Одновременное измерение супероксид/водорода пероксида и НАДН производства флавинсодержащих митохондриальной дегидрогеназ
Summary
Митохондрии содержат несколько Флавин зависимых ферментов, которые могут производить реактивнооксигенных видов (ров). Мониторинг ROS освобождение от отдельных участков в митохондриях является сложной задачей вследствие нежелательных побочных реакций. Мы представляем простой, недорогой метод для прямой оценки родной ставок для выпуска ROS, используя чистые flavoenzymes и микроплиты флюометрия.
Abstract
Сообщается, что митохондрий может содержать до 12 ферментативные источники реактивнооксигенных видов (ров). Большинство из этих сайтов включают Флавин зависимых дыхательных комплексов и дегидрогеназ, которые производят смесь супероксида (O2● –) и пероксида водорода (H2O2). Точная количественная оценка производства рос потенциал отдельных участков в изолированных митохондриях может быть сложным из-за присутствия антиоксидантных систем обороны и побочных реакций, которые также образуют O2●-/ h2O2. Использование неспецифические ингибиторы, которые могут нарушить митохондриальной биоэнергетики также может скомпрометировать измерений, изменяя ROS релиз от других мест производства. Здесь мы представляем простой метод для одновременного измерения H2O2 выпуска и Никотинамидадениндинуклеотид (NADH) производства, очищенный дегидрогеназ, Флавин связаны. Для наших целей здесь мы использовали очищенный пируват дегидрогеназа комплекс (PDHC) и альфа-кетоглутарата дегидрогеназа комплекс (KGDHC), свинину сердце происхождения в качестве примеров. Этот метод позволяет точное измерение родной H2O2 релиз ставок на отдельных участках производства путем устранения других потенциальных источников рос и антиоксидантной систем. Кроме того этот метод позволяет для прямого сравнения отношений между H2O2 выпуска и ферментативной активности и проверки эффективности и избирательности ингибиторов для производства рос. В целом такой подход может позволить для углубленной оценки родной темпы рос выпуска для отдельных ферментов до более сложных экспериментов с изолированных митохондриях или permeabilized мышечные волокна.
Introduction
Конечная цель обмена питательных веществ, чтобы аденозинтрифосфатом (АТФ). В mammalian клетках это происходит в митохондриях, двойной membraned органеллы, которые преобразуют энергию, запасенную в углерода в СПС. Начинается производство АТФ когда углерода сжигается в митохондриях, образуя два электрона перевозчиков, NADH и флавин аденин динуклеотид (ГВС2)1. NADH и ГВС2 затем окисляются, мульти Субблок дыхательных комплексов I и II, соответственно, и освобожденных электроны пролетах до терминала электрон акцептора молекулярного кислорода (2O) в комплекс IV1. Термодинамически благоприятные «спуск» передачи электронов2 O в конце цепи соединен к экспорту протонов в intermembrane пространство комплексы I, III и IV. Это создает градиент трансмембранных электрохимических протонов (Протон движущей силой), временная форма свободная энергия Гиббса, что постучал в комплекс V чтобы СПС2. Реакции переноса электрона в митохондриях не соединены идеально для производства АТФ. На различных этапах цикла Кребса и дыхательной цепи электроны могут преждевременно взаимодействовать с O2 к форме рос3. O2● – и H2O2наиболее биологически соответствующих ROS, порожденных митохондрий. Хотя O2● – часто считается проксимальной ROS, образованный митохондрий, очевидно теперь сайты производства образуют смесь O2● – и H2O2, который связан с бесплатно радикальные химии Флавин протезов группы4,5. На высоком уровне рос может быть опасным, повреждения биологических компонентов, необходимых для функции клеток, что приводит к окислительным дистресс6. Однако в низкой суммы, митохондриальных ROS выполнять жизненно важные функции сигнализации. Например H2O2 выхода из митохондрий было вовлечено в управление активации Т-клеток, стресс сигнализации (например, индукции Nrf2 сигнальных путей), индукции пролиферации и дифференцировки, Инсулин сигнализации и релиз и кормление поведение7. Значительный прогресс был достигнут в понимании сигнальные функции рос. Однако важные вопросы все еще остаются в отношении которой ферментов митохондрий служат наиболее важными источниками и как контролируется производства.
ROS релиза на веб-сайте производства зависит от нескольких факторов: 1) концентрация жертвуя электрон, 2 редокс состояние электрона пожертвования сайта, 3) доступ кислорода, и 4 концентрации и тип окислением субстрата3, сайта 8 , 9. в митохондриях, другие факторы, как концентрация NADH и мембранный потенциал силы также влияют ROS производства8,10. Например уровень O2●-/ h2O2 производства очищенной PDHC или KGDHC увеличивается с растущей NADH доступности5,11. В этом случае электроны текут назад от НАДН в Причуды центр E3 субъединица PDHC или KGDHC, на сайте O2●-/ h2O2 производства12. Аналогично предоставление NAD+ имеет противоположный эффект, уменьшение ROS освобождение от KGDHC12. Таким образом контроль входа или выхода электронов от мест его производства Рос может изменить, сколько O2●-/ h2O2 образуется. Например блокирование субъединица2 E PDHC или KGDHC с ИПЦ-613, липоевая кислота, аналоговый, результаты в почти 90% снижение O2●-/ h2O2 производство13. Аналогичные результаты могут быть получены с химической S-glutathionylation катализаторов, diamide и Дисульфирам, которые почти упразднить O2●-/ h2O2 производства PDHC или KGDHC через глагольных форм глутатиона на E 2 субъединицы14. Компромисс для блокирования потока электронов через субъединица2 E PDHC и KGDHC – это снижение производства NADH, которая уменьшает образование рос по электрон-транспортной цепи (например, комплекс III). Это также может снизить выход АТФ, электрон-транспортной цепи. В целом блокирование электрона вход к местам производства Рос может быть весьма эффективным средством контроля над O2●-/ h2O2 производства.
Митохондрии может содержать до 12 потенциальных O2●-/ h2O2 источники6. Большинство из этих сайтов, Флавин содержащие ферменты, которые генерируют смесь O2● – и H2O2. Использование различных субстрата и комбинации ингибитора позволили для идентификации которых дыхательных комплексов и митохондриальной дегидрогеназ служить высокой емкости O2●-/ h2O2 формирования участков в 3различных тканей. Было показано, что PDHC и KGDHC служить высокой емкости O2●-/ h2O2 излучающих сайтов в мышцах и печени митохондрий13,15. Однако остаются некоторые трудности в отношении рассмотрения O2●-/ h2O2 образующих потенциал отдельных участков в митохондриях и влияния, которые различные субстрата и комбинации ингибитора на деятельность ферментов. Это связано с наличием нежелательных побочных реакций (например, формирование O2●-/ h2O2 сайтов помимо фермента интерес), загрязняя эндогенного питательных веществ (например,жирные кислоты) или органеллы (например, пероксисомы, которые также образуют O2●-/ h2O2) и использование ингибиторов, которые отсутствие избирательности, и/или использование соединений, которые не полностью тормозят производство рос. Некоторые ингибиторы могут также изменить митохондриальной биоэнергетики и направление потока электронов, и это изменяет ROS релиз от других мест производства и смешивает результаты. Абсолютная тарифы заO2●-/ h2O2 релиз от отдельных участков в митохондриях также трудно определить из-за высокой концентрации O2● – и H2O2 ликвидация ферментов в матрицу и intermembrane пространстве. Таким образом ликвидация любых конкурирующих реакций, которые могут мешать O2●-/ h2O2 релиз измерений могут быть полезны при определении высокой емкости O2●-/ h2O2 формирование сайтов.
Здесь мы представляем простой метод, который позволяет одновременное рассмотрение O2●-/ h2O2 производство и формирование NADH, очищенный дегидрогеназ Флавин зависимых. С помощью очищенные ферменты, нежелательные ROS, образуя побочных реакций и рос, унижающего достоинство ферменты могут быть устранены позволяет для более точного измерения родной O2●-/ h2O2 производства ставок для отдельных flavoenzymes. Этот метод может использоваться непосредственно сравнивать O2●-/ h2O2 формирования потенциала различных очищенный дегидрогеназ или потенциальным участкам ингибиторы экрана O2●-/ h2O выпуск 2 . Наконец измерения O2●-/ h2O2 и НАДН производства одновременно может позволить для реального времени оценки взаимосвязи между ферментативной активности и способности релиз рос.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является выгодным с, 1) он устраняет любую конкурирующих реакций, которые могут иным образом вмешиваться H2O2 обнаружения (например, антиоксидантных систем или других источников ROS), 2) обеспечивает прямую оценку родной скорости ROS освободить флавинсодержащи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ). Видео производства была проведена в сотрудничестве с центром для инноваций в области преподавания и обучения (НРЖОС) в Мемориальном университете Ньюфаундленда.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
