Summary
Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.
Abstract
A retina é um tecido complexo que inicia e integra os primeiros passos da visão. Disfunção das células da retina é uma marca registrada de muitas doenças ofuscante, e terapias futuras dependem de entendimentos fundamentais sobre como diferentes da retina células funcionam normalmente. Ganhar essa informação com métodos bioquímicos provou difícil porque as contribuições dos tipos de célula específica são diminuídas no meio de células da retina. Imagem da retina ao vivo pode fornecer uma visão dos numerosos processos biológicos em nível subcelular, graças a um número crescente de biosensores fluorescentes geneticamente codificados. No entanto, esta técnica tem sido limitada a girinos e larvas de peixe-zebra, as camadas da retina ultraperiféricas da retina isolada, ou imagens de resolução mais baixa da retina em animais vivos. Aqui nós apresentamos um método para gerar ao vivo ex vivo da retina fatias de adultos do zebrafish para geração de imagens ao vivo através de microscopia confocal. Esta preparação rende fatias transversais com todas as camadas da retina e a maioria dos tipos de células visíveis para a realização de experimentos de imagiologia confocal usando a perfusão. Zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes ou biossensores em tipos específicos de células da retina ou organelas são usados para extrair informação de célula única de uma retina intacta. Além disso, as fatias da retina podem ser carregadas com corantes fluorescentes indicador, adicionando à versatilidade do método. Este protocolo foi desenvolvido para imagem Ca2 + dentro do zebrafish cones fotorreceptores, mas com marcadores adequadas poderia ser adaptado para medir Ca2 + ou metabolitos em células Müller, células bipolares e horizontais, micróglia, células de amacrine ou da retina células ganglionares. O epithelium retinal do pigment é removido do fatias assim que este método não é adequado para estudar esse tipo de célula. Com prática, é possível gerar seriais fatias de um animal para múltiplas experiências. Esta técnica adaptável fornece uma ferramenta poderosa para responder às muitas perguntas sobre biologia celular da retina, Ca2 +e homeostase de energia.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) tem-se amplamente utilizado em pesquisa científica básica e médica1, devido ao seu tamanho pequeno, rápido desenvolvimento e sistemas de órgãos de vertebrados. A transparência natural das larvas de zebrafish combinada com métodos estabelecidos por transgênese permitiram a visualização detalhada dos processos celulares em um animal vivo. Um número de biosensores fluorescentes geneticamente codificados têm sido alvo de células específicas do zebrafish para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrogênio3, apoptotic ativação4 e ATP5.
Na vivo por imagens do zebrafish larvas conduziu a descobertas no campo da neurociência, incluindo o mapeamento do cérebro circuitos6 e7de distúrbios do desenvolvimento de drogas para o sistema nervoso central. Zebrafish são adequados para a pesquisa de visão porque suas retinas apresentam a estrutura laminar e tipos de neurônio de vertebrados superiores, e eles exibem comportamentos visual robusto8,9. Vários tipos dos degenerations retinais análogos à doença humana foram modelados com sucesso e estudados no zebrafish10,11, incluindo imagens ao vivo de fotorreceptores individuais degenerando dentro de uma retina2, 12.
Enquanto na vivo zebrafish larval imagiologia é uma ferramenta valiosa, torna-se mais desafiador como peixe cresce e desenvolver pigmentação, e alguns tratamentos farmacológicos não podem permear um animal inteiro. Além disso, determinados processos celulares mudam com desenvolvimento e idade, fazendo mais tarde pontos de tempo crítico para a função de compreensão e a progressão da doença em animais adultos. Métodos bioquímicos como immunoblot, quantitativo PCR, O consumo de2 e metabolómica análises podem fornecer pistas importantes sobre a biologia da retina como um todo, mas é difícil discernir contribuições de tipos de células individuais afectados pela doença. Imagem tecido retinal isolada ex vivo ignora essas questões e enquanto imagem plana montado as retinas proporciona uma vista sobre a retina exterior13, características da retina interiores mais profundas são obscurecidas. Fatias transversais da retina, como aqueles apresentados no fixo análises imuno-histoquímica, permitem uma visão clara de todas as camadas e tipos de células, mas apenas oferecem um único instantâneo dos processos dinâmicos envolvidos na doença e função normal.
Aqui, apresentamos um método para gerar ex vivo transversais da retina fatias de zebrafish adulto para a imagem latente. É semelhante aos métodos para a preparação de anfíbios e zebrafish fatias da retina para14,Estudos eletrofisiológicos e morfológicos15, com importantes modificações para o lapso de tempo de imagem ex vivo usando confocal microscopia. Respostas de fluorescência de biosensores ou corantes em fatias são monitoradas em tempo real com um microscópio confocal ao entregar agentes farmacológicos usando a perfusão. Enquanto o método foi desenvolvido por fotorreceptores de imagem, ela pode ser viável usá-lo para a visualização de células Müller, células bipolares, células horizontais, amacrine células ou células ganglionares da retina com marcadores fluorescentes apropriados. Além disso, as fatias podem ser carregadas com corantes fluorescentes de célula-permeável a viabilidade celular de relatório, transporte vesicular, função mitocondrial ou estado de redox. Esta preparação versátil permite a visualização de uma ampla gama de processos subcelulares ao longo da retina, incluindo Ca2 + dinâmica, transdução de sinal e estado metabólico.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Washington institucional Animal cuidados e Comissão de utilização.
1. preparar o equipamento e animais
Nota: O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma folha escura de tecido circundante fora da retina cuja pigmentação pode obscurecer as características da retina e danificar o tecido quando confocal de imagem ex vivo. Na escuridão, o RPE de zebrafish está retraída longe da retina; escuridão se adaptar peixe para facilitar a futura remoção do RPE da retina antes de fatiar e a imagem latente.
- Transferir peixes de um tanque de desova, cheio de água de peixes e, em seguida, enrole o tanque de desova com tecido escuro ou colocá-lo em um armário escuro.
- Escuridão se adaptar zebrafish pelo menos 1 h antes da eutanásia para permitir a separação completa do RPE da retina. adaptação de escuro 30 min é suficiente para remover a maioria dos RPE, embora partes dela podem permanecer intercalados entre fotorreceptores.
- Derreter ~ 15 mL de petróleo de geleia em um copo de 50 mL em um prato quente e em seguida, desenhe 3 mL do líquido em uma seringa de ponta de 3 mL de deslizamento. Inverter a seringa, coloque em um tubo de ensaio de rack e permitir vaselina esfriar.
- Fazer uma câmara de corte reutilizável em uma corrediça do microscópio simples 7 X 2,5 cm.
- Usando esmaltes claros, pintura de linhas estreitas para criar um retângulo de 3 X 2,5 cm no centro do slide, deixe-a secar e em seguida, adicione outra camada de esmalte para as linhas.
- Prepare a imagem escadas em lamínulas para segurar fatias durante a imagem latente. As fatias irão formar os "degraus" da escada.
- Para imagens estáticas ou experimentos de injeção com fluxo mínimo de solução, fazer escadas de vaselina, consistindo de duas tiras plana larga paralelas da vaselina em 18mm lamínulas de vidro quadrado. Usar a seringa para aplicar dois achatados ~ esfregaços longo de 1cm da refrigeração vaselina 0,5 centímetros distante na lamínula.
- Pronto o cortador de tecido.
- Limpar uma lâmina de barbear de borda duplo com etanol e deixe-o ar seco. Corte em quartos à tesoura, primeiro longitudinalmente em metades, em seguida, através de cada lâmina.
- Coloque a câmara de corte no palco do cortador de tecido, centralizá-lo horizontalmente no palco e marcar uma borda longa com marcador permanente para alinhamento.
- Carregar uma seção da lâmina sobre o braço do cortador de tecido, assegurar que a lâmina encontra-se plana e centrado no slide sem tocar o lustrador de prego e, em seguida, aperte suavemente o aparelho de lâmina. Menor o braço de lâmina, ajustando o botão ¼ virar, então lugar um pedaço de papel de filtro no centro da câmara de imagem e teste cortá-la. Se o papel não é cortar totalmente, remonte a lâmina.
- Usando a seringa, coloque um pequeno ponto da refrigeração vaselina em um prato de Petri de 10 cm ~ 1,5 cm à direita do centro. Pressione uma escada de imagens nele usando fórceps com geleia de petróleo para cima. Faça outro ponto pequeno vaselina ~ 1 cm da borda da câmara de imagem de entrada.
- Encaixe a seringa de vaselina com uma agulha 20g e destampe-lo. Segure a agulha na seringa e usá-lo para fazer duas tiras de 1 cm paralelo longas e finas de vaselina longitudinalmente no centro da câmara de corte. As tiras do espaço ~ 1 centímetros distante.
- Fazer uma ferramenta de laço do fio reutilizáveis olho envolvendo o centro de um ~ fechado de segmento de 4 cm de fio de tungstênio 30g em torno de um par de pinças uma vez firmemente. Ajustar o diâmetro do loop deslizando o fio para cima ou para baixo a pinça até é um pouco maior que um olho de peixe-zebra, tipicamente ~ 2-3 mm. torça as extremidades do fio e fixe-os à extremidade de uma vara de madeira de 6 cm, usando fita de laboratório.
- Prepare a solução de Ringer.
- Descongelar 50 X suplemento solução estoque (tabela 1) e adicioná-lo fresco, solução de Ringer tampão HEPES, não-bicarbonato (tabela 2) pela manhã do experimento; Dilua 200 µ l de solução-mãe de suplemento em cada 10 mL de solução de Ringer em um tubo de centrifuga conico ou frasco de vidro estéril. Experiências de imagem estáticas, prepare pelo menos 30 mL de solução de Ringer por experiência. O volume de solução de Ringer, necessário para as experiências de perfusão dependerá da taxa de fluxo e tempo total de experiência.
- Verificar que o pH da solução completada é 7,4 usando uma sonda de pH digital ou papel de pH e ajustar conformemente com diluir NaOH ou HCl.
- Oxigenar a solução de Ringer complementado no gelo por borbulhamento com gás de oxigênio 100% pelo menos 5 min, usando um tanque de oxigênio médico padrão e regulador equipado com uma mangueira ou um tubo borbulhador de gás opcional usado para perfusão. Armazenar a solução de Ringer oxigenado no gelo em um tubo de centrifuga conico selado ou frasco de vidro estéril perto o microscópio de dissecação; Use esta solução para dissecação, imagem latente e para diluir corantes ou agentes farmacológicos.
- Se outras soluções estão sendo usadas no experimento, tais como at+-livre solução de Ringer (tabela 3), repita as etapas 1.9.1.-1.9.3.
- Recolher os pratos de Petri, pinças, microtesoura e outras ferramentas perto o microscópio de dissecação e preparar um banho de gelo de água de peixes para eutanásia zebrafish.
2. preparar fatias da retina (ver Figura 1)
- Trabalhando sob luz ambiente vermelha para minimizar a adaptação de luz (o que pode fazer a vara RPE mais firmemente para a retina), eutanásia zebrafish por imersão no banho de gelo até toque de resposta é perdida, geralmente 1-2 min. Transfira o peixe para um prato de Petri e usar um bisturi para cervically deslocar mas não decapitar o peixe.
- Use o laço de fio para soltar o tecido conjuntivo ao redor de um olho e então puxe o olho para a frente suavemente com o loop em uma mão. Usando microtesoura na outra mão, corte o nervo óptico branco sob o olho, tomando cuidado para não cortar a parte de trás do olho.
- Transferir o olho usando fórceps para uma placa de Petri de solução de Ringer frio no gelo e repita para o segundo olho. Mantenha os olhos no escuro ou sob luz vermelha até o RPE é removido da retina.
- Disse as viseiras sob um microscópio de dissecação de baixa potência em uma gota de solução de Ringer frio em um slide de vidro liso em uma placa de Petri.
- Perfurar a córnea com pinça fina e, em seguida, delicadamente remova pedaços de clear, quebradiça córnea e esclera prateada com pinças ou tesouras. Remova e descarte a lente e a maior parte da esclera (ver figura 1A) e lidar com a viseira isolada minimamente.
- Pedaços de gordura, pequenos pedaços de esclera e RPE preto podem permanecer ligados a viseira e removido depois da retina. Se a retina separa o RPE na etapa 2.4.1, prossiga com as mesmas etapas usando o cuidado extra para não danificar o delicado retina isolada.
- Posicione o lado aberto viseira para baixo (RPE acima) no slide e corte em terços ou quartos com uma lâmina de barbear de borda única fresco com um movimento (ver figura 1B). Descarte os pedaços de tecido que são altamente curvados.
- Apartamento Monte retina no papel de filtro.
- Molhe um pedaço de papel de filtro com solução de Ringer e colocá-lo no slide ao lado as peças de viseira. Use pinça plana ao manusear o papel de filtro molhado intacto para Evite puncioná-la. Adicione a solução de Ringer frio para cobrir o papel de filtro e o tecido.
- Usar o fórceps em cada mão, cuidadosamente arraste o filtro de papel por baixo de cada peça ocular com o RPE e fotorreceptores virada para cima, ou seja, com a parte de trás do olho virado para cima. Posicionar as peças de viseira em uma única linha ao longo do centro do filtro de papel (ver Figura 1). Lidar com as peças de viseira suavemente com a pinça bem perto de uma borda ou um canto.
- Para ajudar as retinas aderir o papel de filtro, coloque o papel de filtro molhado sobre uma toalha de papel seca por 3 s para a umidade para baixo, mas não deixe o tecido tornar-se seco. Repita até que as peças de viseira deite-se do papel de filtro. Aplicar sucção suave na parte inferior do filtro de papel ajuda a achatar a retina, mas este passo não é essencial.
- Se lençóis pretos de RPE permanecem sobre as peças de ocular, usar pinça fina para suavemente descascá-lo fora a partir de um canto (ver Figura 1), enquanto que o tecido está sentado em uma gota de solução de Ringer. Deve a retina decolar o papel de filtro, repito a etapa wicking 2.5.3. A retina pode aparecer rosa devido a pigmentos visuais crus.
- Repita a dissecção de retina e plano de montagem passos no 2.4-2.6 para o segundo olho, se desejado, mantendo a primeira retina plano montado imergida em solução de Ringer frio. Para simplificar o procedimento de corte, peças de ambas as retinas podem ser colocadas em um papel de filtro. Uma vez que o RPE foi removido, o protocolo pode será efectuado sob a luz do quarto normal salvo experimentos necessitam de escuridão.
- Coloque o papel de filtro em um slide e apará-lo em um retângulo com uma lâmina única borda, deixando ~ 0,5 cm do papel de filtro em ambos os lados da linha de retina. Mover o papel de filtro para a câmara de corte preparada, empurrar as bordas do papel de filtro longo para as linhas finas geleia de petróleo usando fórceps e mergulhe as retinas em 3-4 gotas de solução de Ringer frio.
Nota: Alguns corantes, tais como corantes lipofílicos, melhor são carregados em montagens planas nesta fase antes de fatiar. Estas podem ser carregadas, ímpios fora com um tecido e lavadas na câmara de corte. Por exemplo, C12 558/568 BODIPY intensamente manchas na retina de células fotorreceptoras exterior segmentos (ver Figura 4A) e membranas quando carregado no ~ 5 µ g/mL para 15 min à temperatura ambiente (normalmente 23-27 ° C), seguido por uma lavagem em solução de Ringer em excesso . - Transferência da câmara de corte para a fase de cortador de tecido, posicione a borda longa ao longo da linha marcada e prenda as extremidades da câmara para o palco com fita de laboratório. Começando em uma extremidade, corte a retina e exercendo uma pressão firme, suave no braço do corte de papel de filtro. Verifique se a primeira fatia foi cortada completamente, então use o micrômetro para cortar ~ 400 µm de fatias.
- Monte a escada de imagem.
- Lugar da câmara corte com seções da retina fatiadas na prato de Petri da etapa 1.7 adjacente para a imagem da escada (ver Figura 1E). Encha o prato com solução de Ringer frio para submergir seu conteúdo.
- Usando fórceps e mantendo fatias submergidas, suavemente transferência de tiras de papel de filtro e retina para a escada deslizando o prato de Petri da esquerda para a direita. Tome cuidado para não tocar as retinas diretamente. Girar as fatias 90° e enterrar as bordas do papel de filtro em vaselina.
- Finamente, posição fatias da retina na escada com fórceps para que camadas da retina são claramente visíveis sob o microscópio de dissecação (ver Figura 1). Para fatias de cada lado da escada, certifique-se de que o tecido é virada para dentro para as outras fatias para minimizar o movimento do tecido durante a injeção ou fluxo. Descartar qualquer fatias da retina que não são bem respeitados para o papel de filtro (ver Figura 2A).
- Se desejado, carregar corantes em fatias da retina nesta fase e lave com solução de Ringer em excesso antes da imagem latente.
Nota: Iodeto de Propidium (PI) e Hoechst 33342 robustamente mancham núcleos de mortos e de todas as células, respectivamente (ver Figura 2B), quando incubadas com fatias da retina em 5 µ g/mL por 20 min em temperatura ambiente. Diversos (TMRM) acumula-se na mitocôndria ativamente desoxigenada durante todo a retina quando incubados a 1 nM por 30 min à temperatura ambiente. - Enquanto as fatias são de coloração, prepare o aparelho de imagens de câmara e injeção. Use a seringa para lavar o tubo com solução de Ringer e limpar as bolhas, anexar a extremidade aberta do tubo para a entrada de imagem da câmara e fechar a torneira. Remova a seringa e preenchê-lo com termos para injeção e, em seguida, reconectá-lo para a tubulação.
- Usar fórceps para transferir a lamela com fatias da retina para a câmara de imagem, pressionando a lamela para o ponto de geleia de petróleo perto da borda da entrada da câmara de imagem (consulte a Figura 1 H). Encha a câmara de imagem com solução de Ringer para cobrir as fatias.
3. imagem latente retinais fatias
- Coloque a câmara de imagem preenchida com o aparelho conectado injeção no palco de um microscópio confocal vertical equipado com uma água de 20 ou 40 X lente de imersão. Fixe a câmara de imagem com clipes de palco.
- Abaixe a lente de imersão sobre a escada e focar uma fatia em uma extremidade da escada sob luz fraca trans-iluminado. Examine cada fatia para orientação transversal, presença de segmentos exteriores fotoreceptor e adesão seguro para o papel de filtro.
- Selecione a melhor fatia para a imagem latente de lapso de tempo e configurar o software de microscópio para aquisição de imagens de lapso de tempo. A tabela 4 descreve as configurações típicas de imagem para vários marcadores fluorescentes e corantes.
Nota: A taxa de aquisição de imagem pode variar dependendo do microscópio, marker(s) fluorescente e processo biológico em estudo. Por exemplo, use a resolução de 800 x 800 pixels, 2 µs/pixel scan velocidade e uma taxa de quadros de 10-s para imagem dinâmica do cálcio em fotorreceptores com GCaMP3 e um corante vermelho.- Se estiver disponível, use o software para rastrear Marcos físicos em fatia (segmentos exteriores fotoreceptor, corpos celulares, núcleos) para auxiliar a reorientação potencial durante o lapso de tempo. Também configurar o software para monitorar em tempo real da fluorescência do outro lado da fatia.
- Begin fluorescência de base de imagem e monitor. Quando fluorescência em toda a fatia estabiliza (normalmente dentro de 2-5 min), prosseguir com o experimento. Para injeção, abra a torneira de seringa, então lentamente prima e retiraram-se sobre o êmbolo duas vezes para auxiliar a mistura.
Nota: por exemplo, aboli a função mitocondrial pela injeção de uma solução concentrada do protonophore CCCP para atingir uma concentração final de 1 µM na câmara de imagens. Isto induz um robusto Ca2 + estourar no citosol fotorreceptoras relatado por GCaMP, em seguida, uma diminuição constante no potencial de membrana mitocondrial, relatado por TMRM. - Estreitamente monitorar fatias para drift durante o experimento e usar o software para fazer microajustes de acordo com Marcos físicos. Normalmente deriva na direção Z durante a injeção ou perfusão é < 5 µm.
4. a imagem da retina fatias durante experimentos de perfusão onde as soluções são alteradas ou fluiu continuamente
Nota: Imagem retinal fatias durante experimentos de perfusão onde as soluções são alteradas ou fluiu continuamente é semelhante a configuração para experimentos de imagem ou injeção estáticas, com as seguintes modificações.
- Em vez de escadas de vaselina descritas na etapa 1.4, use escadas de cera mais resistentes para prender fatias da retina constante durante o fluxo de solução.
- Coloque dois pequenos cilindros paralelos de cera dental sem sabor ~ 0,5 cm de distância em uma lamela. Sobre uma superfície plana, use o polegar para pressionar cada cilindro baixo e para fora em direção a borda paralela da lamela. Marcar os dois cilindros achatados horizontalmente com uma lamela #1 (ver Figura 1E, lado direito) em seguida manchar uma camada fina de vaselina entre as tiras de cera com uma espátula.
- Ao montar a escada de imagem na etapa 2.10.2, pressione as bordas do papel de filtro cortado dentro os escores de cera usando pinça fina (Figura 1).
- Para configurar para perfusão na etapa 2.12, encha a seringa reservatórios com soluções preoxygenated, ou use um tubo de gás opcional para oxigenar soluções em cada reservatório. Liberar todos os tubos com solução de Ringer, certifique-se de que todas as linhas de fluxo quando abriu e expurgar grandes bolhas.
- Antes de encher a câmara de imagem na etapa 2.13, use a seringa para colocar outro ponto de vaselina sobre cada canto exposto da lamela para impedi-lo de deslizar lateralmente durante o fluxo.
- Quando a câmara de imagem é cheio e montada na fase de microscópio, ligue o aspirador e conecte o tubo do aspirador. Testar o fluxo de solução de Ringer e usar o micropositioner para situar o tubo aspirador pela câmara de vazão para que pequenas quantidades de líquido são desenhadas antes que a câmara estouros (tipicamente ~ 1 mm acima da superfície da solução para uma taxa de fluxo de 2 mL/min). Manter a solução de Ringer fluindo enquanto seleciona fatias no passo 3.4.
- Para realizar o experimento no passo 3.4 para perfusão, alternar o fluxo de soluções, fechando a torneira de passagem da primeira solução durante a abertura da segunda solução.
- Por exemplo, para esgotar extracelular at+ da câmara de imagem, use dois reservatórios de seringa preenchidos com solução de Ringer ou nd+-livre solução (tabela 3). Fluxo de solução de Ringer para estabelecer a linha de base e, em seguida, alternar para at+-livre de solução. Isso resulta em grande citosólico Ca2 + aumenta em segmentos exteriores fotoreceptor e corpos celulares (ver Figura 4).
- Para sistemas de perfusão de gravidade-alimentado, monitore o nível da solução em cada reservatório, assim a taxa de fluxo é constante durante a imagem latente. Acima de reservatórios conforme necessário com soluções oxigenadas, ou manter o oxigênio contínuo borbulhando com um tubo de gás.
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Representative Results
Posicionamento estável e orientação transversal de fatias são chave para o sucesso de imagem com injeção ou perfusão de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine e reposicionar fatias antes da imagem latente confocal conforme necessário para garantir que todas as camadas da retina são visíveis (Figura 2A, fatia ii). Se uma fatia é girada ligeiramente para a frente (Fig. 2A, fatia iii), feixes de segmentos exteriores será visíveis e pequenos ajustes podem ser feitos com fórceps para focar as camadas desejadas da retina. Fatias mal aderiram para o papel de filtro (Figura 2A, fatia-eu) ou reter RPE (Figura 2A, fatie iv) não deve ser usado para a imagem latente de lapso de tempo.
Viabilidade celular é fundamental para observar processos fisiológicos ex vivo; uma viabilidade celular mancha como iodeto de propidium (PI) recomenda-se a ensaiar a saúde celular enquanto praticando retina fatiar. Células mortas perto da borda de corte de todas as fatias acumulará PI em seus núcleos (Figura 2B, painéis à esquerda), durante 5-10 µm mais profundo para a fatia, células saudáveis com morfologia normal e nenhuma mancha de PI podem ser fotografadas. Por exemplo, em fotorreceptores, células negativas de PI abaixo da borda de corte comumente exibem uma morfologia polarizada, alongada estereotipada (Figura 2B, painéis certo). Fotorreceptores permanecem viáveis em fatias da retina pelo menos 4 h, quando armazenados em solução de Ringer oxigenado.
Muitas estruturas de células da retina podem ser visualizadas usando combinações de marcadores de transgénicos e corantes; imagens confocal de exemplo de frescas fatias da retina com rotulagem fluorescente duplos e triplos são apresentadas na Figura 3. Para visualizar a dinâmica do cone fotorreceptoras retículo endoplasmático (ER) em relação ao núcleo, fatias da retina de peixes transgênicas expressando GFP direcionado para cone ER17 podem ser counterstained com um corante nuclear (Figura 3A). Uma estratégia semelhante pode ser utilizada para exibir o citoesqueleto de actina usando fatias da retina de zebrafish transgênico expressando GFP-fundido actina18 (Figura 3B). Com outro promotor específico células, células de Müller podem ser rotuladas com a proteína fluorescente vermelha tdTomato19 e visualizadas em fatias da retina (Figura 3, painel superior). Absorção de glicose para a retina pode ser analisado na vivo por oralmente gavaging zebrafish adulto com uma fluorescente glicose analógico (NBDG), que torna-se incorporada em células visíveis em uma fatia da retina21 (Figura 3, painel inferior). Duplo zebrafish transgênico pode ser empregada para monitorar vários processos de célula ou tipos de células em conjunto, tais como Ca2 + dinâmica em um subtipo de cones. Figura 3D mostra um esquema de rotulagem triplo para este tipo de experimento, com tdTomato expressado em cones de longo comprimento de onda2 juntamente com mitochondrially-alvo Ca2 + sensor (mito-GCaMP) expressado em todos os cones22 e uma mancha nuclear.
Imagem latente de lapso de tempo das células da retina é uma vantagem fundamental de preparação desta fatia. Por exemplo, Ca2 + flutuações no citosol de cone fotorreceptoras podem ser observadas e quantificadas mais tarde durante a manipulação farmacológica, um experimento representado na Figura 4. A figura 4A mostra fatias da retina, expressando o Ca2 + sensor GCaMP2 (topo) ou controle eGFP16 (inferior) em cones fotorreceptores counterstained com um corante lipofílico vermelho. Neste experimento at+ isotonically está esgotada da câmara de imagem usando a perfusão, evocando grandes aumentos no citosol Ca2 + para o segmento externo e o corpo celular, como refletido por GCaMP (Figura 4A, painel superior). Fluorescência de retinal fatias expressando Ca2 +-eGFP insensível não é afetado por este tratamento (Figura 4A, painel inferior). Filmes de lapso de tempo podem ser analisados usando software ImageJ para isolar e quantificar respostas de fluorescência dos segmentos exteriores de cone único, corpos celulares e sinapses (Figura 4B).
| Solução de suplemento | ||
| 50 x estoque * concentração (mM) | concentração de trabalho (mM) | |
| D-glicose | 500 | 10 |
| lactato de sódio | 50 | 1 |
| piruvato de sódio | 25 | 0,5 |
| L-glutamina | 25 | 0,5 |
| Glutatião reduzido | 25 | 0,5 |
| ácido ascórbico | 15 | 0.3 |
| * armazenar alíquotas a-20 ° c < 6 meses; Adicionar fresco para a solução de Ringer | ||
Tabela 1. Componentes de 50 X suplementam solução estoque e concentrações finais de trabalho.
| Solução de Ringer | |
| concentração (mM) | |
| NaCl | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH de 7,4 usando NaOH | |
| armazenar a 4 ° c em frasco estéril < 1 mês | |
Tabela 2. Componentes da solução de Ringer padrão.
| At+-livre de solução de Ringer | |
| concentração (mM) | |
| TRIS | 147 |
| HCl | 120 |
| KCl | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH de 7,4 usando HCl | |
| armazenar a 4 ° c em frasco estéril < 1 mês | |
Tabela 3. Componentes do at+-livre de solução de Ringer.
| Configurações de imagem latente confocal | |||
| Fluoróforo | Excitação | Filtro de emissão | |
| Comprimento de onda | Intensidade do laser | ||
| GFP (incluindo GCaMP) | 488 nm | 2 - 5% | eGFP ou AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | 594 AlexaFluor |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 nm | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10% | eGFP ou AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | 594 AlexaFluor |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
Tabela 4. Imagem latente condições para marcadores fluorescentes e corantes apresentadas nas figuras 2-4.
Figura 1. Esquemático para a preparação da retina fatias frescas zebrafish. (A) embora dissecar a viseira e descartar a lente e a esclera (etapa 2.4.1.). (B) corte a viseira em três partes; Descarte a peça pequena borda (etapa 2.4.2.). (C) arraste papel de filtro sob pedaços de viseira com a retina interna virada para o papel de filtro (passo 2.5.1.-2.5.2.). (D) Flatten retina usando uma toalha de papel para pavio-solução de Ringer para baixo através do papel de filtro (etapa 2.5.3.), então delicadamente descasque distância restante RPE com fórceps (passo 2.6). Mover o papel de filtro para a câmara de corte na fase de cortador de tecido e corte 400 µm fatias (passos 2.8., 2.9.). (E) transferência de fatiar câmara com fatias e uma escada de cera ou vaselina para uma placa de Petri de solução de Ringer (etapa 2.10.1.). (F) Use pinça fina para deslize única fatias da câmara de corte para a escada, mantendo fatias submergidas. (G) rodar papel de filtro tiras (preto) 90 ° e enterrar as bordas do papel filtro em cera ou vaselina (etapas 2.10.2.-2.10.3.). (H) esquema da câmara de imagem final carregado com uma escada e fatias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplos de zebrafish fresco retinal fatias exibindo aderência adequada para o papel de filtro e viabilidade celular. (A) Brightfield imagem de frescas fatias da retina em uma escada de vaselina. Fatias de ii e iii exposição boa adesão e transversais camadas da retina. Fatias i e iv têm mantido RPE substancial, ou são altamente curvado e não bem aderidas para o papel de filtro e não deve ser fotografados. Barra de escala = montagem 200 µm. Z de cima para baixo (B) de uma fatia da retina fresca de zebrafish transgênico expressando eGFP em cones fotorreceptores (Tg(gnat2:eGFP)16). Corante Hoechst rotula todos os núcleos; (PI) de iodeto de propidium counterstaining etiquetas de núcleos de células mortas, que aparecem perto da borda de corte da fatia (à esquerda). Tamanho de passo de Z-pilha = 1 µm; barra de escala = 20 µm. condições de imagens fluorescentes são descritas na tabela 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Amostra de imagens confocal de duplo e triplo-etiquetados ex vivo da retina fatias de transgenic zebrafish adulto. (A) esquema de imagens de duas cores empregando transgênico GFP tagged retículo endoplasmático em cones (Tg(gnat2:calr-GFP)17, parte superior) com corante de contraste nuclear Hoechst (azul, em baixo). (B) GFP tagged actina em cones (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, parte superior) com corante de contraste nuclear Hoechst (azul, em baixo). (C) RFP rotulado células de Müller (Tg(GFAP:tdTomato)19, top) de um zebrafish alimentados fluorescente glicose (NBDG) demonstrando a absorção de glicose em cones20,21 (verde, parte inferior). (Esta imagem é da Figura 2B , de Kanow, et al 21) (D) exemplo de três cores de imagem usando zebrafish transgênico duplo. Esquerda, RFP direcionado para comprimentos de onda longos cones fotorreceptores (Tg(trβ2:tdTomato)2). Centro, biosensor cálcio GCaMP direcionado a mitocôndria de cone fotorreceptoras (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). Bem, sobreposto a imagens de tdTomato (magenta), mito-GCaMP (verde) e Hoechst nuclear corante de contraste (azul). As imagens são Z-projeções de intensidade máxima de 9 quadros sobre uma profundidade de tecido 7 µm; escala barras representam 10 µm. fluorescente de imagem condições estão descritas na tabela 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. CA2 + imagem com GCaMP e controle eGFP. (A) imagens representativas de frescas fatias da retina, expressando o biosensor2 + Ca fluorescente GCaMP (gnat2:GCaMP32, superior) ou eGFP (inferior) em cones fotorreceptores. Esquerda, fatias na linha de base; Bem, fatias de 2 min depois at+ isotonically foi esgotado da câmara de imagem usando a perfusão de solução de Ringer um Tris-baseado que armadilhas Ca2 + em fotorreceptores. Barras de escala = 10 µm. condições de imagens fluorescentes são descritas na tabela 4. (B) significa mudanças de fluorescência de compartimentos único fotoreceptor (segmentos exteriores, corpos celulares e sinapses) durante a imagem latente de lapso de tempo de depleção at+ . As fatias foram fotografadas cada 10 s, pilhas foram processadas usando o ImageJ e fluorescência de GCaMP ou eGFP foi normalizada para sinalizar da tintura da membrana. Linhas sólidas, GCaMP (n para segmentos exteriores = 15, corpos celulares = 24, sinapses = 26); linhas tracejadas, eGFP (n para segmentos exteriores = 26, corpos celulares = 20, sinapses = 31). Barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ex vivo por imagens do zebrafish frescos fatias da retina tem provado para ser uma ferramenta versátil para estudar fotorreceptoras biologia20,21,22e é o única que permite a análise de células individuais em um maduro, totalmente diferenciada de retina. Com prática, é possível realizar várias experiências com tecido de um único peixe, mesmo usando seriais fatias da mesma região da retina. Além dos desafios e sugestões relacionadas com a preparação de fatias da retina de anfíbios para estudos de eletrofisiologia14, existem considerações importantes para experimentos de imagem.
Para fotorreceptores, viabilidade celular geralmente se correlaciona com a morfologia celular, por isso é importante lidar com a delicada retina minimamente, particularmente depois que o RPE foi removido. Depois de cortar, use pinça fina para deslize cuidadosamente as fatias na horizontal da câmara de corte (Figura 1F) para transferi-los para a escada ao invés de fatias de levantamento para cima e mantenha sempre fatias submergidas em solução de Ringer. Se possível, monte a escada de fatias da retina perto o microscópio confocal para minimizar os danos de fatias de tremer durante o transporte.
Forte adesão do tecido da retina para o papel de filtro é fundamental para a criação de fatias que permanecerão estáveis durante experimentos de injeção ou perfusão. É necessário inspeccionar cuidadosamente cada fatia para morfologia e estabilidade antes de imagem (Figura 2A); batendo suavemente a tabela microscópio enquanto visualização fatia de movimento através da lente ocular confocal revela a estabilidade de uma determinada fatia. Apesar das precauções, deriva na direção Z durante a injeção ou perfusão pode apresentar desafios para a análise, portanto é útil carregar uma tintura de controle, tais como corantes lipofílicos para membranas e mitocôndrias, para estàvel rotular um organelo identificáveis para Normalização (Figura 4A, magenta). Se fatias deriva > 10 µm na direção Z pode não ser possível extrair dados utilizáveis de célula única. Tração moderada na direção X-Y pode ser corrigida em pós-processamento usando o software de registro como MultiStackReg para ImageJ (RRID:SCR_002285).
Em condições estáticas, fluorescência de marcadores em fatias da retina deve permanecer estável, apesar de fotobranqueamento pode ocorrer durante a imagem latente. Deve ter cuidado para minimizar a exposição do laser durante lapsos de tempo refinando parâmetros tais como a intensidade do laser, scan velocidade e taxa de quadros. Controles de imagem são recomendados para cada marcador fluorescente usado. Controles incluem injetando perfusing solução de Ringer sem agentes farmacológicos em experimentos separados ou realizando experiências de imagens com marcadores não-biosensor que fluorescem constitutivamente.
Dependendo o laser confocal excitação sendo usado, pigmentos no RPE podem contribuir para autofluorescência e nem gerar calor durante a imagem latente, por isso é importante remover a maior parte deste tecido antes de cortar. Dark-adapting aids de animais na remoção do RPE, minimizando danos à retina subjacente. Incapacidade de imagem o RPE é uma limitação desta preparação de fatia, embora isto pode ser superado usando animais albinos com um RPE transparente. Outra limitação é que as células ganglionares da retina e pés final das células de Müller podem tornar-se obscurecida do vista pelo papel de filtro; como uma preparação alternativa as retinas podem ser planas, montado com o lado de fotoreceptor para baixo sobre o papel de filtro e então cortada para fornecer uma visão mais clara da retina mais íntima. Também é importante notar que tempo horizontais projeções de algumas células, como células de amacrine de campo largo, podem ser cortadas durante a dissecação ou corte. Uma limitação final é que muitos corantes fluorescentes nonspecifically acumulam em segmentos exteriores fotoreceptor, então para esta parte da retina é aconselhável a utilização geneticamente codificada biosensores, ao invés de corantes de indicador.
Dada a ampla gama de repórter celular fluorescente disponível corantes23,24 para tecido e geneticamente codificado biosensores fluorescentes usados com sucesso no zebrafish2,3,4, 5, esta fatia de preparação pode ser usada para estudar numerosos processos biológicos em diversos tipos de células da retina (ver exemplos na Figura 3, , Figura 4). Imagem frescas fatias da retina usando microscopia de super-resolução célula viva também poderia fornecer excitantes novos insights para a função da retina e saúde em um nível subcellular. Além disso, este método pode ser adaptado para ex vivo por imagens do rato da retina fatias25. Enquanto preparação bem-sucedida de frescas fatias da retina requer prática, é uma ferramenta poderosa que é útil para abordar uma grande variedade de questões biológicas célula específicas em uma retina maduro.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos Ralph Nelson e Daniel Possin pensativa orientação durante o desenvolvimento deste protocolo e Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton para geração de linhas de zebrafish transgênicos estável. O trabalho foi apoiado pela NSF GRFP 2013158531 de M.G., NIH NEI 5T32EY007031 de W.C. e M.G. e EY026020 de J.H. e S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
