Summary
마우스 감염 및 위장 미생물으로 인 한 질병 연구에 귀중 한 비보에 모델을 나타냅니다. 여기, 세균성 식민과 헬리코박터 파일로리의 마우스 모델에서 histopathological 변화를 공부 하는 데 사용 하는 방법 설명-관련 질병.
Abstract
헬리코박터 파일로리 는 세계 인구의 절반에 사망률 및 인 간에 있는 사망률의 중요 한 원인이 위 병원 체 이다. 여러 마우스 모델 위 헬리코박터 감염의 분자 및 세포 메커니즘에 의하여 헬리코박터 박테리아 인간의 호스트의 위 식민지와 원인 질환 연구 개발 되었습니다. 여기, 우리는 프로토콜을 설명: 1) 세균성 정지 intragastric gavage; 통해 쥐의 비보에 감염에 대 한 준비 2) 연쇄 반응 (PCR)와 가능한 계산;에 의해 마우스 위 조직, 세균성 식민 수준을 결정합니다 그리고 3) 조직학 병리학 변화 평가. 설정 하려면 Helicobact어 쥐에 감염, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 먼저 정지 (≥105 식민지 형성 단위, CFUs를 포함 하는) 중 헬리코박터 파일로리 의 마우스 식민지 긴장의와 주사는 또는 다른 위 Helicobacter 종 동물에서와 같은 헬리코박터 felis. 적절 한 시간-포인트 후 감염에서 위장 excised 고 해 부 sagittally 2 개의 동등한 조직 파편으로 동굴 및 본문 영역을 구성 하는 각각. 다른 조직학 처리를 거쳐야 하는 동안 이러한 조각 중 하나는 가능한 계산 또는 DNA 추출에 사용 됩니다. 세균성 식민과 뱃속에 histopathological 변경 Warthin-별이 빛나는, Giemsa 또는 Haematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩으로, 적절 한으로 얼룩진 위 조직 단면도에 정기적으로 평가 될 수 있습니다. 추가 면역 분석 또한 immunohistochemistry 또는 면역 형광 마우스 위 조직 단면도에 의해 이루어져야 수 있습니다. 아래에 설명 된 프로토콜으로 인간 관련 헬리코박터 에 닮은 위 pathologies의 쥐에 있는 평가 수 있도록 설계 된 질병, 염증, 선 위축 및 림프 여 포 형성을 포함 하 여. Inoculum 준비 및 intragastric gavage 프로토콜 쥐, 살 모 넬 라 Typhimurium 등 Citrobacter rodentium식민지 다른 장의 인간 병원 체의 병 인 연구에 적응 될 수 있습니다.
Introduction
헬리코박터 파일로리 감염률 801순서 것으로 추정 하는 개발 도상국에서와 전 세계에 걸쳐 나선형 모양, 그람 음성, 인간의 위 병원 체 모든 인구에 이다. 하지만 대부분 헬리코박터-감염 된 개인은 무 증상, 일부 더 심각한 질병, 소화 궤에서 위 암2까지 개발. 헬리코박터-관련된 암은 상피 세포 (GECs)의 악성 변화에 의해 또는 형성에 의해 여분 꾸벅꾸벅 졸 기 림프 조직 위장, 위 선 암에 결과 또는 점 막 관련 림프 광범위 하 게 특징 이다 림프 조직 (맥 아), 각각. 헬리코박터 는 매우 다양 한 독성 요인 및 준수, 성장과이 틈새 시장에서 신진 대사를 촉진 하는 메커니즘의 존재로 인해 위장의 가혹한 생태 틈새에서 살아남기 위해 적응 된다. 특히 헬리코박터 의 악성 긴장 보유 40 kb cag 인코딩하는 유형 4 분 비 시스템 (T4SS)3,4의 생산에 필요한 약 30 유전자 Pathogenicity 섬 (cag파이) . cag 파이-긍정적인 헬리코박터 긴장의 위 선 암5필수적인 전조로 연루 되어 호스트에 만성 염증의 높은 수준의 유도와 관련 된.
Vivo에서 동물 모델, 특히 쥐, 되었다 매우 유익한 호스트, 헬리코박터 감염 및 질병 결과6세균성과 환경 요인의 상대적 기여를 조사 연구 함으로써. 학문은 그 연장 헬리코박터 설명 했다 이전에 개발에 만성 위 염과 동맥의 결과 유전 배경 C57BL/6 쥐의 감염 위축, 헬리코박터 감염7의 두 특징. 또한, 감염 관련된 고양이/개 세균 종, H. felis, 비슷한 병 리 및 질병 진행 인간의 맥 아 림프 종8,9에서 보듯이 쥐 몰 트 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 가장 일반적으로 사용 하는 헬리코박터 파일로리 마우스 식민지 연구에 격리 "시드니 스트레인 1"은 (SS1) 스트레인10, cag파이+ 하지만 비 기능 T4SS (T4SS−)11. 다른 널리 사용 되는 긴장 포함 헬리코박터 B128 7.13 (cag파이+/T4SS+)12 과 X47 2AL (cag파이-/T4SS−)13. H. felis 감염, CS1 스트레인에 대 한 ("고양이 나선형 1", cag파이-/T4SS−)는 일반적으로 사용 된14.
여기, vivo에서 감염에 대 한 Helicobacter inocula, 쥐의 intragastric gavage 절차 histopathological 변경의 연구에 대 한 조직의 처리 방법의 준비를 설명 하는 프로토콜 제공 에 위. 특히,이 기사 세균성 식민을 시각화 하 고 감염 된 쥐의 위 점 막에서 몰 트 형성을 포함 한 histopathological 변화를 평가 하는 데 사용 하는 조직학 방법에 초점. 여기 설명 하는 방법 중 일부 미 등 다른 용기 병원 균의 연구에 적용할 수 있습니다. Typhimurium 또는 C. rodentium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 성장과 세균성 Inocula의 준비
- 헬리코박터 파일로리 또는 H. felis15 -80 ° C와 구성 말 혈액 한 천 (HBA) 접시에 서브 컬쳐에서의 글리세롤 주식을 녹여: 혈액 한 천 자료 2 호 ( 재료의 표참조). 변경 된 "Skirrow의 항생제 선택 보충" (vancomycin, 10 μ g/mL; 구성 된 polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µ g/mL, 암포 B, 2.5 μ g/mL); 그리고 5-10% (v/v) 말 혈액15,16. 박테리아는 혐 기성 단지 포함 하는 적절 한 가스 팩 ( 재료의 표참조), 37 ° c.에 2.5 또는 3.5 L microaerobic 조건 하에서 잘 성장
참고:이 조건 하에서 성장 하는 헬리코박터 파일로리 긴장 부 화, 1-1.5 일 후 H. felis, 외피의 적어도 2 일은 일반적으로 필요한 반면 subcultured 해야 합니다. 적합 한 문화 및 스토리지 미디어 설명에 자세히 이전15. -
마우스 감염 초기에-중간 로그 단계 문화에 대 한 세균 inocula를 준비 합니다. 각 플레이트 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물의 1-2 mL와 범람 하 여 부드럽게 한 천 배지에서에서 박테리아를 수확. 파스퇴르 펫 접시에서 정지 발음
- 또는, inocula 16-18 h15BHI 국물에 전파 된 헬리코박터 박테리아에서 준비 합니다. 이 경우에, 낮은 속도에서 2200 x g 4 ° c.에서 10 분 원심 분리 하 여 박테리아를 수집
- 단계 대조 현미경 검사 법 (100 X 목표) 아래 젖은 마운트 준비를 검토 하 여 생존 능력 및 박테리아의 운동 성을 평가 합니다. 유리 현미경 슬라이드에 국물 BHI의 10-20 μ 물방울에 박테리아의 loopful resuspending에 의해 젖은 산을 준비 합니다. H. felis, 헬리코박터보다 훨씬 더 큰 박테리아 인 경우는 haemocytometer을 사용 하 여 정확 하 게 실행 가능한 박테리아의 숫자의 개수 계산. 그램 얼룩을 수행 하 여 문화 순도 확인 합니다.
참고: 대부분의 박테리아 세균 또는 나선형 모양 (형태 변형에 따라 다를 수 있습니다.) 만약만 헬리코박터 inocula를 사용 합니다. H. felis inocula 주로 나선형 모양 박테리아. 를 포함 한다 대부분의 박테리아는 coccoid 형태, 이러한 형태의 가능한 고 마우스에서 감염을 설정 하지 않습니다 경우에 inocula을 사용 하지 마십시오. -
단계 대조 현미경 검사 법에서 필드 (100 X 목표) 박테리아의 대략적인 수를 계산 하 여는 inoculum에 박테리아의 수를 예상 하는 다음과 같은 가이드를 사용 하 여: 1 박테리아 필드 당 약 10 =6 콜로 니 형성 단위 ( CFU) 헬리코박터/mL;의 필드 당 10 박테리아 약 10 =7 CFU/mL; 필드 당 100 박테리아 = 약 108 CFU/mL, 등
- haemocytometer를 사용할 때 계산 CFU/mL는 다음 수식을 사용 하 여:
CFU/mL (4 x 4 필드에 박테리아의 평균 수) = x (희석 요소) x (104).
- haemocytometer를 사용할 때 계산 CFU/mL는 다음 수식을 사용 하 여:
-
필요한 경우 약 107– 108 CFU/mL BHI 국물에 희석 하 여 inoculum의 세균성 세포 밀도 조정 합니다.
- 최대한 세균 생존 능력을 보장 하기 위해, intragastric gavage에 대 한 inocula을 사용 하 여 준비 후 가능한 한 빨리.
- 항상 gavage 절차 (아래 참조) 후 즉시 inocula의 가능한 계산을 수행 하 여 헬리코박터 셀 밀도 생존 능력을 확인 합니다. 이건 항상 H. felis, 수로 그것은 일반적으로 문화 미디어에 고립 된 식민지를 형성 하지 않습니다. 으로이 방법은 실용적 사이 차별 하지 않습니다 광학 밀도 측정 (600) 혼자에 의해 inocula에 가능한 헬리코박터의 숫자를 확인할 수 없습니다 (즉, 세균/나선/헬리컬) 및 비-가능한 ( 즉, coccoid) 박테리아.
- 광학 밀도 값을 사용 하 여 가능한 헬리코박터 의 숫자를 추정 하는 수단으로 박테리아 inocula, 하지만 경우에, 그것은 성장 곡선을 생성 하기 위해 먼저 필요한. 이 위해, 헬리코박터 문화의 A600 값 시간이 지남에 모니터링 되며 접시 계산 하 여 결정 가능한 박테리아의 숫자에 대해 직접 상관.
참고: 표준 플랫 바닥 조직 배양 플라스 크 10% CO2 배양 기에 배치 사용 하 여 액체 매체 (섹션 1.2)에서 문화 박테리아 같은 성장 곡선 결정을 수행 하기 위한 편리한 방법이입니다. CFUs에서 얻은 모든 4-6 h 2-3 일 동안 문화의 aliquots 결정의 숫자 다음 해당600 값17비교 됩니다. 중요 한 것은, 성장 곡선으로 이러한 서로 다른 속도로 성장할 수 있습니다, 또한, 모든 변종 10% CO2에서 잘 성장 각 헬리코박터 스트레인에 대 한 메시지를 생성 합니다.
2. intragastric Gavage 헬리코박터 와 쥐의
참고: intragastric gavage의이 방법에 적용할 수는 용기 예 미 식민지 다른 세균 종 TyphimuriumC. rodentium, Listeria monocytogenes.
- 6-8 주-오래 된, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF)을 사용 하 여 헬리코박터-남성 또는 여성 쥐를 무료. C57BL/6 유전 배경으로 동물을 사용 하 여 헬리코박터 와 H. felis감염 실험에 대 한. 현재 연구에서 우리 야생-타입 (WT)를 사용 하 고 유전자 변형 C57BL/6 쥐 (노크 아웃 또는 코 동물 불리) 키 타고 난 면역 수용 체 부족.
그러나 참고: 헬리코박터 감염에 대 한 다른 유전 배경에 마우스를 사용하실 수 있습니다, 그리고, 식민지 수준 및 질병 심각도 수 있습니다 의해 영향을 받을 호스트 배경18,19의 종류. - 일회용 1 mL 주사기로 세균 inoculum (단계 1.5)를 발음 하 고 23 게이지 바늘을 부착된 일회용 폴 리 카 테 터 (6-8 cm, 길이, 내부 직경, 0.58 m m)는 제공 된 바늘을 바꿉니다. 플라스틱의 작은 스트립의 적용으로 바늘을 카 테 터를 고정 ( 재료의 표참조) 영화. 또는 살 균 플라스틱 튜브 먹이 사용 하 여 바늘/카 테 터를 교체 (20 게이지 x 38 m m).
- 물리적으로 제 목과 꼬리의 아저씨에 확고 한 그립을 쥐 지.
참고: 마 취, 없이 또는 양자 택일로, methoxyflurane 또는 isoflurane15같은 흡입된 마 취를 사용 하 여가이 절차를 수행할 수 있습니다. - 오픈 턱과 식도 쪽으로 꼬리 방향으로 가이드의 중심에 카 테 터를 삽입 합니다. 대부분까지 (그리고 기도에서) 식도 통해 위장에 대 한 액세스의 용이성 수 있도록 마우스의 목을 확장 또는 카 테 터의 모든는 더 이상 볼 수 하 고 저항 느낌, 복 부의 베이스에 해당. 특정 약 수, 일반적으로 100 μ 접종 (그림 1) 당을 제공 합니다.
참고: 마우스 ≥ 10 gavaged 해야5 CFU 최적의 식민과 질병 병 리를 보장 하기 위해. - 집 쥐에 실험의 기간에 대 한 SPF 동물 시설.
참고: 약 24 개월 감염 된 후20에 심각한 병 리와 WT C57BL/6 쥐 선 암 관찰만 됩니다. 그러나,이 효과 일부 유전자 변형된 동물, 또는 다른 유전 배경 가진 생쥐에서 가속 될 수 있습니다. - Gavage 절차의 완료 되 면 수행 가능한 헬리코박터 의 숫자를 결정 하기 위해 마일과 Misra 기술의 수정 박테리아 마우스를 관리. 이 위해,는 inoculum 직렬로 희석 (10− 1 10−5를)에서 BHI 설명 하는 방법을 사용 하 여에서 이전 세부에15.
참고: 단일 식민지의 격리 수 있도록, HBA 접시 해야 예 열 되며 사용 하기 전에 10-15 분에 대 한 생물 안전 캐비닛 또는 37 ° C 배양 기에서 건조.
3. 수확 후 실험 쥐에서 조직
- 이산화탄소 흡입 또는 동물 실험에 대 한 관련 윤리 위원회에 따르면 자 궁 경부 전위 쥐 안락사
- 복 부 구멍을 열고 위 괜 찮 아 요, 곡선가 위를 사용 하 여 삭제할.
참고: 세라 또한 헬리코박터 감염에 조직 응답의 조사에 도움이 심장 찔린 하 여 수집할 수 있습니다. 또한, spleens 및 paragastric 림프절의 컬렉션 적응 면역 응답을 공부에 유용 하다. - 큰 곡률을 따라 위 잘라내어 50 mL 튜브에 잔여 음식 부드러운 버퍼링 멸 균 인산 염 분 세척 (PBS)에 의해 제거.
- 살 균 PBS에 다시 위를 세척 하 고 젖은 무게 tared 6 cm 플라스틱 접시를 사용 하 여 기록 합니다.
- 복 부를 평평 하 고 각 구성 된 2 개의 동등한 조직 파편으로 sagittally 해 부: 동굴, 몸과 비 선 forestomach 지역 (그림 2). 비-선 영역을 제거 하 고 하나 무게 각의 절반 (가능한 계산)에 대 한 살 균 BHI의 어느 1 mL를 추가 하기 전에 위장 또는 (DNA/RNA 추출)에 대 한 액체 질소 동결 스냅.
참고: 튜브 포함 된 BHI에 조직 처리할 준비가 될 때까지 얼음에 저장 되어야 합니다. 즉석 냉동된 위 조직 또한 RNA 또는 단백질 정량 (정량 PCR) 또는 서쪽 더 럽 히 분석을 각각 추출 하 사용할 수 있습니다. - 다른 위 10% 포 르 말린을 포함 하는 15 mL 튜브에 절반을 추가 합니다. 조직 10 10% 포 르 말린에 담가 s 다음 튜브의 상단 측면에 평평 하 게 하다. 다시 24 h의 최소 10% 포 르 말린 솔루션에 immersing 전에 해결 하기 위해 조직 수 있습니다.
참고: 조직 조직학에 대 한 처리 이전에 많은 주 동안 10% 포 르 말린에 남아 수 있습니다. 그러나 조직의 장기간된 보관 수 있습니다,, 그것의 건축 및 antigenicity 다운스트림 분석에 최적의 결과에 결과 영향을.
4. 위 후 감염 세균성 식민지의 확인
-
위장에 헬리코박터 의 가능한 계산
- 보충 감염된 마우스 위장16에서 식민지 조사를 수행 하기 전에 추가적인 항생제 (200 μ g/mL bacitracin 및 10 μ g/mL naladixic 산)로 살 균 HBA 접시.
- 위 섹션 균질 하거나 수동으로 멸 폴 리 프로필 렌 micropestles를 사용 하 여 또는 기계적 분리 악기를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).
- 살 균 BHI에 결과 위 homogenates의 중복 직렬 희석 (10 10−2를− 1 )를 준비 합니다.
참고: 희석 결정 되어야 한다 주어진된 헬리코박터 에 대 한 얻은 일반 세균 부하에 따라 변형 사용 감염, 감염의 기간에 대. Undiluted 샘플도 사용할 수 있습니다. - (위의 참고 참조) 미리 말린된 HBA 접시 3 개 또는 4 개의 세그먼트로 나눕니다. 마일즈와 Misra 기술에의 적응을 사용 하 여, 10-100 mL의 각 희석 한 천 격판덮개의 세그먼트에 추가 하 고 메 마른 플라스틱 루프15를 사용 하 여 확산.
- 접시 건조 하 고 혐 기성 가스 항아리에 거꾸로 위치 (아래 뚜껑 쪽)에 그들을 배치 수 있습니다. 항아리에 습도 유지 하려면 물을 포함 하는 페 트리 접시를 포함 합니다.
- 식민지 형성 (일반적으로 4-7 일) 때까지 37 ° C에서 항아리를 품 어.
- 고립 된 식민지 10와 100 사이 포함 하는 부합을 열거 합니다.
참고: 헬리코박터 식민지와 H. felis 성장 판에는 표준 urease, 카 탈 라 제 및 산화 효소 테스트를 사용 하 여 murine 위 microbiota의 다른 구성원의 구분할 수 있습니다. 헬리코박터 와 H. felis 는 모든 3 개의 시험에 대 한 긍정적 이다입니다. - 박테리아 로드 (CFU/g의 조직)로 계산 다음 수식을 사용 하 여:
[(계산 하는 식민지의 평균 수) × (희석 비율) (볼륨 도금) x] / (위 무게).
-
위 조직에 의해 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에서 H. felis 감염의 탐지
- 표준 DNA 격리 프로토콜, 또는 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 마우스 위장에서 DNA를 추출 합니다.
- Fluorometric 정량 기법을 사용 하 여 샘플의 DNA 농도 결정 ( 재료의 표참조).
- PCR 반응 H. felis urease B 유전자 (ureB)21의 325 기본적인 쌍 (bp) 단편을 대상으로 설정 합니다. 각 반응 포함 해야 합니다: 100 ng의 genomic DNA; 앞으로의 각 1 밀리미터 (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3')와 역 (5'-CTT TTA TCC 아 그 TGG TGG CAC ACC-3') 뇌관; 200mm dNTPs; Taq 중 합 효소 및 버퍼 및 물 nuclease 무료의 적절 한 금액의 0.5 단위.
참고:이 oligonucleotide 쌍 인식 하 고 헬리코박터 와 H. felis ureB 유전자 PCR 조건 아래, 그는 ureB 에 복종 하지만 동종 시퀀스에 바인딩할 설계 되었습니다. 장 헬리코박터 종의 유전자 - 다음 온도 프로 파일을 사용 하 여 PCR 증폭을 수행: 30 94 ° C의 35 주기 다음 5 분 동안 94 ° C에서 난방, s, 61 ° C 30 s 및 1 분에 72 ° C, 20 ° c.에서 개최 전에
- 100 V에서 30 분 동안 2 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다.
5. 조직학 분석 헬리코박터의감염 마우스 위 섹션
- 위 조직의 처리
- 포 르 말린 및 깨끗 한 접시에 장소에서 위장 조직을 제거 합니다.
- 여러 동등한 크기의 경도 스트립 (각 2-3 m m 두께)으로 메스와 위 조직을 잘라내어 거품 패딩 포함 이라는 포함 카세트에.
- 위 조직을 포함 카세트 80% 에탄올으로 가득 항아리에 배치 하 여 수정.
참고: 위장 즉시 처리 또는 다음 단계로 진행 하기 전에 최대 1-2 일 동안 저장 될 수 있습니다. - 다음 설정을 사용 하 여 프로그래밍 하는 자동화 된 조직 프로세서에 프로세스 위장.
탈수: 70% 에탄올-1 사이클, 20 분; 90% 에탄올-1 사이클, 20 분; 100% 에탄올-2 사이클, 20 분 + 40 분 + 1 주기 1 주기 1 h.
지우기: 자일 렌-2 사이클, 각 30 분 + 1 주기, 45 분
임신: 파라핀 왁 스 60 ° c-1 주기, 45 분 + 1 사이클, 1 h + 1 주기, 1.25 h. - 기계에서 가공된 샘플을 제거 하 고 파라핀 포함을 위한 실내 온도에 저장.
- 파라핀 처리 위 조직 포함
- 스테인리스 기본 금형 금형의 기초를 따뜻하게 포함 단위의 단계에 놓습니다.
참고: 컴퓨터를 포함 효율적인 파라핀 포함을 위한 60 ° C에서 설정 해야 합니다. - 장소에는 왁 스를 완전히 녹이 고 때까지 포함 단위의 따뜻한 왁 스 목욕/핫 플레이트 영역으로 샘플을 포함 하는 카세트 왁 스 칠.
참고: 잠시 후 왁 스를 녹이 고 샘플 포함 될 것이 좋습니다. 이렇게 하면 조직의 경화 발생 하지 않습니다. - 파라핀 왁 스로 스테인리스 스틸 금형의 절반을 채우십시오. 따뜻한 집게를 사용 하 여 카세트와 부드럽게 밀어 복 부는 금형 베이스에 파라핀을 통해 스트립에서 위장 조직 스트립을 제거 합니다. 신중 하 게 그들의 슬라이스 끝 위쪽으로 직면 하는 금형의 기지에 직각에 직물 스트립을 찾으시는.
참고: 다음 단계에 따라 수행 되어야 한다 경화 및 임베디드 블록 내의 파라핀 층의 분리를 피하기 위해 가능한 한 빨리. 위 조직의 적절 한 방향을 다운스트림 분석에 대 한 중요 하다. - 장소에는 표본을 수정 하 고 필요한 경우 다시 조직 찾으시는 포함 단위의 차가운 접시에 금형을 놓습니다.
참고: 조직 제거 되는 파라핀 강화 하기 시작 하는 경우에, 다시 왁 스를 녹여 다시 금형에 조직을 포함 하는 뜨거운 접시에 금형 장소. - 절반 이라는 포함 카세트 (조직 처리를 위해 사용 되었다)는 금형의 상단에 배치 하 고 부드럽게 따뜻한 왁 스로 채우십시오. Overflow에 파라핀을 허용 하지 않습니다.
- 부드럽게 금형 차가운 접시에 놓고 시원한 수 있습니다.
- 파라핀 완전히 설정 했습니다, 일단 금형에서 포함 된 블록을 구분 합니다. 핫 플레이트 (80 ° C 이상 설정) 또는 스 크레이 퍼를 사용 하 여 카세트 가장자리에 깨끗 한 초과 파라핀 왁 블록 단면 수행 됩니다 때까지 실내 온도에 저장할 수 있습니다.
- 스테인리스 기본 금형 금형의 기초를 따뜻하게 포함 단위의 단계에 놓습니다.
- 조직의 단면
- 얼음에 파라핀 끼워 넣어진 조직 구획을 진정 하 고 열 40-45 ° c 초순 가득 물 목욕
- 블레이드는 톰의 소유자에서를 보호 하 고 클리어런스 각도 사이 1-5 ° 파라핀 블록을 삽입 하기 전에 블록 얼굴과 칼 면 사이 접촉을 방지 하기 위해 설정 합니다.
참고: 확인 하십시오 블록 초과 파라핀 포함에서 취득의 취소로이 블록의 적합을 방해할 수 있습니다. - 블록에 걸쳐 직선 컷에 대 한 블레이드를 찾으시는. 부드럽게 2-3 블록의 정확한 위치를 보장 하기 위해 얇은 섹션을 잘라.
- 약 10-30 m m의 두께 의해 블록을 잘라. 이 단계는 각 조직 스트립의 최대 면적 삭감 될 것 이다 보장 합니다.
- 10 µ m 및 트리밍에 의해 발생 하는 구멍을 포함 하는 삭제 컷.
- 신중 하 게 핀셋을 사용 하 여 섹션을 선택 하 고 병합에 대 한 물 욕조에 떠. 족집게를 사용 하 여 각 섹션을 구분 하.
- 물 목욕 및 충전된 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 장소에서 섹션을 수집 합니다.
- 수직 슬라이드 랙에서 슬라이드를 저장 하 고 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치 하룻밤 건조 섹션입니다.
- 섹션 무기한 후속 분석을 위해 실내 온도에 저장 합니다.
- Haematoxylin와 오신 (H & E) 위 조직의 얼룩이 지기
- 100% 에탄올, 3 분 동안에 3 세척 뒤 5 분 각, 크 실 렌의 3 세척을 사용 하 여 슬라이드에 dewax. 신선한 솔루션 각 단계에서 사용 되는 확인 하십시오.
- 슬라이드 30-60 s에 대 한 수돗물에 씻어.
- 부드럽게 종이 타월에 슬라이드의 하단을 활용 하 여 초과 물을 제거 합니다. 3 분 확인 섹션에 대 한 필터링 된 Haematoxylin와 얼룩 충분히 솔루션으로 덮여 있다.
- 린스 수돗물 물 실행 취소 될 때까지 실행 슬라이드.
- 슬라이드 8-10에 대 한 스콧의 수도 물에 담근 다. 슬라이드 10 보다 더 많은 솔루션을 제공 하지 않습니다이 s 어둡고 강렬한 얼룩 귀 착될 것 이다. 섹션의 얼룩은 현미경으로 볼 수 있습니다. 이 단계에서 효율적인 착 색 하는 것은 ' 아기 파란색 ' 색 귀 착될 것 이다.
참고: 2 g의 나트륨 수소 탄산염 (NaHCO3) 및 증류수 1 L에 황산 마그네슘 (MgSO4)의 20 g을 용 해 하 여 스콧의 수돗물을 준비 합니다. - 슬라이드 30-60 s에 대 한 수돗물에 씻어.
- 3 단계에서 설명한 대로 과잉의 물을 제거 하 고 필터링 된 1%와 함께 다음 얼룩이 수성 오신 3 분.
- 린스 수돗물 물 실행 취소 될 때까지 실행 슬라이드.
참고: 얼룩 수 부과 가벼운 현미경을 사용 하 여. 얼룩이 너무 어두운 경우, 슬라이드에 지정된 된 시간 보다 더 오랫동안 100% 에탄올 탈수 수 있습니다. 어두운 착 색 하는 것이 필요한 경우 슬라이드 수 있습니다 얼룩이 질 오신으로 1-2 분 이상, 다음 단계로 진행 하기 전에. - 30에 대 한 100% 에탄올의 3 세척을 사용 하 여 슬라이드를 탈수 s 각, 뒤에 2 분 동안 크 실 렌의 3 세척. 신선한 솔루션 각 단계에서 사용 되는 확인 하십시오.
- 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. 부드럽게 아래쪽으로 직면 하는 섹션 상단에 슬라이드를 배치 하기 전에 깨끗 한 coverslip의 센터에서 장착 매체의 한 방울을 추가 합니다.
참고: 슬라이드 덮개 미 끄 러 전에 건조 하지 마십시오. - 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 건조 공기를 허용 합니다. 슬라이드 또한 건조 시를 가속화 하는 증기 두건에서 건조 수 있습니다.
- 위 조직의 Giemsa 얼룩
- 100% 에탄올 3 분의 2 세척 및 최종 세척 3 분 확인 각 세척에 사용 되는 신선한 솔루션에 대 한 70% 에탄올에 5 분 각, histolene의 2 세척을 사용 하 여 슬라이드에 dewax.
- 슬라이드 30-60 s에 대 한 수돗물에 씻어.
- 20 %Giemsa 얼룩 소 주 80% 물으로 혼합 하 여 Giemsa 솔루션을 준비 합니다. 슬라이드 1 h Giemsa 솔루션 얼룩.
- 2-3 s 대 한 초 산의 3-4 방울을 포함 하는 증류수 100 mL에 슬라이드를 배치 합니다.
참고: 솔루션 사용 하기 잘 전에 혼합 해야 합니다. 이 단계에서 슬라이드 하늘색 컬러로 표시 됩니다. - 30 96% 에탄올에 슬라이드를 씻어 s.
- Histolene 2 분의 3 목욕 뒤 소 프로 파 놀, 각 2 분의 3 목욕에서 슬라이드에 씻어. 각 세척에 대 한 신선한 소 프로 파 놀과 histolene를 사용 합니다.
- 앞에서 설명한 대로 Coverslip 장착 매체와 슬라이드.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜 murine 마우스 모델 (그림 1) 헬리코박터 와 H. felis intragastric 감염을 달성 하는 구강 기법을 설명 합니다. 안락사, 다음 위장은 제거, 무게와 동굴, 몸과 위 조직 (그림 2)의 선 비 영역을 구성 하는 2 동등한 반으로 나누어. 선 비 지역 어떤 분석을 수행 하기 전에 제거 됩니다.
동물의 성공적인 식민지는 일반적으로 헬리코박터에 가능한 계산을 수행 하 여 확인-위 homogenates, 감염 하 고 이후에 HBA 접시 (그림 3)에 개별 식민지를 열거. 또는, PCR H. felis H. felis 와 H. pylori ureB 유전자 (그림 4)의 325 bp 지역에 구체적이 고 검증 된 프라이 머를 사용 하 여와 감염을 확인 하기 위해 채택 된다.
임베디드 및 다운스트림 조직학 애플리케이션용 sectioned 위 조직 처리 됩니다. H & E 염색 기법 헬리코박터에 histopathology를 평가 하는 데 사용 됩니다-생쥐를 감염. 현재 예제에서는 WT C57BL/6 쥐 염증, 증식 (확대 점 막), H. felis와 감염 된 후 6 개월 '에 선 위축 등의 적당 한 표시를 표시 합니다. 세포질 침투의 존재 또한 하위 점 막에서 볼 수 있습니다. 그러나 흥미롭게도,, 더 심각한 염증 코 쥐 세포 침투 (그림 5)에 가까운 근접에 있는 림프 낭의 추가 존재와 같은 시간 시점에서 관찰 됩니다. 마지막으로, H. felis 박테리아 감염된 마우스 위장 (그림 6)의 Giemsa 얼룩이 섹션에서 관찰 된다.
그림 1: 구강 기법을 보여주는 이미지. 일회용 1 mL 주사기와 유연한 테 ≥105 CFU 세균성 inocula의 intragastric 경로 통해 마우스를 제공 하는 데 사용 됩니다. 마우스는 methoxyflurane를 사용 하 여 및 식도 통해 위 카 테 터의 액세스에 대 한 수 목에 확고 한 그립에서 개최 취 했다.
그림 2: 마우스 spleens 및 위장의 수확 후 감염. 마우스 위장 수확된 후 안락사와 그들의 내용을 메스로 근 근이 고 메 마른 PBS에 세척 하 여 제거 했다. 조직에 무게 했다 그리고 각 구성 된 위 동굴, 신체와 비 선 지역; 2 동등한 반 공개 목화 시트에 병합 눈금 막대 = 10 m m.
그림 3: 가능한 카운트에 H. pylori-마우스 위장 감염. 마우스 C57BL/6 배경에 10 주사 했다7 CFU 헬리코박터 s s 1와 8 주에 대 한 왼쪽. 각 위 homogenate의 (A) 희석은 HBA 플레이트와 10-100 개별 식민지를 열거 하 여 평가 하는 세균 중의 절반 (또는 제 3)에 도금. 접시의 왼쪽된 절반 헬리코박터 박테리아의 순수한 문화를 보여줍니다. (B) 위 마우스에서 오염 세균의 존재 microbiota (왼쪽) 또는 헬리코박터 식민지 (오른쪽)의 많은 헬리코박터 CFUs 열거 복잡 수 있습니다. (C) 위 homogenate 샘플에 오염 박테리아의 일반적인 예. 눈금 막대 = 1.7 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: PCR oligonucleotides ureB 유전자를 대상으로 사용 하 여 위 생 검에서 H. felis 감염 탐지 합니다. 특정 oligonucleotide 쌍 인식 하 고 바인딩할 H. felis 와 H. pylori ureB 유전자에 동종 시퀀스 설계 되었다. 이 뇌관은 헬리코박터 s s 1에서 게놈 DNA를 사용 하 여 유효성을 검사 (2 레인) 또는 H. felis (3 차선). 이온된 수 부정적인 제어 (1 차선)으로 포함 되었다.
그림 5: H & E-얼룩진 위 대표 이미지 섹션에서 H. felis와 감염 된 후 6 개월에 WT 및 코 쥐. 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 H로 얼룩진 했다 & E. WT 쥐 BHI 국물 혼자 받는 (제어) 했다 아무 중요 한 염증과 정상적인 위장 상피. 반면, WT 동물 만성 H. felis 감염 염증의 온건한 수준을 표시 하 고에서 H. felis악화 점 막 두껍게 추가 되었다-코 동물을 감염. 조직 섹션에서 H. felis-감염 된 코 쥐 증식, 선 위축 (▶), 세포 침투 (→), 점 막 림프 모 (*)의 존재를 전시. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Giemsa 얼룩이 위 섹션에서 H. felis와 감염 된 후 3 개월에서 WT C57BL/6 마우스의 대표 이미지. 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 Giemsa로 얼룩이 있었다. 화살표는 위 동맥에서 H. felis 의 존재를 나타냅니다. 눈금 막대 = 200 μ m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서는 헬리코박터 감염에 대 한 vivo에서 마우스 모델의 사용을 설명합니다. 절차의 중요 한 단계는: 1) 포함 하는 실용적이 고 운동 박테리아; Helicobacter inocula의 준비 2) intragastric gavage;를 통해 마우스를 박테리아의 적절 한 숫자의 배달 3) 식민지 계산 및/또는 PCR; 세균 감염의 탐지 그리고 4) 위 조직의 활성화에 histopathology 평가 처리 위장 감염. 수정, 문제 해결 및 기술 고려 사항에 대 한 추가 제안 아래 설명 되어 있습니다.
혈액 한 천 자료 2 말 혈액 보충을 사용 하 여 헬리코박터 종 성장의 방법은 우리의 실험실에서 잘 설립 되었습니다. 그러나, 대체 한 기지와 같은 세라 한과 컬럼비아 혈액 한 천 사용된22에 영향을 수도 있습니다. 만 메 마른 유리 세제 무료 성장 매체를 준비 하는 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 최적의 성장을, 헬리코박터 박테리아 해야 될 정기적으로 subcultured 잔여 습기 및 건조는 한 접시에. 위해 준비할 때 헬리코박터 spp. inocula 감염, subculture 헬리코박터 에 필수적 이며 H. felis 변종 마다 1-1.5 또는 2 일 각각, 세균 생존 능력을 보장 하기 위해. 모든 하위에서 박테리아 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 그들의 생존 및 운동에 대 한 평가 해야 합니다. 그러나 Urease 분석 결과 또한 정기적으로 고용 수 위 Helicobacter 종 및 다른 박테리아23사이 차별을,, 그것은이 분석 결과 실용적이 고 실행 가능한 비 헬리코박터 박테리아 검출을 실현 하는 것이 중요 합니다. 동물의 접종, 다음 헬리코박터 정지에 가능한 카운트 quantitate 감염에 대 한 사용 가능한 박테리아의 숫자를 수행 합니다. H. felis agar 중간15에 고립 된 식민지 reproducibly 형성 하지 않습니다, 세균 수의 추정 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 수행 됩니다. 광학 밀도 측정 (600) 혼자에 의해 세균 수의 부 량으로이 방법은 실용적이 고 실행 가능한 비 박테리아 사이 차별 하지 않습니다 정확 하지 않다. (섹션 1.5) 위에서 설명한 대로 엄격한 최적화 없이 헬리코박터 연구에이 방법은 사용 하지 해야.
헬리코박터 감염 연구를 수행할 때 감염, 실험의 목적에 맞게 길이 뿐만 아니라 최적의 마우스 및 헬리코박터 스트레인, 고려 하는 것이 결정적 이다. 그것은 또한 정기적으로 동물 실험에 사용 되는 Helicobacter실제로 확인 필수-속 특정 PCR 뇌관24를 사용 하 여 무료. 종의 다른 장의 헬리코박터 , 헬리코박터 bilis, Helicobacter hepaticus 또는 Helicobacter muridarum, 같은 존재 쥐의 질병 민감성을 변경 하 고 혼동 요인으로 소개 수 있습니다. vivo에서 25,26공부 한다. 그것은 또한 정상적인 microbiota Helicobacter 식민 및 병 인도에 미치는 영향을 조사 하기 위해 초기 심사 실험에서 (즉, 먹이 국물만) 동물의 모의 치료 컨트롤 그룹을 포함 하는 것이 좋습니다.
후 안락사 murine 위장에서 헬리코박터 식민 가능한 계산 하 여 측정할 수 있습니다. 식민지 카운트에 사용 되는 HBA 접시 bacitracin 및 naladixic 산 수정된 Skirrow의 선택적 보충, 정상적인 위 microbiota에서 세균성 종의 성장을 제한 하 고 따라서 오염 방지 뿐만 아니라 보충 되어야 합니다. 27. H. felis 항상 식민지를 형성 하지 않습니다 있지만 대신 집단 성장 한 천 격판덮개15,28에 형성 하는 경향이 있다. 따라서, PCR과 정량 일반적으로 존재와 H. felis, 각각29,30의 수준 결정을 채택 된다. 섹션 4.2, 우리 murine 위 H. felis 및 헬리코박터 325 bp 지역 대상으로 검증 된 뇌관의 쌍을 사용 하 여에서 H. felis에 의해 식민지를 확인 하는 간단 하 고 빠른 PCR 방법을 도입 ureB 유전자. 이 위 Helicobacter 종 감염 urease 생산 장 간을 구별할 수는 위에서 설명한 PCR 조건 사용 하 여, Helicobacters. 위 헬리코박터 감염의 PCR 탐지에 대 한 검증 된 다른 유전자 포함는 16s rRNA flagellin B (군살) 유전자15,,2930.
마지막으로, 우리 두 강력한 착 색 기술의 사용 설명: h 조 & 전자 얼룩, 위 후 감염; histopathological 변화를 평가 하기 위해 그리고 Giemsa 얼룩, H. felis 감염을 검출 하기 위하여. 최적의 얼룩을 얻으려면, 그 조직을 보존, 처리 되었고 올바른 방향에 포함 되도록 필수적 이다. 또한, 갓 솔루션을 준비 하 고 필터링이 과정 얼룩을 사용 해야 합니다. 조직 섹션 무기한 저장 고 면역 형광 또는 immunohistochemistry 통해 위 병의 보다 구체적인 분석을 위해 활용 될 수 있습니다. 위 염증 및 질병의 몇 가지 다른 일반적인 조치 포함: 면역 세포 모집 (안티 CD45 얼룩); 점 막 두껍게/파괴 (정기 산 Schiff/Alcian 블루 얼룩); 상피 세포 증식 (증식 세포 핵 항 원, PCNA/Bromodeoxyuridine, BrDU 얼룩); 또는 세포질 apoptosis (TUNEL 염색)입니다. H 조 & H. felis-감염 된 생쥐의 전자 얼룩진 조직에 림프 낭 immunohistochemistry, B에 대하여 지시 하는 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다 (B220+)와 T 세포 (c d 3+) 항31.
요약 하자면, 세균성 질환의 동물 모델 감염 생물학의 분야에서 유용한 도구를 제공합니다. Intragastric gavage의 프로토콜 및 위장 조직의 처리 제공 여기 다른 장 병원 체를 포함 하는 마우스 감염 모델에 적용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 양 A. 드 바울은 양 조지 레이-맥 캔 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 저자는 시설의 사용 및 기술 지원의 모나 쉬 조직학 플랫폼, 부의 해부학과 발달 생물학, 모나 쉬 대학 인정합니다. 실험실은 RLF (APP1079930, APP1107930)는 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 자금에 의해 지원 됩니다. RLF는 NHMRC (APP1079904)에서 수석 연구 장학금에 의해 지원 됩니다. KD와 MC 둘 다 모나 쉬 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. KD는 또한 지원 센터에 의해 타고 난 면제 및 전염 성 질병, 허드슨 연구소, 의료 연구의 MC는의 학부, 간호 및 건강 과학, 모나 쉬 대학에서 국제 대학원 장학금. 연구에는 허드슨 연구소의 의학 연구는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
