Summary
التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.
Abstract
شبكية العين هي نسيج معقد يبدأ ويدمج الخطوات الأولى للرؤية. الخلل الوظيفي للخلايا الشبكية سمة مميزة للكثير من الأمراض المسببة للعمى، والعلاجات المستقبل يتوقف على التفاهمات الأساسية حول كيفية مختلفة الشبكية خلايا تعمل بشكل طبيعي. قد ثبتت صعوبة الحصول على مثل هذه المعلومات مع أساليب الكيمياء الحيوية نظراً لأن هي تناقص المساهمات لأنواع معينة من الخلايا في الوسط الخلية الشبكية. تصوير الشبكية حية يمكن أن توفر طريقة عرض للعديد من العمليات البيولوجية على المستوى سوبسيلولار، بفضل عدد متزايد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة. ومع ذلك، هذه التقنية كانت حتى الآن محدودة للضفادع الصغيرة واليرقات الزرد، طبقات الشبكية الأبعد من شبكية العين المعزولة، أو تصوير القرار أقل من شبكية العين في الحيوانات الحية. هنا نقدم طريقة لتوليد يعيش السابقين فيفو الشرائح الشبكية من الزرد الكبار لتصوير مباشر عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الإعداد غلة شرائح عرضية مع جميع طبقات الشبكية، ومعظم أنواع الخلايا المرئية لأداء تجارب التصوير [كنفوكل] استخدام التروية. إذ تعرب عن بروتينات الفلورسنت الزرد المحورة وراثيا أو أجهزة استشعار العوامل البيولوجية في أنواع محددة من الخلايا الشبكية أو العضيات تستخدم لاستخراج المعلومات خلية واحدة من شبكية سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح الشبكية مع الأصباغ الفلورية المؤشر، إضافة إلى براعة في الأسلوب. تم تطوير هذا البروتوكول للتصوير Ca2 + داخل photoreceptors مخروط الزرد، ولكن بعلامات مناسبة فإنه يمكن تكييفها لقياس Ca2 + أو نواتج الأيض في الخلايا أو الخلايا الأفقية والقطبين، microglia، الخلايا أماكريني أو الشبكية مولر خلايا العقدة. تتم إزالة ظهارة صباغ الشبكية من شرائح حتى هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسة هذا النوع من الخلايا. مع الممارسة، من الممكن لإنشاء شرائح المسلسل من الحيوان واحدة لتجارب متعددة. يوفر هذا الأسلوب يمكن تكييفها أداة قوية للرد على العديد من الأسئلة حول بيولوجيا الخلايا الشبكية، Ca2 +والتوازن الطاقة.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) أصبحت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الطبية والأساسية1، نظراً لصغر حجمه، والتطور السريع ونظم الجهاز الفقاريات. الشفافية الطبيعية يرقات الزرد جنبا إلى جنب مع الأساليب المتبعة ترانسجينيسيس مكنت التصور تفصيلية للعمليات الخلوية في الحيوانات حية. استهدفت عددا من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة إلى خلايا محددة الزرد للكشف عن Ca2 + 2، وفوق أكسيد الهيدروجين3، أبوبتوتيك التنشيط4 و ATP5.
في فيفو تصوير يرقات الزرد أدى إلى اختراقات في مجال علم الأعصاب، بما في ذلك رسم خرائط للدماغ الدوائر6 وتطوير العقاقير للجهاز العصبي المركزي واضطرابات7. الزرد أيضا مناسبة للرؤية للبحث نظراً لأن ميزة شبكية العين على بنية طبقية وأنواع الخلايا العصبية للفقاريات العليا، وأنها عرض السلوكيات بصرية قوية8،9. تم بنجاح على غرار عدة أنواع من تنكسات الشبكية مماثلة للأمراض البشرية ودرس في الزرد10،11، بما في ذلك التصوير الحي من photoreceptors حدة التدهور داخل شبكية2، 12.
بينما في فيفو تصوير الزرد اليرقات أداة قيمة، فإنه يصبح أكثر صعوبة كما الأسماك تنمو وتتطور تصبغ، وبعض العلاجات الدوائية لا تتخلل حيوان كامل. علاوة على ذلك، تغيير بعض العمليات الخلوية مع التنمية، والعمر، مما يجعل لاحق الوقت النقاط الحرجة للدالة التفاهم وتطور المرض في الحيوانات الكبار. أساليب الكيمياء الحيوية مثل إيمونوبلوت، كوانتيتياتيفي بكر واستهلاك2 س وتحليلات metabolomic يمكن أن توفر أدلة هامة حول علم الأحياء الشبكية ككل، ولكن من الصعب أن نتبين إسهامات أنواع الخلايا الفردية تتأثر المرض. التصوير نسيج الشبكية معزولة السابقين فيفو يتجاوز هذه القضايا، وحين التصوير شقة المحملة شبكية العين يتيح عرض شبكية العين الخارجي13، يتم حجب ميزات الشبكية الداخلية أعمق. شرائح عرضية الشبكية، مثل تلك التي قدمت في ثابت تحليلات المناعي، تمكين رؤية واضحة لجميع الطبقات وأنواع الخلايا ولكن لا تقدم سوى لقطة واحدة من العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها وظيفة طبيعية والمرض.
نقدم هنا، وسيلة لتوليد السابقين فيفو عرضية الشرائح الشبكية من الزرد الكبار للتصوير. ومشابه لأساليب لإعداد الشرائح الشبكية البرمائية والزرد للدراسات الكهربية والمورفولوجية14،15، مع تعديلات هامة للفاصل الزمني التصوير السابقين فيفو استخدام [كنفوكل] الفحص المجهري. وتراقب الردود الأسفار من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو الصبغات في شرائح في الوقت الحقيقي مع مجهر [كنفوكل] بينما كان يلقي وكلاء الدوائية باستخدام التروية. بينما وضعت الطريقة للتصوير فوتوريسيبتورس، قد يكون من الممكن استخدامها لتصور الخلايا أو الخلايا ثنائية القطب، أفقي من الخلايا، الخلايا أماكريني أو خلايا الشبكية العقدة مولر مع علامات مضيئة مناسبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح مع الفلورية الأصباغ نفاذية الخلية لتقرير جدوى الخلية أو النقل حويصلية، الوظيفة المتقدرية أو حالة الأكسدة والاختزال. يسمح هذا الإعداد تنوعاً تصور طائفة واسعة من العمليات سوبسيلولار في جميع أنحاء الشبكية، بما في ذلك Ca2 + ديناميات وتوصيل الإشارة والدولة الأيضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافقت جامعة واشنطن رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع التجارب على الحيوانات.
1. إعداد الحيوانات والمعدات
ملاحظة: ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ورقة الظلام من الأنسجة المحيطة بالجزء الخارجي الشبكية يمكن أن يحجب ملامح الشبكية التي تصبغ وتلف الأنسجة عند [كنفوكل] التصوير فيفو السابقين. في الظلام، وهو تراجع عن RPE الزرد بعيداً عن الشبكية؛ الظلام تكيف الأسماك لتسهيل إزالة RPE من الشبكية المقبلة قبل تشريح وتصوير.
- نقل الأسماك إلى خزان التفريخ مليئة بأسماك المياه، ثم التفاف خزان التفريخ مع النسيج المظلم أو وضعه في خزانة مظلمة.
- الظلام تكييف الزرد على الأقل 1 ح قبل القتل الرحيم للسماح بالقرب من الفصل الكامل RPE من الشبكية. التكيف مع الظلام 30 دقيقة كافية لإزالة معظم RPE، على الرغم من أن أجزاء منها قد تبقى المقحم بين photoreceptors.
- تذوب ~ 15 مل البترول جيلي في كوب 50 مل على لوحة الساخن ومن ثم رسم 3 مل السائل في محقن تلميح 3 مل زلة. عكس المحاقن، ضع في أنبوبة الاختبار رف، وتسمح فازلين لتبرد.
- جعل دائرة تشريح القابل لإعادة الاستخدام على شريحة مجهر عادي 7 × 2.5 سم.
- استخدام طلاء الأظافر واضحة، خطوط الطلاء الضيقة لإنشاء مستطيل 3 × 2.5 سم في وسط الشريحة، السماح لتجف ثم قم بإضافة طبقة أخرى من طلاء الأظافر إلى الخطوط.
- إعداد سلالم التصوير في كشوف غطاء لعقد الشرائح أثناء التصوير. وسوف تشكل الشرائح "الدرجات" في السلم.
- لالتقاط الصور الثابتة أو تجارب حقن مع تدفق حل الحد الأدنى، جعل سلالم فازلين تتألف من الشريطين شقة واسعة موازية من فازلين على كشوف غطاء زجاج مربعة 18 ملم. استخدام المحاقن لتطبيق اثنين بالأرض ~ 1 سم مسحات طويلة لتبريد فازلين 0.5 سم بعيداً في كشف الغطاء.
- وعلى استعداد تقطيع اللحم والأنسجة.
- تنظيف شفرة حلاقة حافة مزدوجة مع الإيثانول والسماح للهواء الجاف. قطع عليه إلى أرباع مع مقص، أولاً طوليا إلى نصفين، ثم عبر كل شفرة.
- مكان قاعة تشريح في مرحلة تقطيع الأنسجة وأنها مركز أفقياً على المسرح ووضع علامة على حافة طويلة مع علامة دائمة للمحاذاة.
- تحميل مقطع شفرة على ذراع تقطيع اللحم والأنسجة، وضمان تكمن الشفرة مسطحة، وتركزت على الشريحة دون لمس طلاء الأظافر، ثم تشديد جهاز شفرة برفق. انخفاض تشغيل الذراع شفرة عن طريق ضبط مقبض ¼، المكان ثم قطع قصاصة ورق التصفية في مركز دائرة التصوير والاختبار. في حالة عدم قطع الورق الكامل من خلال، قم بإعادة تحميل الشفرة.
- استخدام المحاقن، ضع نقطة صغيرة واحدة لتبريد فازلين في طبق بتري 10 سم ~ 1.5 سم على يمين الوسط. اضغط سلم تصوير في ذلك استخدام الملقط مع فازلين مواجهة. جعل آخر صغير فازلين دوت ~ 1 سم من حافة مدخل قاعة التصوير.
- وتناسب المحاقن فازلين مع إبرة ز 20 زجاجتين. اضغط الإبرة على المحاقن واستخدامها لجعل اثنين 1 سم شرائط متوازية طويلة رقيقة من فازلين طوليا في وسط الغرفة تشريح. مساحة الشرائط ~ 1 سم عن بعضها البعض.
- جعل أداة حلقة عين أسلاك قابلة لإعادة الاستخدام بالتفاف وسط ~ الجزء 4 سم من سلك التنغستن ز 30 حول زوج من إغلاق الملقط مرة محكم. ضبط قطر الحلقة بانزلاق السلك أعلى أو لأسفل الملقط حتى أنها أكبر قليلاً من عين الزرد، عادة ~ 2-3 ملم. تويست نهايات الأسلاك وأمن لهم في نهاية عصا خشبية 6-سم باستخدام شريط المختبر.
- إعداد حل للمسابقة.
- ذوبان الجليد 50 س الحل الأسهم الملحق (الجدول 1) وإضافة جديدة لحل المسابقة حبيس مخزنة، غير بيكربونات (الجدول 2) صباح يوم التجربة؛ تمييع 200 ميليلتر لتكملة الحل الأسهم في كل 10 مل من الحل للمسابقة في أنبوب الطرد المركزي مخروطية أو زجاجة معقمة. لتجارب التصوير ثابتة، إعداد على الأقل 30 مل من محلول في المسابقة لكل تجربة. حجم الحل في المسابقة في حاجة لتجارب نضح سيتوقف على معدل التدفق ووقت التجربة الكلية.
- تأكد أن الرقم الهيدروجيني للحل الذي استكمله 7.4 باستخدام مسبار درجة الحموضة الرقمي أو ورقة الأس الهيدروجيني وضبط تبعاً لذلك مع تمييع هيدروكسيد الصوديوم أو HCl.
- الأوكسجين الحل تستكمل المسابقة على الجليد بالسطح مع غاز الأكسجين 100% لمدة 5 دقائق على الأقل باستخدام صهريج الأوكسجين الطبي القياسية ومنظم مزودة بخرطوم مياه، أو المتشعبة bubbler الغاز اختياري يستخدم التروية. تخزين حل اﻷوكسيجين المسابقة على الجليد في أنبوب الطرد المركزي المخروطية مختومة أو زجاجة معقمة قرب مجهر التشريح؛ استخدام هذا الحل للتشريح، التصوير، وتمييع الأصباغ أو وكلاء الدوائية.
- إذا الحلول الأخرى المستخدمة في التجربة، مثل Na+--مجانية الحل للمسابقة (الجدول 3)، كرر الخطوات 1.9.1.-1.9.3.
- جمع أطباق بيتري والملقط، والمقص الصغير وأدوات أخرى قرب مجهر التشريح، وإعداد حمام جليد المياه أسماك الزرد القتل الرحيم.
2-إعداد الشرائح الشبكية (انظر الشكل 1)
- العامل تحت الحمراء الضوء المحيط للتقليل من التكيف مع الضوء (التي يمكن أن تجعل العصا RPE أكثر أحكاما لشبكية العين)، euthanize الزرد بالانغماس في حمام الثلج حتى استجابة اللمس يتم فقدان، عادة نقل السمك إلى طبق بتري 1-2 دقيقة واستخدام مشرط إلى سيرفيكالي انخﻻع لكن لا قطع رأس السمكة.
- استخدم حلقة الأسلاك لترخي النسيج الضام حول عين واحدة، وثم سحب العين إلى الأمام برفق مع الحلقة في يد واحدة. باستخدام المقص الصغير في اليد الأخرى، قطع العصب البصري الأبيض تحت العين، مع الحرص على عدم قطع الجزء الخلفي العين.
- نقل العين باستخدام الملقط إلى طبق بتري حل الباردة المسابقة على الجليد، وكرر للعين الثانية. تبقى العيون في الظلام أو تحت الضوء الأحمر حتى تتم إزالة RPE من الشبكية.
- تشريح eyecups تحت مجهر تشريح طاقة منخفضة في قطره حل الباردة المسابقة على شريحة زجاج عادي في طبق بتري.
- بيرس القرنية مع الملقط غرامة، ثم إزالة القطع واضحة، بلطف القرنية هش والصلبة فضي مع الملقط أو المقص. إزالة وتجاهل العدسة ومعظم الصلبة العينية (انظر الشكل 1A)، والتعامل مع فنجان العين معزولة في الحد الأدنى.
- يمكن أن تظل متمسكة بفنجان العين قطعة من الدهون، وقطع صغيرة من الصلبة، وأسود RPE وإزالتها من الشبكية في وقت لاحق. إذا كان يفصل الشبكية من RPE في خطوة 2.4.1، المضي قدما في نفس الخطوات باستخدام الحذر لا إلى تلف الشبكية المعزولة حساسة.
- موقف الجانب فنجان العين المفتوحة إلى أسفل (RPE أعلى) على الشريحة، ويقتطع من الثلثين أو الأرباع بشفرة حلاقة حافة واحدة جديدة في اقتراح واحد (انظر الشكل 1B). تجاهل قطع الأنسجة التي عالية مقوسة.
- جبل مسطح الشبكية على ورق الترشيح.
- الرطب قطعة من ورق الترشيح مع الحل للمسابقة ووضعه على الشريحة بجوار قطعة فنجان العين. استخدام الملقط شقة عند التعامل مع ورقة تصفية الرطب سليمة لتجنب ثقب عليه. إضافة حل الباردة المسابقة لتشمل كلا من ورق الترشيح والأنسجة.
- استخدام الملقط في كل ناحية، بعناية سحب الورقة تصفية تحت كل قطعة فنجان العين مع RPE و photoreceptors التي تواجه أعلى، أي مع الجزء الخلفي العين مواجهة. ضع القطع فنجان العين في خط واحد على طول وسط ورق الترشيح (انظر الشكل 1). التعامل مع القطع فنجان العين بلطف بالملقط غرامة فقط قرب الحافة أو الركن.
- لمساعدة شبكية العين التمسك بورق الترشيح، وضع ورقة تصفية الرطب على منشفة ورقية جافة 3 s الفتيل الرطوبة إلى الأسفل، ولكن لا تدع الأنسجة تصبح جافة. كرر حتى القطع فنجان العين تقع الشقة على ورق الترشيح. تطبيق الشفط لطيف على الجانب السفلي الورقة تصفية يساعد على شد الشبكية، ولكن هذه الخطوة غير ضرورية.
- إذا بقيت أوراق سوداء من RPE على القطع فنجان العين، استخدم الملقط غرامة للطف قشر بعيداً بدءاً من أحد الزاوية (انظر الشكل 1) بينما يجلس الأنسجة في قطره الحل في المسابقة. وينبغي رفع الشبكية قبالة ورق الترشيح، كرر الخطوة فتل في 2.5.3. قد تظهر الشبكية الوردي بسبب أصباغ بصرية غير مقصور.
- كرر تشريح الشبكية ومسطحة تصاعد الخطوات في 2.4-2.6 للعين الثانية، إذا رغبت، في إبقاء الشبكية المسطحة التي شنت أول منغمسين في حل البارد الجرس. تبسيط إجراء تشريح، ويمكن وضع القطع من كلا شبكية العين على الورق مرشح واحد. مرة واحدة قد أزيلت RPE، البروتوكول يمكن أن تنفذ تحت ضوء الغرفة العادي ما لم يستلزم تجارب الظلام.
- ضع ورق الترشيح على شريحة وتقليم إلى مستطيل مع شفرة حلاقة حافة واحدة، تاركاً ~ 0.5 سم ورق الترشيح على جانبي خط شبكية العين. نقل أوراق الترشيح إلى قاعة تشريح المعدة ودفع حواف طويلة تصفية الورق في خطوط رقيقة فازلين باستخدام الملقط، وتزج شبكية العين في 3-4 قطرات حل البارد الجرس.
ملاحظة: بعض الصبغات، مثل الأصباغ محبتين، هي أفضل تحميلها في شقة يتصاعد في هذه المرحلة قبل التقطيع. وهذه يمكن تحميلها، والاشرار بعيداً مع أنسجة، وغسلها في قاعة تشريح. على سبيل المثال، الخلية ج12 بوديبي 558/568 مكثف بقع الشبكية الأغشية ومستقبله الجزء الخارجي (انظر الشكل 4A) عند تحميل في ~ 5 ميكروغرام/مل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (عادة من 23-27 درجة مئوية) وتليها يغسل في الحل في المسابقة الزائدة . - نقل قاعة تشريح لمرحلة تقطيع اللحم والأنسجة وضع الحافة الطويلة على طول خط ملحوظ آمنة الدائرة تنتهي إلى المرحلة مع الشريط المختبر. ابتداء من نهاية واحدة، قص الشبكية وتصفية الورق باستخدام الضغط الثابت، ولطيف على تشريح الذراع. الشيك الذي تم قص الشريحة الأولى تماما، ثم استخدم الميكرومتر لقطع ~ 400 ميكرون شرائح.
- تجميع سلم التصوير.
- سلم مكان قاعة تشريح مع شرائح المقاطع الشبكية في طبق بتري من الخطوة 1.7 المتاخمة للتصوير (انظر الشكل 1E). ملء الطبق مع الحل الباردة المسابقة إلى غمر محتوياته.
- استخدام الملقط وحفظ الشرائح المغمورة، بلطف نقل شرائط من ورق الترشيح والشبكية للسلم بانزلاق طبق بيتري من اليسار إلى اليمين. الحرص على عدم لمس شبكية العين مباشرة. تدوير الشرائح من 90° ودفن حواف الورقة عامل التصفية في فازلين.
- ضع الشرائح الشبكية ناعما في السلم مع الملقط حتى تكون مرئية بوضوح تحت المجهر تشريح طبقات الشبكية (انظر الشكل 1). للشرائح في نهاية كل من السلم، ضمان أن تواجه الأنسجة إلى الداخل تجاه الشرائح الأخرى لتقليل الحركة للأنسجة أثناء الحقن أو التدفق. تجاهل أي الشرائح الشبكية التي ليست كذلك التقيد بورق الترشيح (انظر الشكل 2 أ).
- إذا رغبت في ذلك، تحميل الأصباغ إلى شرائح الشبكية في هذه المرحلة وتغسل في حل الزائدة المسابقة قبل التصوير.
ملاحظة: يوديد Propidium (PI) وهويشت 33342 قوة وصمة عار النوى الميت وكافة الخلايا، على التوالي (انظر الشكل 2)، عندما المحتضنة مع الشرائح الشبكية في 5 ميكروغرام/مل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تيتراميثيلرهوداميني (تمرم) يتراكم في الميتوكوندريا ريسبيرينج بنشاط في جميع أنحاء الشبكية عند المحتضنة في 1 نانومتر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. - بينما يتم تلوين الشرائح، يعد جهاز التصوير الدائرة والحقن. استخدام المحاقن لتدفق الأنابيب مع الحل للمسابقة وتطهير فقاعات، وإرفاق نهاية مفتوحة الأنابيب إلى مدخل غرفة التصوير وإغلاق محبس الحنفية. إزالة المحاقن وملء مع reagent(s) للحقن، ثم إرفاقه بالأنابيب.
- استخدام الملقط لنقل ساترة مع الشرائح الشبكية إلى غرفة التصوير، الضغط ساترة إلى نقطة هلام البترول قرب حافة مدخل قاعة التصوير (انظر الشكل 1 ح). ملء قاعة التصوير مع الحل للمسابقة لتغطية شرائح.
3-تصوير الشرائح الشبكية
- مكان قاعة التصوير شغلها مع جهاز حقن متصلة على المسرح مجهر [كنفوكل] تستقيم مزودة بمياه X 20 أو 40 غمس العدسة. تأمين قاعة التصوير مع مقاطع المرحلة.
- انخفاض العدسة غمس على السلم، والتركيز على شريحة في نهاية واحدة من السلم تحت ضوء خافت مضيئة عبر. فحص كل شريحة للتوجه عرضية، ووجود قطاعات الخارجي مستقبله، والتصاق آمنة لورق الترشيح.
- قم بتحديد الشريحة أفضل للتصوير بمرور الوقت وتكوين برنامج المجهر للحصول على الصور انقضاء الوقت. ويوجز الجدول 4 إعدادات التصوير نموذجية لعلامات مضيئة والأصباغ المختلفة.
ملاحظة: معدل اقتناء الصورة ستختلف المجهر، marker(s) الفلورسنت، والعملية البيولوجية التي تجري دراستها. على سبيل المثال، استخدام دقة 800 × 800 بكسل وسرعة المسح الضوئي المايكروثانيه بيكسل 2 معدل إطارات 10-s للتصوير ديناميات الكالسيوم في فوتوريسيبتورس مع GCaMP3 وصبغة حمراء.- إذا كان متوفراً، استخدام البرمجيات لتتبع المعالم المادية في الشريحة (شرائح الخارجي مستقبله، الهيئات الخلية، نوى) للمساعدة في إعادة توجيه المحتملة أثناء الفاصل الزمني. أيضا إعداد البرنامج لرصد الأسفار في الوقت الحقيقي عبر الشريحة.
- البدء بتصوير ورصد خط الأساس الأسفار. عندما تستقر الأسفار عبر الشريحة (عادة خلال 2-5 دقائق)، المضي قدما في التجربة. للحقن، فتح محبس الحنفية حقنه، ثم ببطء كساد ورسم مرة أخرى على المكبس مرتين للمعونة الاختلاط.
ملاحظة: على سبيل المثال، إلغاء الوظيفة المتقدرية بالحقن حل مركزة من بروتونوفوري ااحد التوصل إلى تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في قاعة التصوير. وهذا يدفع قوي Ca2 + انفجار في سيتوسول مستقبله عنها جكامب، ثم انخفاض مطرد في غشاء الميتوكوندريا المحتملة عنها تمرم. - عن كثب رصد الشرائح من الانجراف خلال التجربة، واستخدام البرامج لإجراء التعديلات الصغيرة وفقا للمعالم المادية. عادة الانجراف في الاتجاه-Z أثناء الحقن أو نضح < 5 ميكرومتر.
4-تصوير الشرائح الشبكية خلال تجارب التروية فيها تغيير الحلول أو تتدفق باستمرار
ملاحظة: التصوير الشبكية شرائح أثناء تجارب التروية حيث يتم تغيير الحلول أو تتدفق باستمرار هي مشابهة للإعداد لتجارب التصوير أو حقن ثابتة، مع إدخال التعديلات التالية.
- بدلاً من سلالم فازلين هو موضح في الخطوة 1، 4، استخدام سلالم الشمع أكثر ثباتا لعقد الشرائح الشبكية ثابت أثناء تدفق الحل.
- ضع اثنان اسطوانات متوازية صغيرة من الشمع الأسنان النكهة ~ 0.5 سم بعيداً عن ساترة. على سطح مستو، استخدام إبهام للضغط على كل اسطوانة السقوط والخروج نحو حافة موازية ساترة. نقاط على حد سواء (انظر الشكل 1E، الجانب الأيمن) ثم مسحه اسطوانات مسطح أفقياً مع ساترة #1 طبقة رقيقة من الفازلين بين الشمعية مع ملعقة.
- عند تجميع سلم التصوير في خطوة 2.10.2، اضغط على حواف شرائح ورق الترشيح إلى عشرات الشمع باستخدام الملقط غرامة (الشكل 1).
- لإعداد التروية في الخطوة 2، 12، ملء الخزانات المحاقن مع حلول بريوكسيجيناتيد، أو استخدام المشعب الغاز الاختياري للحلول في كل خزان الأوكسجين. مسح جميع الأنابيب مع الحل للمسابقة، وضمان تدفق جميع خطوط عند فتح وإزالة فقاعات كبيرة.
- قبل ملء قاعة التصوير في الخطوة 2، 13، استخدام المحاقن لمكان آخر نقطة هلام البترول أكثر من كل زاوية مكشوفة ساترة للحيلولة دون انزلاق جانبياً أثناء التدفق.
- عندما تملأ قاعة التصوير والتي شنت على مرحلة مجهر، قم بتشغيل المضخة وتوصيل أنابيب المضخة. اختبار تدفق الحل المسابقة واستخدام ميكروبوسيتيونير أن يوضع أنبوب المضخة على الدائرة إلى الخارج حيث أن كميات صغيرة من السائل يتم رسمها قبل تجاوزات الدائرة (عادة ~ 1 مم فوق سطح الحل لمعدل تدفق 2 مل/دقيقة). يبقى الحل في المسابقة المتدفقة أثناء تحديد الشرائح في الخطوة 3.4.
- لإجراء هذه التجربة في الخطوة 3.4 التروية، التبديل تدفق الحلول عن طريق إغلاق محبس الحنفية الحل الأول أثناء فتح للحل الثاني.
- على سبيل المثال، إلى استنزاف خارج الخلية نا+ من دائرة التصوير، استخدم خزانان حقنه مليئة بالمسابقة للحل أو Na+--مجاناً الحل (الجدول 3). تدفق الحل في المسابقة لإنشاء خط الأساس، ثم قم بالتبديل إلى نا+--مجاناً الحل. هذه النتائج في كاليفورنيا سيتوسوليك كبير2 + زيادات في قطاعات الخارجي مستقبله وهيئات الخلايا (انظر الشكل 4).
- لنظم نضح الجاذبية، ورصد مستوى الحل في كل خزان ولذلك معدل التدفق المستمر أثناء التصوير. أعلى قبالة الخزانات حسب الحاجة مع حلول اﻷوكسيجين، أو الحفاظ على الأوكسجين المستمر محتدما مع مشعب غاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مستقرة لتحديد المواقع واتجاه شرائح عرضية هي المفتاح لتصوير ناجحة مع حقن أو نضح من وكلاء الدوائية. بعناية دراسة وتغيير موضع الشرائح قبل تصوير [كنفوكل] حسب الحاجة لضمان جميع طبقات الشبكية هي مرئية (الشكل 2A، شريحة الثاني). إذا كان يتم تدوير شريحة قليلاً إلى الأمام (الشكل 2A، الثالث شريحة) وحزم من شرائح الخارجي ستكون مرئية ويمكن إجراء تعديلات صغيرة مع الملقط لإحضار طبقات الشبكية المرغوبة إلى التركيز. شرائح ضعف التقيد بورق الترشيح (الشكل 2A، شريحة أنا) أو الاحتفاظ RPE (الشكل 2A، شريحة الرابع) لا ينبغي أن تستخدم للتصوير بمرور الوقت.
خلية صلاحية أمر بالغ الأهمية لمراقبة العمليات الفيزيولوجية السابقين فيفو؛ بقاء خلية وصمة عار مثل يوديد propidium (PI) ينصح للاعتداء الصحة الخلية أثناء ممارسة تشريح الشبكية. سوف تتراكم الخلايا الميتة قرب حافة قطع جميع شرائح PI في نويات بهم (الشكل 2B، لوحات اليسار)، بينما 5-10 ميكرون أعمق في الشريحة، وخلايا صحية عادية مورفولوجية وتلطيخ بي لا يمكن تصويرها. على سبيل المثال، في فوتوريسيبتورس، تعرض الخلايا سلبية بي أسفل حافة قطع عادة مورفولوجيا الاستقطاب، ممدود نمطية (الشكل 2B، لوحات الحق). فوتوريسيبتورس البقاء في الشرائح الشبكية لمالا يقل عن 4 ح عند تخزينها في حل اﻷوكسيجين المسابقة.
يمكن تصور العديد من الهياكل الخلية الشبكية باستخدام تركيبات من علامات المعدلة وراثيا والأصباغ؛ يتم عرض مثال [كنفوكل] صور جديدة الشرائح الشبكية مع وسم الفلورسنت مزدوجة وثلاثية في الشكل 3. تصور ديناميات مخروط مستقبله هيولى (ER) بالنسبة إلى النواة، يمكن كونتيرستينيد الشرائح الشبكية من الأسماك المحورة وراثيا معربا عن التجارة والنقل المستهدفة لمخروط ER17 مع صبغة النووي (الشكل 3A). ويمكن استخدام استراتيجية مماثلة لعرض cytoskeleton أكتين استخدام الشرائح الشبكية من الزرد المعدلة وراثيا معربا عن الأكتين تنصهر فيها بروتينات فلورية خضراء18 (الشكل 3B). مع آخر خلية محددة المروج، يمكن المسمى مع تدتوماتو البروتين الفلورسنت الأحمر19 خلايا مولر وتصور في الشرائح الشبكية (الشكل 3، أعلى اللوحة). ويمكن امتصاص الجلوكوز في الشبكية جزيئي في فيفو بها شفويا جافاجينج الزرد الكبار مع فلورسنت جلوكوز تناظرية (نبدج)، الذي يصبح دمج الخلايا المرئية في شريحة شبكية21 (الشكل 3، اللوحة السفلية). مزدوجة الزرد المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم لرصد عمليات الخلية أو أنواع الخلايا جنبا إلى جنب، مثل Ca2 + الديناميات في نوع فرعي الأقماع متعددة. يظهر الشكل 3D نظام وضع العلامات ثلاثية لهذا النوع من التجربة، مع تدتوماتو المعرب عنها في الطول الموجي الطويل والأقماع2 جنبا إلى جنب مع استهداف ميتوتشوندريالي Ca2 + أجهزة الاستشعار (ميتو-جكامب) المعرب عنها في جميع الأقماع22 ووصمة عار نووية.
تصوير مرور الوقت من خلايا الشبكية ميزة أساسية من هذه الشريحة الإعدادية. على سبيل المثال، يمكن ملاحظة Ca2 + تقلبات في مخروط مستقبله سيتوسول وكمياً في وقت لاحق خلال الدوائي التلاعب، تجربة هو مبين في الشكل 4. ويبين الشكل 4A الشرائح الشبكية يعبر عن Ca2 + استشعار جكامب2 (أعلى) أو عنصر التحكم اجفب16 (أسفل) في مخروط فوتوريسيبتورس كونتيرستينيد مع صبغة محبتين أحمر. في هذه التجربة زف نا+ isotonically من دائرة التصوير باستخدام التروية، تستحضر الزيادات الكبيرة في سيتوسوليك Ca2 + للجزء الخارجي وجسم الخلية كما يتبين من جكامب (الشكل 4A، أعلى اللوحة). شرائح الأسفار الشبكية Ca عن2 +-اجفب حساسة لا تتأثر بهذا العلاج (الشكل 4A، اللوحة السفلية). يمكن تحليل أفلام انقضاء الوقت باستخدام البرمجيات إيماجيج لعزل وتحديد الاستجابات الأسفار من مخروط واحد شرائح الخارجي والهيئات الخلية ونهايات (الشكل 4 باء).
| تكملة الحل | ||
| 50 X الأسهم * تركيز (مم) | تركيز عمل (مم) | |
| د-الجلوكوز | 500 | 10 |
| لاكتات الصوديوم | 50 | 1 |
| بيروفات صوديوم | 25 | 0.5 |
| لام-الجلوتامين | 25 | 0.5 |
| الجلوتاثيون مخفضة | 25 | 0.5 |
| حمض الأسكوربيك | 15 | 0.3 |
| * تخزين مختبرين في-20 درجة مئوية < 6 أشهر؛ إضافة جديدة للحل في المسابقة | ||
الجدول 1. مكونات 50 X تكملة الحل الأسهم وتركيزات العامل النهائي.
| الحل في المسابقة | |
| تركيز (مم) | |
| كلوريد الصوديوم | 133 |
| بوكل | 2.5 |
| ·2 كاكل 2 ح2س | 2 |
| NaH2بو4 | 1.5 |
| ·2 مجكل 6 ح2س | 1.5 |
| حبيس | 10 |
| pH إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم | |
| تخزين في درجة 4 مئوية في زجاجة معقمة < 1 شهر | |
الجدول 2. مكونات الحل القياسية المسابقة.
| نا+--مجاناً الحل للمسابقة | |
| تركيز (مم) | |
| تريس | 147 |
| قائمة توافق الأجهزة | 120 |
| بوكل | 1 |
| ·2 كاكل 2 ح2س | 2 |
| خ2ص4 | 1.5 |
| ·2 مجكل 6 ح2س | 1.5 |
| حبيس | 10 |
| pH إلى 7.4 استخدام HCl | |
| تخزين في درجة 4 مئوية في زجاجة معقمة < 1 شهر | |
الجدول 3. مكونات نا+--مجاناً الحل للمسابقة.
| إعدادات تصوير [كنفوكل] | |||
| فلوروفوري | الإثارة | تصفية الانبعاثات | |
| الطول الموجي | كثافة الليزر | ||
| التجارة والنقل (بما في ذلك جكامب) | 488 نانومتر | 2-5% | اجفب أو اليكسافلور 488 |
| تدتوماتو | 559 شمال البحر الأبيض المتوسط | 5% | 594 اليكسافلور |
| PI | 559 شمال البحر الأبيض المتوسط | 2% | PI |
| هويشت 33342 | 405 نانومتر | 1% | DAPI |
| نبدج | 488 نانومتر | 10 ٪ | اجفب أو اليكسافلور 488 |
| ج12 558/568 بوديبي | 559 شمال البحر الأبيض المتوسط | 1% | 594 اليكسافلور |
| تمرم | 559 شمال البحر الأبيض المتوسط | 3% | طلب تقديم العروض |
الجدول 4. شروط التصوير لعلامات مضيئة والأصباغ التي قدمت في الفترة من 2-4 أرقام.
رقم 1. التخطيطي لإعداد الشرائح الشبكية الزرد الطازجة. (أ) تشريح بعيداً فنجان العين، وتجاهل العدسة والصلبة (الخطوة 2.4.1.). (ب) قطع فنجان العين إلى ثلاثة أجزاء؛ تجاهل قطعة حافة صغيرة (الخطوة 2.4.2.). (ج) سحب أوراق الترشيح تحت القطع فنجان العين مع الشبكية الداخلية التي تواجه اتجاه ورق الترشيح (الخطوة 2.5.1.-2.5.2.). (د) سطح الشبكية باستخدام منشفة ورقية الفتيل الحل في المسابقة إلى الأسفل من خلال ورق الترشيح (الخطوة 2.5.3.)، ثم بلطف قشر بعيداً المتبقية RPE مع الملقط (الخطوة 2، 6). نقل ورقة تصفية إلى قاعة تشريح في مرحلة تقطيع اللحم والأنسجة وقطع 400 ميكرون شرائح (خطوات 2.8.، 2.9.). (ه) نقل تقطيع الدائرة مع شرائح وسلم الشمع أو الفازلين على طبق بيتري من الحل للمسابقة (الخطوة 2.10.1.). (و) استخدام الملقط غرامة للشرائح شرائح مفردة من قاعة تشريح سلم مع الحفاظ على شرائح المغمورة. (ز) تدوير ورق الترشيح شرائط 90 ° (أسود) ودفن حواف الورقة عامل التصفية في الشمع أو هلام البترول (الخطوات 2.10.2.-2.10.3.). (ح) التخطيطي دائرة التصوير النهائي محملة بسلم وشرائح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. أمثلة على الشبكية الزرد طازجة شرائح عرض الالتصاق السليم لورق الترشيح وبقاء الخلية. (أ) صورة برايتفيلد طازجة شرائح الشبكية في سلم فازلين. عرض شرائح ثانيا وثالثاً التصاق جيدة وطبقات الشبكية عرضية. شرائح الأول والرابع قد احتفظت RPE كبيرة، أو منحنية جداً وليس جيد يلتزم ورق الترشيح، وينبغي أن لا يتم أخذ صورة عنه. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) من أعلى إلى أسفل زي المونتاج شريحة الشبكية الطازجة من الزرد المعدلة وراثيا معربا عن اجفب في فوتوريسيبتورس مخروط (Tg(gnat2:eGFP)16). صبغ هويشت تسميات جميع النوى؛ كونتيرستينينج (PI) يوديد propidium تسميات نويات الخلايا الميتة، التي تظهر بالقرب من حافة قص الشريحة (إلى اليسار). حجم الخطوة المكدس Z = 1 ميكرومتر؛ شريط المقياس = 20 ميكرومتر. ظروف التصوير الفلورسنت وترد في الجدول 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. عينة من الصور [كنفوكل] مزدوجة وثلاثية المسمى السابقين فيفو الشرائح الشبكية من الزرد الكبار المعدلة وراثيا- (أ) نظام التصوير اللونين توظيف المعدلة وراثيا بروتينات فلورية خضراء معلم هيولى في الأقماع (Tg(gnat2:calr-GFP)17، أعلى) مع هويشت النووية كونتيرستين (الأزرق، أسفل). (ب) معلم بروتينات فلورية خضراء أكتين في الأقماع (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18، أعلى) مع هويشت النووية كونتيرستين (الأزرق، أسفل). (ج) طلب تقديم العروض المسماة خلايا مولر (Tg(GFAP:tdTomato)19، أعلى) من الزرد تغذية الفلورسنت الجلوكوز (نبدج) مما يدل على امتصاص الجلوكوز في الأقماع20،21 (الأخضر، أسفل). (هذه الصورة من الشكل 2B من كانوو, et al. 21) (د) مثال من ألوان التصوير باستخدام مزدوج الزرد المحورة وراثيا. اليسار، وطلب تقديم العروض الموجهة لمخروط الطول الموجي الطويل فوتوريسيبتورس (Tg(trβ2:tdTomato)2). مركز، بيوسينسور الكالسيوم جكامب المستهدفة لمخروط مستقبله الميتوكوندريا (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). الحق، وتراكب صور تدتوماتو (أرجواني) وميتو-جكامب (الأخضر)، وكونتيرستين النووية هويشت (أزرق). الصور أقصى شدتها Z-إسقاطات للإطارات 9 على مدى عمق أنسجة 7 ميكرومتر؛ مقياس أشرطة تمثل 10 ميكرون. فلوري التصوير شروط ترد في الجدول 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. Ca2 + التصوير مع اجفب جكامب والتحكم- (أ) الصور الممثل الشرائح الشبكية جديدة معربا عن الفلورسنت Ca2 + بيوسينسور جكامب (gnat2:GCaMP32، أعلى) أو اجفب (أسفل) في المخروط فوتوريسيبتورس. اليسار، الشرائح عند خط الأساس؛ الحق، وشرائح 2 دقيقة بعد أن كان isotonically المنضب نا+ من دائرة التصوير استخدام التروية للحل المسابقة على أساس تريس، الذي يعوض Ca2 + في فوتوريسيبتورس. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرومتر-شروط التصوير الفلورسنت وترد في الجدول 4. (ب) يعني التغييرات الأسفار من المقصورات مستقبله واحد (شرائح الخارجي والهيئات الخلية ونقاط الاشتباك العصبي) أثناء تصوير انقضاء الوقت لاستنفاد نا+ . شرائح تم تصويرها كل 10 كان تطبيع الأسفار من جكامب أو اجفب إشارة من صبغ الغشاء s، مكدسات تم معالجتها باستخدام إيماجيج، و. خطوط متصلة، جكامب (n لشرائح الخارجي = 15، الهيئات الخلية = 24، نهايات = 26)؛ الخطوط المتقطعة، اجفب (n لشرائح الخارجي = 26، الهيئات الخلية = 20، نهايات = 31). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
السابقين فيفو تصوير الشرائح الشبكية الزرد الطازجة وقد ثبت أن تكون أداة متعددة الاستخدامات لدراسة علم الأحياء20،،من2122، وهي فريدة من نوعها في ذلك فإنه يمكن تحليل الخلايا المفردة في ناضجة، تماما الشبكية المتباينة. مع الممارسة، من الممكن إجراء تجارب متعددة مع الأنسجة من سمكة واحدة، حتى باستخدام شرائح المسلسل من نفس الجزء من الشبكية. بالإضافة إلى التحديات والاقتراحات فيما يتعلق بإعداد الشرائح الشبكية البرمائية للكهربية دراسات14، هناك اعتبارات هامة لتصوير التجارب.
فوتوريسيبتورس، يرتبط بقاء الخلية عموما مع مورفولوجيا الخلايا، ولذلك من المهم التعامل مع الشبكية الحساسة الحد الأدنى، لا سيما بعد RPE قد أزيلت. بعد تشريح، استخدام الملقط غرامة للشريحة بعناية الشرائح أفقياً بعيداً عن قاعة تشريح (الشكل 1F) نقلها إلى السلم بدلاً من رفع شرائح مباشرة وتبقى دائماً شرائح غارقة في الحل للمسابقة. إذا كان ذلك ممكناً، قم بتجميع سلم الشرائح الشبكية قرب المجهر [كنفوكل] لتقليل الضرر إلى شرائح من الهز أثناء النقل.
التصاق قوية من نسيج الشبكية لورق الترشيح أمر بالغ الأهمية لإنشاء الشرائح التي ستبقى مستقرة خلال تجارب الحقن أو نضح. من الضروري أن تفحص بعناية كل شريحة مورفولوجية والاستقرار قبل التصوير (الشكل 2A)؛ التنصت على الجدول المجهر بلطف أثناء عرض شريحة الحركة من خلال عدسة العين [كنفوكل] يكشف عن الاستقرار لشريحة معينة. وعلى الرغم من الاحتياطات، الانجراف في الاتجاه-Z أثناء الحقن أو نضح يمكن أن تمثل تحديات للتحليل، حتى أنها مفيدة لتحميل صبغة تحكم، مثل محبتين الأصباغ للأغشية والميتوكوندريا، إلى ستابلي تسمية هيكل خلية يمكن تحديدها ل التطبيع (الشكل 4A، أرجواني). إذا شرائح الانجراف > 10 ميكرون في Z-الاتجاه قد لا تكون ممكنة لاستخراج بيانات خلية واحدة قابلة للاستخدام. يمكن تصحيح الانجراف معتدلة في اتجاه X-Y في مرحلة ما بعد المعالجة باستخدام برامج التسجيل مثل مولتيستاكريج إيماجيج (RRID:SCR_002285).
الأسفار علامات في الشرائح الشبكية تحت ظروف ثابتة، وينبغي أن تظل مستقرة، على الرغم من أن فوتوبليتشينج يمكن أن تحدث أثناء التصوير. وينبغي الحرص على تقليل التعرض لليزر أثناء الوقت هفوات بصقل المعلمات مثل كثافة الليزر، تفحص السرعة، ومعدل الإطار. ينصح بتصوير عناصر التحكم لكل علامة نيون تستخدم. تتضمن عناصر التحكم بالحقن أو بيرفوسينج حل للمسابقة دون وكلاء الدوائية في تجارب منفصلة، أو إجراء تجارب التصوير مع علامات غير بيوسينسور فلوريس مؤثرا.
اعتماداً على الإثارة [كنفوكل] الليزر المستخدمة، يمكن أن تسهم في أوتوفلوريسسينسي أصباغ في RPE وحتى توليد الحرارة أثناء التصوير، ولذلك من المهم لإزالة معظم هذا النسيج قبل تشريح. داركادابتينج الإيدز الحيوانات في إزالة RPE مع التقليل من الأضرار الكامنة وراء الشبكية. عدم القدرة على الصورة RPE قيد هذا إعداد شريحة، على الرغم من أن هذا قد يمكن التغلب عليها باستخدام الحيوانات ألبينو مع RPE شفافة. ثمة قيد آخر أن خلايا العقدة الشبكية واقدام نهاية خلايا مولر قد تصبح تحجب من عرض الورقة التصفية؛ كإعداد بديل شبكية العين قد تكون مسطحة شنت مع الجانب مستقبله إلى أسفل على ورق الترشيح وشرائح ثم تقديم رؤية أكثر وضوحاً للشبكية الأعمق. من المهم أيضا أن نلاحظ أن الإسقاطات الأفقي الطويل لبعض الخلايا، مثل خلايا أماكريني ميدانية واسعة، قد تكون مقطوعة خلال التشريح أو تقطيع. حد نهائي أن العديد من الأصباغ الفلورية تتراكم نونسبيسيفيكالي في الجزء الخارجي المتعلق بمستقبله، ولذلك فإنه من المستحسن استخدام جينياً ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية بدلاً من الأصباغ مؤشر لهذا الجزء من الشبكية.
نظراً لاتساع نطاق مراسل خلية الفلورسنت المتاحة الأصباغ23،24 للأنسجة وترميز وراثيا الفلورسنت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المستخدمة بنجاح في الزرد2،،من34، 5ويمكن أن يستخدم هذا إعداد شريحة لدراسة العمليات البيولوجية العديدة في العديد من أنواع الخلايا الشبكية (انظر الأمثلة في الشكل 3، الشكل 4). التصوير طازجة شرائح الشبكية باستخدام خلية حية مجهرية فائقة القرار يمكن أن توفر أفكاراً جديدة مثيرة لوظيفة الشبكية والصحة على مستوى سوبسيلولار. علاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتصوير السابقين فيفو الماوس الشرائح الشبكية25. بينما يتطلب النجاح في إعداد الشرائح الشبكية الطازجة الممارسة، أنها أداة قوية مفيدة لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة الخاصة بالخلية البيولوجية في شبكية ناضجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونشكر رالف نيلسون ودانيال بوثين لتوجيه مدروس أثناء وضع هذا البروتوكول، وايفا Ma وجورج أشلي ستانتون غيل لتوليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا مستقرة. وأيده العمل جبهة الخلاص الوطني جرفب 2013158531 للشخص، 5T32EY007031 نيي المعاهد الوطنية للصحة للمراحيض والشخص، و EY026020 إلى J.H. ونشره
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
