Summary

Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques

Published: October 18, 2018
doi:

Summary

Souris représentent un modèle inestimable en vivo pour étudier les maladies infectieuses et maladies causées par des micro-organismes gastro-intestinaux. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour étudier les changements histopathologiques dans des modèles murins de Helicobacter pyloriet colonisation bactérienne-maladie liée.

Abstract

Helicobacter pylori est un pathogène gastrique qui est présent dans la moitié de la population mondiale et est une cause importante de morbidité et de mortalité chez l’homme. Plusieurs modèles de souris de l’infection à Helicobacter gastrique ont été développés pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires, par lequel les bactéries Helicobacter pylori colonisent l’estomac des hôtes humains et causer la maladie. Ici, nous décrivons les protocoles à : 1) préparer des suspensions bactériennes à l’infection en vivo de souris par gavage gastrique ; 2) déterminer les niveaux de colonisation bactérienne en tissus gastriques de souris, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et compter viable ; et 3) évaluer les changements pathologiques, en histologie. Pour établir Helicobacter infection chez la souris, animaux (SPF) exempts de micro-organismes pathogènes est d’abord inoculées avec des suspensions (contenant ≥ 105 d’unités formant des colonies, UFC) des souches colonisatrices de souris de l’ Helicobacter pylori ou autres gastrique Helicobacter spp animaux, tels que Helicobacter felis. À l’heure-points appropriés après l’infection, les estomacs sont excisés et disséqués sagittally en deux fragments de tissus égale, chacun comprenant les régions de l’antre et du corps. Un de ces fragments est ensuite utilisé pour comptage viable ou extraction de l’ADN, tandis que l’autre est soumis à traitement histologique. La colonisation bactérienne et changements histopathologiques dans l’estomac peuvent être évalués régulièrement dans des sections de tissu gastrique tachées de taches (H & E) Warthin-Starry, Giemsa ou hématoxyline et éosine, selon le cas. D’autres analyses immunologiques peuvent également être entreprises par immunohistochimie ou par immunofluorescence sur coupes de tissus gastriques de souris. Les protocoles décrits ci-dessous sont spécialement conçus pour permettre l’évaluation chez les souris des pathologies gastriques ressemblant à ceux d’anthropique Helicobacter pylori maladies, y compris l’inflammation, atrophie de la glande et la formation de follicules lymphoïdes. La préparation de l’inoculum et protocoles de gavage gastrique peuvent également être adaptées à l’étude de la pathogenèse des autres agents entéropathogènes humains qui colonisent les souris, tels que Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.

Introduction

Helicobacter pylori est un pathogène humain, Gram négatif, en forme de spirale gastrique présent dans toutes les populations à travers le monde, avec des taux d’infection dans les pays en développement, estimées à environ 80 %1. Bien que la plupart Helicobacter pylori-personnes atteintes sont asymptomatiques, certains développent des maladies plus graves, allant de l’ulcération peptique de cancer gastrique2. Helicobacter pylori-cancers associés se caractérisent globalement par modifications malignes dans les cellules épithéliales (SCAE) ou par la formation des tissus lymphoïdes extra nodales dans l’estomac, qui en résulte dans l’Adénocarcinome gastrique ou associé aux muqueuses lymphoïde Lymphome du tissu (MALT), respectivement. H. pylori est très adapté pour survivre dans la niche écologique sévère de l’estomac en raison de la présence de divers facteurs de virulence et de mécanismes facilitant son adhésion, la croissance et le métabolisme dans ce créneau. En particulier, les souches virulentes de H. pylori possèdent le 40KO cag Pathogenicity Island (cagPAI) qui encode approximativement 30 gènes nécessaires à la production d’un Type 4 sécrétion système (T4SS)3,4 . ACG PAI-positive des souches de H. pylori sont associés à l’induction des niveaux plus élevés d’inflammation chronique chez l’hôte, qui est considéré comme un précurseur essentiel de l’Adénocarcinome gastrique5.

In vivo des modèles animaux, en particulier les souris, ont été très instructives en permettant aux chercheurs d’étudier les contributions relatives de l’hôte, des facteurs environnementaux et bactériennes sur l’infection à H. pylori et maladie issue6. Des études ont démontré précédemment que prolongé Helicobacter pylori infection de la souris sur les résultats de fond génétique C57BL/6 dans le développement d’une gastrite chronique et la glande s’atrophier, les deux maîtres mots de H. pylori infection7. Par ailleurs, l’infection avec des espèces bactériennes feline/canine, H. felis, s’est avérée induire la formation de MALT chez les souris présentant une pathologie similaire et la progression de la maladie comme on le voit l’homme MALT lymphome8,9. Le plus couramment utilisé de H. pylori isolat dans les études de colonisation de la souris est la souche « Sydney 1 » (SS1) souche10, qui est ACGPAI+ mais a un T4SS non fonctionnel (T4SS)11. Autres souches largement utilisés sont le Helicobacter pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 et X47-2AL (cagPAI/T4SS)13. Pour les infections de H. felis , la souche CS1 (« Cat spirale 1 », ACGPAI/T4SS) est généralement utilisé14.

Ici, nous fournissons un protocole décrivant la préparation des inoculums de Helicobacter pour in vivo de l’infection, la procédure pour gavage intragastrique de souris, ainsi que des méthodes pour le traitement des tissus pour l’étude des changements histopathologiques dans l’estomac. En particulier, cet article se concentrera sur les méthodes histologiques permet de visualiser la colonisation bactérienne et d’évaluer les changements histopathologiques, incluant la formation de MALT, dans la muqueuse gastrique de souris infectées. Certaines des méthodes décrites ici peuvent être adaptées à l’étude d’autres pathogènes de l’intestin tels que S. Typhimurium ou c. rodentium.

Protocol

1. croissance et préparation de l’inoculum bactérien Décongeler les stocks de glycérol de H. pylori ou felis H.15 de-80 ° C et repiquage sur plaques de gélose au sang (HBA) cheval comprenant : gélose au sang de Base n ° 2 (voir la Table des matières) ; une mis à jour le « Supplément sélectif antibiotique de Skirrow » (consistant à la vancomycine, 10 μg/mL ; polymyxine B, 25 ng/mL triméthoprime 5 µg/mL ; amphotéricine B, 2,5 μ…

Representative Results

Ce protocole décrit une technique de gavage oral pour atteindre intragastrique infection par Helicobacter pylori ou H. felis dans des modèles murins souris (Figure 1). Suite à l’euthanasie, les estomacs sont enlevés, pesés et divisés en 2 moitiés égales comprenant l’antre, les corps et les régions non glandulaire de tissus gastriques (Figure 2). La région non glandulaire est retirée avant d’effectuer les analyses. <p class=…

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation d’un modèle de souris in vivo pour l’infection à Helicobacter . Les étapes critiques de la procédure sont la : 1) préparation des inoculums de Helicobacter contenant des bactéries viables et mobiles ; 2) livraison du nombre approprié de bactéries à la souris par gavage gastrique ; 3) détection de l’infection bactérienne par comptage des colonies et/ou PCR ; et 4) traitement des tissus gastriques pour permettre l’évaluation de l’hist…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier Mme A. De Paoli et Mme Georgie Wray-McCann pour l’assistance technique. Les auteurs reconnaissent l’utilisation des équipements et l’assistance technique de Monash histologie plate-forme, Département d’anatomie et biologie du développement, l’Université Monash. Le laboratoire est pris en charge par le financement de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à RLF (APP1079930, APP1107930). RLF est soutenu par une bourse de recherche Senior du NHMRC (APP1079904). KD et MC reposent tous deux bourses d’études supérieures de Monash. KD est également appuyé par le Centre pour l’immunité innée et Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, tandis que MC a une bourse d’études supérieures internationales de la faculté de médecine, les soins infirmiers et les Sciences de la santé, l’Université Monash. Recherche à l’Institut de recherche médicale de Hudson est pris en charge par programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure.

Materials

Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific  MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega  M8291 Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C
23g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 ml tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
 Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

References

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Cite This Article
D’Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

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