese Datei enthält die rohen und berechneten Daten, die verwendet werden, um die optimale Bühne Neigungswinkel der Bühne bestimmen.
  5. Die AFM-Steuerungs-Software öffnen/ausführen. Navigieren Sie zu der Spektroskopie Bestandteil dieses Programm durch Anklicken des Buttons "Spektroskopie" (gemäß den Anweisungen des Herstellers), und legen Sie die AFM Scan Kopf z-Achse von 10 µm über 100 ms, mit einer Pausenzeit von 250 ms, dann oszilliert um 10 µm über 100 ms zurückziehen mit einer Pausenzeit von 250 ms (Abbildung 3).
  6. Wie die AFM-Kopf schwingt, klicken Sie auf "Start", von der Alignment-Software zur automatisierten Alignment-Prozess zu beginnen. Wenn das Programm ausgeführt wird, wird die Software schreiben und Lesen von Daten in die Datei im Schritt 4.4.4 beschrieben.
    Hinweis: Die Ausrichtung dauert zwischen 30 min und 3 h, je nach der Anfangsphase Stellung inmitten Schritt 4.3 und Software-Konfiguration, die in Schritt 4.4 eingegeben wurden.
    Achtung: Die Bühne Controller Konsolen sind immer noch aktiv während des Alignment-Prozess - verwenden Sie sie nicht während des Alignment-Prozess der Ausrichtung stören wird.
  7. Wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, leuchtet die grünes Licht-Box "Ausrichtung abgeschlossen" auf der Alignment-Software (ab Schritt 4.4). Wenn dies auftritt, klicken Sie auf "STOP", auf der Benutzeroberfläche, den Alignment-Prozess zu beenden.
  8. Überprüfen Sie die Diagramme in der Tabellenkalkulation-Template-Datei für eine Korrelation zwischen erfassten Datenpunkte und die Zeile passen, die von der Software generiert wird. Repräsentative Ergebnisse für Beispiele für eine gute Korrelation mit typischen R2 Werten von > 0,99 anzeigen. Ausrichtung nicht erfolgreich ist, ersetzen Sie die Sonde Array mit einem neu vorbereiteten Array (Schritt 2) und wiederholen Sie die Ausrichtung (Schritt 4.4).
  9. Verschieben Sie die Phase nach oben in der Z-Achse über die Bühne-Controller-Konsole für diese Achse. Die Bühne sollte in Schritten von 500 nm verschoben werden, bis Kontakt aus der Draufsicht Kamera der AFM beobachtet werden kann. Kontakt zwischen dem Array und Substrat kann als ein "weißer Punkt" mit hohem Kontrast an der Spitze der einzelnen Sonde Pyramiden beobachtet werden.
  10. An dieser Stelle klicken Sie auf die Taste "stop" auf die AFM-Steuerungs-Software, die Spektroskopie-Programm von Schritt 4.5 zu stoppen. Dies wird das Array von 10 µm, 10 µm möglich z-Erweiterung wodurch zurückziehen. Überprüfen Sie das Bild aus der Draufsicht Kamera der AFM um sicherzustellen, dass die Sonden nicht in Kontakt mit dem Substrat sind.

(5) Polymer Stift Lithographie (PPL)

  1. Navigieren Sie zu der Lithographie-Komponente der Steuerungssoftware durch Anklicken des Buttons "Lithographie" auf Steuerungssoftware. Wählen Sie die Z-Modulation Betriebsmodus und Importieren eines Rasters (Bitmap) oder Vektor-Bild, das als die Lithographie-Muster verwendet werden soll. Um die Funktionen in die repräsentativen Ergebnisse gezeigt zu generieren, verwenden Sie eine Bitmap aus 20 x 20 schwarze Pixel (siehe Zusatzmaterial), Lithographie von einem Raster von 20 x 20 Punkten pro Sonde auf dem PPL-Array entspricht.
  2. Geben Sie die Lithographie-Parameter in das Fenster "Pixel Grafik importieren" die AFM-Controller-Software.
    1. Konfigurieren Sie die "Size" das Muster erzeugt werden, z. B., 40 µm in der Länge und Breite. Dieser Parameter gibt die Breite und Länge, über die das Bild in der Bitmap skaliert werden. Um Funktionen gezeigt in die repräsentativen Ergebnisse zu generieren, verwenden Sie eine Breite und Länge von 40 µm in beiden Dimensionen.
    2. Legen Sie den Ursprung des Musters bei 25 µm auf x und y Achse erzeugt werden. Diese Parameter bestimmen die Mitte des Bildes relativ zur Mitte des AFM X/y-Achsen. Legen Sie diese Parameter, der Bereich der Oberfläche zu vermeiden, wo die Sonden in Kontakt während der Alignment-Prozess waren.
    3. Drucken 'Parameter' einstellen. Diese Werte bestimmen, wie die Sonden (d. h. mit der Oberfläche in Kontakt gebracht) verlängert werden als Reaktion auf jedes Pixel in der Bitmap-Bild.
      1. Wählen Sie aus der Drop-Down-Menü "Modulation Abs Z Pos" und "Simplify," zwei Schichten. In diesem Modus weist die AFM, die Sonden durch absoluten Abstand bestimmt durch nur zwei Ergebnisse, entweder "Schwarz (0)" oder "White (1)" Felder zu erweitern.
      2. Legen Sie die Werte in den "Schwarz (0)" und "White (1)" Felder auf 5 und-5 µm bzw.. Diese Werte bestimmen den Abstand der Sonden auf das Bitmap-Bild in Reaktion auf eine schwarze oder weiße Pixel verschoben werden sollten und sind in der Regel zwischen 3 und 5 µm für "Black" (d.h., Sonden nach unten durch die Entfernung bezogen auf den Nullpunkt dieser Achse zu verlängern) und-3 bis-5 µm für 'Weiß' (d. h., die Sonden nach oben abheben, indem 3 bis 5 µm bezogen auf den Nullpunkt).
        Hinweis: Diese repräsentative Abstände davon ausgehen, dass eine Erweiterung von 5 µm ergibt sich die Sonden mit der Oberfläche in Kontakt kommen und daraus resultierende der Generation eines Features, während eine Auszahlung von 5 µm die Sonden von der Oberfläche hebt in Kontakt. Z-Erweiterung betrifft Strukturgröße durch Bestimmung des Ausmaßes der Sonde Kontakt mit der Oberfläche, größere Erweiterungen führen die Sonden in die Oberfläche, was zu größeren Merkmalen weiter gedrückt. 10
      3. Klicken Sie auf 'OK', um diese Einstellungen zu implementieren und schließen Sie das Fenster.
  3. Geben Sie die "Pausenzeit" im Fenster "Lithographie" der AFM Steuerungssoftware, in der Regel 1 s. Diese Einstellung bestimmt die Länge der Zeit bleiben die Sonden im ausgefahrenen Zustand "Black", die in der Regel zwischen 0,1 und 10 s eingestellt ist.
    Hinweis: Längere Pausenzeiten führen in größeren Größen aufgrund der größeren Menge MHA in die Goldoberfläche transportiert. In anderen Berichten finden Sie weitere Details über die Kontrolle der Größe der Elemente generiert. 20
  4. Bereiten Sie die atmosphärische Schaltschrank.
    1. Senken Sie die atmosphärische Isolationskammer auf die AFM und öffnen/ausführen die vom Hersteller gelieferte atmosphärischen Steuerungs-Software (MHG_control.exe).
    2. Festlegen der atmosphärischen Steuerungssoftware weiterhin eine Relative Luftfeuchtigkeit von 45 % und einer Temperatur von 25 ° C eine Atmosphäre auszutauschen "Durchfluss" von 500 mL durch Eingabe dieser Werte in der Software. Klicken Sie auf "Use" um die Einstellungen zu implementieren. Das atmosphärische Steuermodul beginnt dann befeuchtete Luft in die Kammer zu Pumpen.
      Hinweis: Höhere Luftfeuchtigkeit führen zu größeren Größen aufgrund der Bildung von einem größeren Wasser Meniskus zwischen Stift Arrays und Oberfläche erzeugt. 21 dieser Wert wird in der Regel zwischen 40 und 60 % festgelegt. Die Durchflussmenge ist in der Regel zwischen 300 und 500 mL eingestellt. Größere Ströme erlauben die gewünschte Luftfeuchtigkeit schneller erreicht werden, aber weniger genau. Die repräsentativen Ergebnisse verwenden Sie einen Durchfluss von 500 mL für die erste Generation von Feuchtigkeit und verringerte sich auf 300 mL bei Erreichen der gewünschten Luftfeuchtigkeit, um eine präzise und stabile während Lithografie zu gewährleisten.
  5. Sobald die gewünschte Feuchtigkeit erreicht ist, starten Sie die Lithographische Sequenz durch Drücken der "Start"-Button auf die Software-Schnittstelle.
  6. Verwenden Sie nach Abschluss der Lithographie die z-Achse Bühne Controller Konsole, um das Substrat vom Array verschieben durch zurückziehen der Bühne von 500 µm. Dann entfernen Sie die atmosphärische Isolationskammer aus seiner Halterung.
  7. Wechseln des Bühne auslösehebels zum Sperren der Probentisch und deaktivieren die Kraftsensoren, wie durch die AFM des Herstellers angegeben, dann entfernen Sie das Substrat von der Bühne.

6. Muster Visualisierung

  1. Muster können visualisiert werden, mithilfe einer der folgenden Methoden, seitliche Kraft Scannen Sonde Mikroskopie oder chemische Ätzung.
  2. Scannen Sie die gemusterte Oberfläche auf AFM mit Querkraft-Modus mit Kontakt-Modus Freischwinger, um die Features zerstörungsfrei zu prüfen.
    Hinweis: Seitliche Rasterkraftmikroskopie als zerstörungsfreie Methode der Betrachtung der Features von Polymer Stift Lithographie hergestellt verwendbar; mit dieser Methode kann nur eine relativ kleine Fläche visualisiert (in der Regel 100 x 100 µm) jedoch.
  3. Da die hinterlegten MHA als ein Etch Resist fungieren kann, kann chemische Ätzung verwendet werden, um das Gold aus den nicht-gemusterten Bereichen zu entfernen. Die resultierende ungeätzt Bereiche können dann visualisiert werden, optische Mikroskopie, was bedeutet, dass eine große Fläche auf einmal angezeigt werden kann. 18
    Hinweis: Substrate, die auf diese Weise geätzt werden können nicht dann für die nachfolgende Zelle Kultur Experimente beschrieben verwendet werden.
    1. Bereiten Sie separat, wässrige Lösungen von 40 mM Thioharnstoff, 27 mM Eisen(III)-Nitrat und Salzsäure 100 mM. Bereiten Sie das Ätzmittel durch das Mischen von 5 mL eines jeden dieser drei Lösungen. Mischen Sie frisch vor jeder Benutzung. 22
      Achtung: Thioharnstoff, Eisen(III)-Nitrat und Salzsäure sind giftig. Bitte lesen Sie MSDS, bevor Sie mit dieser Lösung arbeiten. Sicherheitseinrichtungen muss getragen werden, beim Umgang mit der Chemikalie.
    2. Das gemusterte Substrat in eine Petrischale und Pipette ausreichend Ätzmittel Lösung in die Schüssel, bedecken die Oberfläche des Substrates (in der Regel 10 mL) zu übertragen. Halten Sie das Substrat unter Wasser für ca. 4-5 min. 15 Ätzen nm Gold (mit einer ungefähren Rate von 3 nm/min).
    3. Beim Ätzen abgeschlossen ist, entfernen Sie das Substrat und gründlich mit Wasser abspülen und Trocknen mit einem Strom von Stickstoff.
      Hinweis: Die Vollendung der Ätzprozess richtet sich nach der Dicke der Goldoberfläche erhalten (Schritt 3.1) die Ätzrate angegeben (Schritt 6.2.2) zugeordnet.
    4. Überprüfen Sie die geätzten gold Features unter hellen optischen Nahfeldmikroskopie. Die restlichen gold Features, die bleiben sollte angezeigt werden entsprechend dem Muster, das gedruckt wurde (aus Schritt 5.2). Wenn die gesamte Fläche homogen erscheint, bedeutet dies, dass eine erhebliche Menge an Gold bleibt und der Radierung Schritt (Folgeschritt 6.2.2) für 1-2 min wiederholt werden sollte.

7. Muster Funktionalisierung mit Fibronektin

  1. Die gemusterten Substrate in einer Lösung von 1 mM (11-Mercaptoundecyl)-Hexa(ethylene glycol)-Lösung in Ethanol für 1 Stunde waschen das Substrat dreimal mit Ethanol eintauchen und Trocknen unter dem Strahl des Stickstoff. Dieser Schritt passiviert ungemustert gold Gebiete.
    Achtung: (11-Mercaptoundecyl) Hexa(ethylene glycol) ist giftig. Bitte lesen Sie MSDS, bevor Sie mit dieser Lösung arbeiten. Sicherheitseinrichtungen muss getragen werden, beim Umgang mit der Chemikalie.
  2. Tauchen Sie die Substrate in einem 10 mM (Nr.3) Co2 wässriger Lösung für 5 min. Als nächstes Entfernen der Substrate aus der Projektmappe, dreimal mit Reinstwasser waschen und trocken unter einem Strom von trockenem Stickstoff.
    Achtung: Co (Nr.3)2 ist giftig. Bitte lesen Sie MSDS, bevor Sie mit dieser Lösung arbeiten. Sicherheitseinrichtungen muss getragen werden, beim Umgang mit der Chemikalie.
  3. Tauchen Sie das Substrat in einer 50 µg/mL Lösung von Fibronektin in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie bei 4 ° C für 16 h das Substrat dreimal mit PBS waschen, dann trocknen Sie das Substrat unter einem Strom von trockenem Stickstoff.
    Hinweis: Fibronektin ist MHA funktionalisiert Bereiche durch Chelat von Co(II) terminal Carbonsäure-Gruppen auf den MHA gebunden. Fibronektin bindet dann an Co(II) über die Kollagen-bindende Domäne. 23
  4. Falls gewünscht, visualisieren Sie die Oberfläche gebundene Fibronektin durch Kennzeichnung es mit fluoreszierenden Antikörpern:
    1. Eine 2 mL Lösung von 1: 100 unconjugated Kaninchen Anti-Fibronektin Primärantikörper in 5 % (w/V) von Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer auf die Oberfläche auftragen und brüten bei 4 ° C für 16 h Aspirat überstand und dreimal mit PBS waschen.
    2. Tauchen Sie das Substrat in einer 2 mL Lösung von eindringmittel konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (bei den Hersteller angegebene Verdünnung, 2 Tropfen/mL) in 5 % (w/V) der BSA in PBS, in Alufolie abdecken und Inkubation bei Raumtemperatur 1 Stunde Absaugen der überstand und dreimal mit PBS waschen.
    3. Rekord die Epifluoreszenz mikroskopie Bilder der Funktionen mit einem Fluoreszenzmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Erregung Filter gesetzt, 594 nm.

(8) Zellkultur auf Nanofabricated Oberflächen

  1. Bereiten Sie eine Suspension von gut charakterisierten hMSCs, die zwischen der 4th und 6th Passage sind. 24
    1. Anhalten ein konfluierende Fläschchen der Zellen durch Spülen einmal mit 10 mL PBS, distanzieren eingehalten Zellen durch Zugabe von 5 mL Trypsin/EDTA in den T75 Gewebekultur Kolben und inkubieren Sie die Flasche in eine Feuchte Kammer bei 37 ° C mit 5 % CO2 für bis zu 5 min bis 90 % o ergänzt f-Zellen werden von Oberfläche getrennt.
    2. Anschließend geben Sie 6 mL frische Nährmedien mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS) in der Flasche hinzu und kurz spülen Sie die Flasche mit den Medien hinzugefügt. Übertragen Sie Zellsuspension in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 400 g bei 25 ° C für 5 min.
    3. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen Zelle Pellet in 3 mL frische Nährmedien.
    4. Zählen Sie die Zelldichte mit einem Hemocytometer25 und passen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 2 x 104 Zellen/mL durch die Zugabe von einem entsprechenden Volumen von Nährmedien.
  2. Samen der Zellen auf Substraten bei einer Dichte von 104 Zellen/cm2.
    1. Schneiden Sie das Substrat in 1 x 1 cm2 mit Diamant-Schreiber und legen Sie sie in einen Brunnen in Gewebekultur 12-Well-Platte.
    2. Pipette 2 mL Zellsuspension in Kulturmedien (aus Schritt 8.1.4) in den Brunnen und inkubieren Sie in eine Feuchte Kammer bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 24 h ergänzt.
  3. Analysieren Sie nach Zellwachstum auf die Muster das Ausmaß der Zellhaftung und Verbreitung durch Immunfluoreszenz:
    1. Entfernen von Medien und Substrate einmal mit PBS waschen. Befestigen Sie Zellen mit 2 mL einer Lösung von 4 % Paraformaldehyd in PBS (vorgewärmt auf 37 ° C) für 20 min in Abzug und dreimal mit PBS waschen.
      Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Bitte lesen Sie MSDS, bevor Sie mit dieser Lösung arbeiten. Sicherheitseinrichtungen muss getragen werden, beim Umgang mit der Chemikalie.
    2. Permeabilize der Zellen mit 2 mL einer Lösung von 0,5 % Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) mit PBS-Puffer für 15 min, dann dreimal mit PBS waschen.
    3. Tauchen Sie das Substrat in 2 mL einer Lösung von unconjugated Kaninchen Anti-Fibronektin Primärantikörper Verdünnung von 1: 100 mit 5 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer und bei 4 ° C für 16 h inkubieren Sie, dann waschen Sie dreimal mit 0,1 % (V/V) Tween 20 in PBS (PBST).
    4. Anschließend Tauchen Sie das Substrat in 2 mL einer Lösung von eindringmittel konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (mit 5 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer des Herstellers angegebenen Verdünnung, 2 Tropfen/mL verdünnt), in Alufolie decken Sie ab und bei 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dann waschen Sie dreimal mit 0,1 % PBST.
    5. Actinfilamente beschriften, Tauchen Sie 2 mL eindringmittel konjugierte Phalloidin bei einer Verdünnung von 1: 250 mit PBS-Puffer, in Alufolie decken Sie ab und bei 4 ° C für 30 min inkubieren Sie, dann waschen Sie dreimal mit PBS.
    6. Gleichzeitig färben Sie Zellkerne und montieren Sie das Substrat durch die Anwendung eines Tropfen Montage mittlerer mit DAPI und mit einem Deckglas abdecken.
  4. Visualisieren Sie Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Erregung Filter von 365 nm Kerne (DAPI), 488 nm für F-Aktin und 594 nm für Fibronektin.

Representative Results

Um zu prüfen, ob die automatische Ausrichtung erfolgreich gewesen war, wurden die Graphen geplottet von Achsdaten (in der Tabelle aus Schritt 4.8) untersucht. Wo der Alignment-Prozess erfolgreich waren zeigte zwei Grundstücke, entspricht dem Winkel, den Probentisch θ und φ Achsen gekippt worden hat, eine Reihe von steigend und absteigend Datenpunkte. In jedem der Grundstücke, zwei lineare passt der Datenpunkte zeigte eine klar definierte Intersect "Peak" zeigt die maximale Z-Erweiterung und den entsprechenden Winkel mit der Ausrichtung wurde erreicht (Abb. 4A und 4 b). Dieser Vorgang wird wiederholt vier Mal (d.h., zweimal für jede Achse) und als ein Satz von vier Koordinaten dargestellt. Der Schnittpunkt der jedes Paar von Koordinaten zeigt also die insgesamt optimalen Winkel (Abbildung 4). 13 in Fällen, in denen die Ausrichtung nicht erfolgreich war, ist festzustellen, dass ihre entsprechenden θ und φ Winkel Plots keine gute Qualität linear passt geben, oder sich nicht (Abbildung 5 überschneiden). Solche fehlerhaften Achsen sind in der Regel durch die Arrays nicht richtig getrimmt oder an Sondenhalter (Schritte 1,7, 1,8 und 2,2) montiert wird. In diesen Fällen die Arrays wurden verworfen und eine neue vorbereitet und montiert (Schritte 1 und 2) und der Alignment-Prozess wiederholt (Schritt 4).

Nach der erfolgreichen Ausrichtung und Lithographie mit MHA von PPL wurden dann gemusterten gold Substrate abgebildet mit Querkraft Mikroskopie um zu prüfen, ob die Ablagerung stattgefunden hatte. Eine größeren Bereich Prüfung die bedruckten Flächen führte auch optische Mikroskopie der Substrate nach der Beanspruchung des Goldes nicht geschützt durch die hinterlegten Thiol (Abbildung 6 und Abbildung 7). Jedoch die geätzte Muster können nicht verwendet werden, für weitere Funktionalisierung und sollte nur zur Musterung auf repräsentative Proben einer Charge von bedruckten Oberfläche Substraten zu bestätigen. Wenn die geätzte Muster zeigen leere Bereiche entsprechend Einzelbuchten (Abbildung 8), zeigt dieses Ergebnis, dass die Produktion der Sonde Arrays nicht erfolgreich durchgeführt wurde, und dass einige Sonden fehlen oder beschädigt sind. Diese Inhomogenität der Sonden möglicherweise durch den Einsatz eines alten Meisters, wo die perfluorierte Beschichtung hat abgetragen (Schritt 1.3), wodurch einige Sonden losgerissenen wenn das Array vom Master getrennt ist. In diesen Fällen sollte ein neues Master verwendet werden. Das Ergebnis kann auch durch die Anwesenheit von Luft sein, Luftblasen zwischen dem Glas Unterstützung und dem Master (Schritt 1.5) gefangen, oder wenn das Array Sonde nicht sauber vom Master getrennt wurde nach dem Aushärten (Schritt 1,8).

Fluoreszierende Mikroskopie Bilder der Fibronektin funktionalisiert Oberflächen inkubierten hMSCs auch waren gesammelt (Abbildung 9). In der Regel alle Substrate wurden in der in-vitro- Kultur Umwelt stabil und die Zellen eingehalten und ihre Morphologie der gedruckten Muster bei kleineren isolierten 20 x 20-Palette von Funktionen angepasst.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Polymer-Stift-Lithographie zeigt Molekulare Tinte Transport über ein Wasser-Meniskus auf Sondenspitze. (A) Seitenansicht und (B) Draufsicht auf das Polymer-Stift-Array anzugeben, wenn die Sonde Array und Oberfläche Substrat vollständig ausgerichtet sind, die Sonden gleichzeitig in Kontakt mit der Oberfläche kommen wiederum parallelisierte Lithographie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Polymer-Stift-Lithographie einrichten (A) erweiterte Seitenansicht des experimentellen einrichten wo bereit Sonde Array Sonde Halter befestigt und AFM-Scanner montiert. Das Substrat ist auf der Bühne platziert, unter dem sich befinden die drei Kraftsensoren. (B) eine Darstellung der montierten Instrumentierung, zeigt die AFM-Scan-Kopf im Verhältnis zu dem Probentisch. (C) Untersicht, Kraft-Sensor Standort anzeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Schematische Darstellung zeigt die Spektroskopie-Programm für die Ausrichtung Verfahren. Die AFM-Scanner soll die Sonden auf Probe durch einen Abstand von 10 µm innerhalb von 100 ms, gehalten an Position für 250 ms, gefolgt von einer Rücknahme von 10 µm innerhalb von 100 ms, und hielt dann für 250 ms bei der eingefahrenen Position bewegen. Die Bewegung wird dann während der Alignment-Prozess wiederholt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Diagramme zur Veranschaulichung einer erfolgreichen Ausrichtung. Graphen von Z-Position gegen die Neigung Winkel (A) θ und φ (B) für eine erfolgreiche Ausrichtung, wobei ● angibt, die tatsächlichen Werte gemessen und + zeigt die besten passen mit der Methode der kleinsten Quadrate. (C) Graph von φ gegen θ ausgestattet Winkel mit den vier Punkten, wo die maximale Z-Position erreicht wurde. Der Schnittpunkt markiert ist der endgültige optimalen Neigungswinkel über beide Achsen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Diagramme zur Veranschaulichung einer erfolglosen Achse. Graphen von Z-Position gegen die Neigung Winkel (A) θ und φ (B) für eine erfolglose Ausrichtung, wobei ● angibt, die tatsächlichen Werte gemessen und + zeigt die besten passen mit der Methode der kleinsten Quadrate. (C) Graph von φ gegen θ ausgestattet Winkel mit den vier Punkten, wo die maximale Z-Position erreicht wurde. Keine klare Optima oder Schnittpunkt eingehalten werden und somit die optimale Ausrichtung-Winkel sind nicht gelöst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Illustrative optische Mikroskopie und Rasterkraftmikroskop Mikroskopie Bilder gold Substrate, die durch die ausgerichteten PPL-Arrays mit MHA gemustert und dann geätzt wurden. (A) und (B) sind sequentiell vergrößerten optische Mikroskopie Bilder der geätzte Muster; (C) ist ein AFM-Topographie-Bild aus einem einzigen Gitter Muster. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7. Illustrative optische Mikroskopie Bilder gold Substrate, die durch die ausgerichteten PPL-Arrays mit MHA gemustert und dann geätzt wurden. (A) und (B) sind sequentiell vergrößerten optische Mikroskopie Bilder von geätzten Mustern und (C) ist eine Niedrigerere Vergrößerung Bild, die großflächige homogenen Muster anzeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Illustrative optische Mikroskopie Bild von einem gold Substrat, die ungleichmäßig mit MHA gemustert und dann geätzt wurde. Die vorgesehenen Muster (gezeigt im Einschub) wurden wiederholt Gitter 20 Punkt-Linien angeordnet 20 Zeilen, mit jeder zwei Linien produziert durch die Erhöhung der Z-Achse Verlängerung um 1 µm (zwischen 5 und-5 µm). Es ist ersichtlich, dass in einigen Bereichen keine Muster, aufgrund der fehlenden Sonden in diesen Orten erzeugt werden. In den Bereichen, wo nur zwei Zeilen von Punkten hergestellt werden, dieses Ergebnis zeigt, dass eine Sonde vorhanden ist aber es ist nicht die gleiche Höhe wie die voll funktionsfähigen Sonden so nur Kaution verfügt über, wenn das Array auf die volle Zerweitert wird-Achsabstand. In diesem Bild ist der Kontrast absichtlich verändert worden, um Beobachtung der teilweise bedruckten Bereiche zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9. Epifluoreszenz mikroskopie Bilder von kultiviert in den vorgefertigten Fibronektin-Arrays von PPL hMSCs. (A) und (B) sind hohe Vergrößerung Bilder zeigen einzelne Zellen. (C) zeigt einer Beispiel-Muster des Fibronektin Arrays ohne Anhänger Zell- und (D) ist ein weites Feldbild der Zellen in einem Raster-Arrangement (eine schematische Darstellung des gedruckten Muster zeigt auch in das Inlay) kultiviert. Die Zellen sind zum Anzeigen von Fibronektin (rot), F-Aktin (grün) und Zellkerne (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Dieses Protokoll dient den Benutzern eine praktische Methodik für schnell nanolithographischer Musterung mit hohe Gleichmäßigkeit und steuerbare Strukturgröße über große Gebiete (cm2). Substrate, wobei diese großflächigen Nanopatterns können dann für eine Vielzahl von Anwendungen weiter ausgearbeitet werden. Eine wichtige Anwendung dieser Technologie ist bei der Erzeugung von Nanofabricated Oberflächen zur Zelloberfläche Wechselwirkungsstudien. Dieser Bericht zeigt einige Beispiele für Zellkultur auf diese Materialien zeigen, Kontrolle der Stammzellenreserve Morphologie von Nanofabricated Substraten.

Die wichtigste Voraussetzung dieses Protokolls ist die Automatisierung des Verfahrens Ausrichtung (Schritt 4), die sehr einheitlich und Hochdurchsatz-Herstellung von Funktionen auf Flächen bis zu nanoskaligen Auflösung ermöglicht ermöglicht den schnellen Umsatz von Zellexperimente Kultur. Die Polymer-Stift-Lithographie mit dieser Ausrichtung-Algorithmus durchgeführt ist in der Lage, nanoskaligen Funktionen innerhalb von ca. 30 min zu generieren. Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der automatischen Ausrichtung, und damit die Einheitlichkeit der angeordneten Elementen, entsteht jedoch kritisch abhängig von der Qualität der Sonde Arrays, die sind (Schritt 1 und 2). Mängel in der Vorbereitung, die stumpfen, defekte oder fehlende Sonden zur Folge haben; wie eingeschlossene Luft kann ungenaue Ausrichtung und schlechter Qualität Lithographie Bläschen (Schritt 1.5) oder unsachgemäße Trennung der Sonden vom Master (Schritt 1,8) führen.

Dies berichtet, dass die Methode eine Einschränkung gemeinsam mit anderen Ausrichtmethoden teilt, die auf Force-Feedback angewiesen. Die genaue Bestimmung der wenn die Sonden in Kontakt mit der Oberfläche sind wird durch die Notwendigkeit entfallen Hintergrund Erschütterungen durch die Umgebung und die Bewegung der Probe-Bühne eingeschränkt. In der Regel die Sensoren haben eine kraftempfindlichkeit des µN Regimes (2 µN in diesem Fall), aber die Ausrichtung-Algorithmus soll nur eine Kraft von mindestens 490 µN als definitive Kontakt zwischen den Sonden und der Oberfläche zu registrieren, um "false Positives" Frühjahrsputz zu vermeiden Ting von Hintergrundgeräuschen. 13 so, diese Methode tendenziell große Funktionen (1-2 µm) produzieren da die Sonden müssen verlängert einen großen Abstand auf der Z-Achse (mit einer daraus resultierenden höheren Kraft) um Kontakt zu registrieren. Um zu kompensieren, können kleinere Features erzeugt werden, durch die Reduzierung der Z-Achse zurückgelegte Strecke während der Lithographie Schritt (z.B.Eintritt in die "Schwarzen" Einstellung im Schritt 5.2.3.2. als 3 µm statt 5 µm).

Dennoch, auch mit dieser Einschränkung der Automatisierung-Algorithmus ist in der Lage, einen wichtigen Aspekt bei der Anwendung der parallelisierte Sonde Lithographie Scanmethoden, Adresse wie Ausrichtung bisher am meisten anspruchsvollen und ungenau Zeitschritt in der Umsetzung dieser Techniken. Diese Automatisierung jetzt verlagert sich die Bandbreitenbegrenzung Schritt den Fertigungsprozess von der Achse auf die Lithographische Schreiben selbst. Während dieses Protokolls über die Anwendung dieses Verfahrens Ausrichtung auf PPL zeigt, könnte eine Reihe von SPL-Techniken wie Lipid-DPN26 und Matrix-gestützte Lithografie27 sowie mögliche Zukunft katalytische Rahmen zugewiesen werden Tastsysteme. 28

Disclosures

Die Ausrichtung Algorithmus von entwickelt wurden, und Software sind Eigentum von der University of Manchester. Es ist zum Download unter http://www.click2go.umip.com/ zur Verfügung.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich die UK Engineering and Physical Sciences Research Council (Refs zu gewähren. EP/K011685/1, EP/K024485/1) und ein Diplom Zugehörigkeit zur JH; die Leverhulme Trust (RPG-2014-292); der Wellcome Trust institutionellen strategischen Unterstützungsfonds (105610/Z/14/Z); der British Council (216196834); und der University of Manchester für die Universität von Manchester Research Institute (UMRI Pumpe Ansaugen Fonds) und eine Presidential Promotionsstipendium, SW. technische Unterstützung durch Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) ist auch dankbar anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

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Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien
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Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

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