Samtidig måling av Superoxide/Hydrogen Peroxide og NADH produksjon av Flavin inneholder mitokondrie Dehydrogenases
Summary
Mitokondrier inneholder flere flavin-avhengige enzymer som kan produsere reaktive oksygen arter (ROS). Overvåking ROS er utgivelse fra enkeltområder i mitokondrier utfordrende på grunn av uønskede siden reaksjoner. Vi presenterer en enkel og rimelig metode for direkte vurdering av innfødte priser for ROS utgivelsen renset flavoenzymes og microplate fluorometry.
Abstract
Det har blitt rapportert at mitokondrier kan inneholde opptil 12 enzymatisk kilder til reaktive oksygen arter (ROS). Et flertall av disse områdene omfatter flavin-avhengige åndedretts komplekser og dehydrogenases som produserer en blanding av superoxide (O2● –) og hydrogen peroxide (H2O2). Nøyaktig kvantifisering av ROS produserer potensialet for enkeltområder i isolerte mitokondrier kan være utfordrende fordi antioksidant forsvarssystemer og siden reaksjoner som også O2● –h2O2. Bruk av uspesifikke hemmere som kan forstyrre mitokondrie bioenergi kan også skade målinger ved å endre ROS utgivelse fra andre områder i produksjonen. Her presenterer vi en enkel metode for samtidig måling av H2O2 løslate og nikotinamid adenine dinucleotide (NADH) produksjon av renset flavin knyttet dehydrogenases. For vårt formål her, har vi brukt renset pyruvate dehydrogenase kompleks (PDHC) og α-ketoglutarate dehydrogenase komplekse (KGDHC) av svin hjertet opprinnelse som eksempler. Denne metoden gir et nøyaktig mål på innfødt H2O2 utgivelse priser av individuelle områder av produksjonen ved å eliminere andre potensielle kilder av ROS og antioksidant. I tillegg gir denne metoden en direkte sammenligning av forholdet mellom H2O2 løslate og enzym aktivitet og screening av effektiviteten og selektivitet av hemmere for ROS produksjon. Samlet kan denne tilnærmingen gi detaljert vurdering av innfødte priser av ROS versjonen for individuelle enzymer før gjennomføre mer sofistikert eksperimenter med isolert mitokondrier eller permeabilized muskel fiber.
Introduction
Det endelige målet med metabolisme til næringsstoff er å gjøre adenosin trifosfat (ATP). I pattedyrceller skjer dette i mitokondrier, dobbel-membraned organelles som konverterer energi lagret i karbon til ATP. Produksjon av ATP begynner når carbon er forbrenning av mitokondrier danner to elektron bærere, NADH og flavin adenine dinucleotide (FADH2)1. NADH og FADH2 er deretter oksidert av flere delenhet åndedretts komplekser I og II, henholdsvis, og frigjort elektronene er fraktet til terminal elektron acceptor molekylær oksygen (O2) på komplekse IV1. Thermodynamically gunstige “nedover” overføring av elektroner til O2 på slutten av kjeden er koplet til eksport av protoner til intermembrane plass av komplekser jeg, III og IV. Dette skaper en transmembrane elektrokjemiske gradering av protoner (proton motiv kraft), en midlertidig form for Gibbs fri energi som er tappet av komplekse V lage ATP2. Elektron overføring reaksjoner i mitokondrier er ikke perfekt er kombinert til ATP produksjonen. På forskjellige steder i Krebs syklus og respiratoriske kjeden, kan elektroner tidlig samhandle med O2 skjemaet ROS3. Biologisk relevante ROS generert av mitokondrier er O2●- og H2O2. Selv om O2● – ofte proksimale ROS av mitokondrier, er det nå tydelig at nettsteder produksjon danne en blanding av O2●- og H2O2, som er forbundet med gratis radikale kjemi av flavin protese grupper4,5. På høye nivåer, kan ROS være farlig, skade biologiske bestanddeler kreves for celle-funksjonen som resulterer i oksidativt nød6. Men på små mengder oppfylle mitokondrie ROS viktig signalnettverk funksjoner. For eksempel har H2O2 utgivelse fra mitokondrier vært innblandet i å kontrollere T-celle aktivering, stress signalering (f.eks, induksjon av Nrf2 signalveier), induksjon av celle spredning og differensiering, insulin signalering og utgivelsen og fôring atferd7. Betydelig fremgang har blitt gjort forstå signalnettverk funksjon av ROS. Imidlertid viktig spørsmål fortsatt i forhold som enzymer i mitokondrier tjene som de viktigste kildene og hvordan produksjon er kontrollert.
ROS utgivelsen av et nettsted produksjon avhenger av flere faktorer: 1) konsentrasjonen av elektron donerer området, 2) redoks staten elektron donerer området, 3) tilgang til oksygen, og 4) den konsentrasjon og type oksidasjon substrat3, 8 , 9. i mitokondrier, andre faktorer som konsentrasjonen av NADH og membran potensielle styrke også påvirke ROS produksjon8,10. For eksempel øker hastigheten på O2●/H2O2 produksjon av renset PDHC eller KGDHC med økende NADH tilgjengelighet5,11. I dette scenariet strømme elektroner bakover fra NADH til Kjepphest center i E3 delenhet i PDHC eller KGDHC, stedet forO2● –h2O2 produksjon12. Tilsvarende har levering av NAD+ motsatt effekt, redusere ROS utgivelse fra KGDHC12. Dermed kan kontroll inngang eller utgang av elektroner fra nettsteder ROS produksjon endrehvor mye O2● –h2O2 er dannet. For eksempel blokkerer E2 delenhet i PDHC eller KGDHC med CPI-613 en lipoic syre analog, resulterer i en nesten 90% nedgang i O2● –h2O2 produksjon13. Lignende resultater kan oppnås med kjemiske S-glutathionylation katalysatorer, diamide og disulfiram, som nesten avskaffe O2●/H2O2 produksjon av PDHC eller KGDHC via Bøyning av glutation på e 2 delenhet14. The trade-off for blokkering elektron strømme gjennom E2 delenhet i PDHC og KGDHC er en nedgang i NADH produksjon som reduserer ROS dannelsen av elektronet transportkjeden (f.ekskomplekse III). Dette kan også redusere ATP produksjonen av elektronet transportkjeden. Samlet kan blokkerer elektron inngang til områder av ROS produksjon være en svært effektiv metode for å kontrollere O2● –h2O2 produksjon.
Mitokondrier kan inneholde opptil 12 potensielle O2● –h2O2 kilder6. De fleste av disse nettstedene er flavin inneholder enzymer som genererer en blanding av O2●- og H2O2. Bruk av ulike substrat og hemmer kombinasjoner har tillatt for identifikasjon som åndedretts komplekser og mitokondrie dehydrogenases tjene somhøy kapasitet O2● –h2O2 danner områder i forskjellige vev3. PDHC og KGDHC har vist seg å fungere som høy kapasitetO2● –h2O2 utslipp områder i muskler og leveren mitokondrier13,15. Beholdes imidlertid noen problemer i forhold til undersøkelse av O2● –h2O2 danner potensielle for enkeltområder i mitokondrier og virkningen som er ulike substrat og hemmer kombinasjoner på aktiviteter enzymer. Dette er på grunn av tilstedeværelsen av uønskede side reaksjoner (f.eks, dannelsen avO2● –h2O2 av nettsteder enn enzymet rundt), forurensende endogene næringsstoffer (f.eksfatty syrer) eller organeller (f.eks, peroxisomes også danner O2● –h2O2), og bruk av hemmere som mangler selektivitet og/eller bruk av forbindelser som ikke fullt den ROS produksjon. Visse hemmere kan også forandre mitokondrie bioenergi og retningen på elektron, og dette endrer ROS utgivelsen fra andre nettsteder av produksjon og forundrer resultater. Absolutt priser for O2● –h2O2 utgivelse fra enkeltområder i mitokondrier er også vanskelig å kvantifisere på grunn av den høye konsentrasjonen av O2●- og H2O2 eliminere enzymer i feltet matrise og intermembrane. Derfor kan eliminering av noen konkurrerende reaksjoner som kan forstyrre O2● –h2O2 løslate målinger være nyttig å identifiserehøykapasitets O2● –h2O2 danner nettsteder.
Her presenterer vi en enkel metode som tillater samtidig undersøkelse av O2● –h2O2 produksjon og NADH dannelse av renset flavin-avhengige dehydrogenases. Ved hjelp av renset enzymer, kan uønsket ROS danner siden reaksjoner og ROS nedverdigende enzymer fjernes slik at en mer nøyaktig måling av innfødte O2● –h2O2 produksjon priser for individuelle flavoenzymes. Denne metoden kan brukes til direkte sammenligne den O2● –h2O2 danner kapasitet av ulike renset dehydrogenases eller skjermen potensielle områdespesifikke hemmere forO2● –h2O 2 utgivelse. Til slutt, måle O2● –h2O2 og NADH Produksjonen samtidig kan gi en sanntids vurdering av forholdet mellom enzym aktivitet og ROS utgivelsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er fordelaktig siden, 1) eliminerer noen konkurrerende reaksjoner som kan ellers forstyrre H2O2 gjenkjenning (f.eks, antioksidant systemer eller andre kilder til ROS), 2) gir en direkte vurdering av innfødte hastigheten på ROS utgivelsen av en flavin inneholder mitokondrie dehydrogenase, 3) tillater sammenligning av innfødte ROS utgivelsen av to eller flere renset flavin-baserte dehydrogenases, 4) kan gi en direkte sammenligning av hastigheten på ROS utgivelsen og enzy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada (NSERC). Video produksjon ble gjennomført i samarbeid med senter for innovasjon i undervisning og læring (CITL) på Memorial University Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
