Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques

Résumé

Souris représentent un modèle inestimable en vivo pour étudier les maladies infectieuses et maladies causées par des micro-organismes gastro-intestinaux. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour étudier les changements histopathologiques dans des modèles murins de Helicobacter pyloriet colonisation bactérienne-maladie liée.

Résumé

Helicobacter pylori est un pathogène gastrique qui est présent dans la moitié de la population mondiale et est une cause importante de morbidité et de mortalité chez l’homme. Plusieurs modèles de souris de l’infection à Helicobacter gastrique ont été développés pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires, par lequel les bactéries Helicobacter pylori colonisent l’estomac des hôtes humains et causer la maladie. Ici, nous décrivons les protocoles à : 1) préparer des suspensions bactériennes à l’infection en vivo de souris par gavage gastrique ; 2) déterminer les niveaux de colonisation bactérienne en tissus gastriques de souris, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et compter viable ; et 3) évaluer les changements pathologiques, en histologie. Pour établir Helicobacter infection chez la souris, animaux (SPF) exempts de micro-organismes pathogènes est d’abord inoculées avec des suspensions (contenant ≥ 10⁵ d’unités formant des colonies, UFC) des souches colonisatrices de souris de l' Helicobacter pylori ou autres gastrique Helicobacter spp animaux, tels que Helicobacter felis. À l’heure-points appropriés après l’infection, les estomacs sont excisés et disséqués sagittally en deux fragments de tissus égale, chacun comprenant les régions de l’antre et du corps. Un de ces fragments est ensuite utilisé pour comptage viable ou extraction de l’ADN, tandis que l’autre est soumis à traitement histologique. La colonisation bactérienne et changements histopathologiques dans l’estomac peuvent être évalués régulièrement dans des sections de tissu gastrique tachées de taches (H & E) Warthin-Starry, Giemsa ou hématoxyline et éosine, selon le cas. D’autres analyses immunologiques peuvent également être entreprises par immunohistochimie ou par immunofluorescence sur coupes de tissus gastriques de souris. Les protocoles décrits ci-dessous sont spécialement conçus pour permettre l’évaluation chez les souris des pathologies gastriques ressemblant à ceux d’anthropique Helicobacter pylori maladies, y compris l’inflammation, atrophie de la glande et la formation de follicules lymphoïdes. La préparation de l’inoculum et protocoles de gavage gastrique peuvent également être adaptées à l’étude de la pathogenèse des autres agents entéropathogènes humains qui colonisent les souris, tels que Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.

Introduction

Helicobacter pylori est un pathogène humain, Gram négatif, en forme de spirale gastrique présent dans toutes les populations à travers le monde, avec des taux d’infection dans les pays en développement, estimées à environ 80 %¹. Bien que la plupart Helicobacter pylori-personnes atteintes sont asymptomatiques, certains développent des maladies plus graves, allant de l’ulcération peptique de cancer gastrique². Helicobacter pylori-cancers associés se caractérisent globalement par modifications malignes dans les cellules épithéliales (SCAE) ou par la formation des tissus lymphoïdes extra nodales da....

Protocole

1. croissance et préparation de l’inoculum bactérien

1. Décongeler les stocks de glycérol de H. pylori ou felis H.¹⁵ de-80 ° C et repiquage sur plaques de gélose au sang (HBA) cheval comprenant : gélose au sang de Base n ° 2 (voir la Table des matières) ; une mis à jour le « Supplément sélectif antibiotique de Skirrow » (consistant à la vancomycine, 10 μg/mL ; polymyxine B, 25 ng/mL triméthoprime 5 µg/mL ; amphotéricine B, 2,5 μg/mL) ; et 5 à 10 % (v/v) cheval sang^15,16. Les bactéries développent bien en microaérobiose en 2.5 ou 3.5 L anaérobie ....

Résultats

Ce protocole décrit une technique de gavage oral pour atteindre intragastrique infection par Helicobacter pylori ou H. felis dans des modèles murins souris (Figure 1). Suite à l’euthanasie, les estomacs sont enlevés, pesés et divisés en 2 moitiés égales comprenant l’antre, les corps et les régions non glandulaire de tissus gastriques (Figure 2). La région non glandulaire est retirée avant d’effectuer les analyses.

Co.......

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation d’un modèle de souris in vivo pour l’infection à Helicobacter . Les étapes critiques de la procédure sont la : 1) préparation des inoculums de Helicobacter contenant des bactéries viables et mobiles ; 2) livraison du nombre approprié de bactéries à la souris par gavage gastrique ; 3) détection de l’infection bactérienne par comptage des colonies et/ou PCR ; et 4) traitement des tissus gastriques pour permettre l’évaluation de l’histopathologie infectés estomacs.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs bactériologiques
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Dissoudre dans de l’eau désinoïsée avant la stérilisation
Sang de cheval défibriné de qualité supérieure	Australian Ethical Biologicals	PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth	BD Bioscience	237500	Dissoudre dans de l’eau désinonisée avant la stérilisation
Packs de gaz CampyGen	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
Réactifs histologiques
Formalin, tamponné neutre, 10 %	Sigma Aldrich	HT501128
Alcool absolu, 100 % dénaturé	ChemSupply	AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol)	Merck	100995
Xylène (sans soufre)	ChemSupply	XT003-20L
Mayer’s Haematoxylin	Amber Scientific	MH-1L	Filtre avant utilisation
Éosine, Tache aqueuse	Amber Scientific	EOCA-1L	Filtre avant utilisation
Wright-Giemsa Stain, modifié	Sigma Aldrich	WG80-2.5L	Diluer avant utilisation (20 % Giemsa, 80 % eau déminéralisée)
Histolène	Grale Scientific	11031/5
DPX support de montage	VWR	1.00579.0500
Réactifs de biologie moléculaire
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fischer Scientific	Q32850
Oligonucléotides	Sigma Aldrich		La température de recuit des amorces ureB utilisées dans cette étude est de 61 ° ; Le kit C
GoTaq Flexi DNA polymérase	Promega	M8291	comprend 10 tampons PCR et chlorure de magnésium
dNTPs Bioline		BIO-39028	Diluer à 10 mM dans de l’eau stérile sans nucléase avant utilisation
Agarose de qualité moléculaire	Bioline	BIO-41025
Hydrogénogénocarbonate de sodium	Univar (Ajax Fine Chemicals)	A475-500G
Magnésium Sulfate Heptahydrate	Chem-Supply	MA048-500G
Antibiotiques
Vancomycin	Sigma Aldrich	V2002-1G	Dissoudre dans l’eau déminéralisée
Polymyxine B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Dissoudre dans l’eau désionisée
Trimethoprime (&ge ; 98 % HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	Dissoudre dans 100 % (absolu)
Éthanol Amphotéricine	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	Dissoudre dans l’eau désionisée
Bacitracine à partir de Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	B0125	Dissoudre dans l’eau désionisée
Acide naladixique	Sigma Aldrich	N8878	Dissoudre dans l’eau désionisée
Autres réactifs
Méthoxyflurane (Pentrhox)	Medical Developments International	Sans objet
Cire de paraffine	Paraplast Plus, Leica Biosystems	39601006
Equipement et plastique
Oxoid Anoerobic Jars Thermo	Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes	Interpath Services	200CS01
Centrifugeuse Eppendorf 5810R Recueillir			les granulés bactériens par centrifugation à 2 200 tr/min pendant 10 minutes à 4 ° ; C
23 g aiguille de glissement de précision	BD Bioscience	301805
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Portex tube en polyéthylène à alésage fin	Smiths Medical	800/100/200
Cathéters d’alimentation en plastique	Instech  ; Laboratoires	FTP20-30
Seringues jetables à la tuberculine Luer slip de 1 mL	BD Bioscience	302100
Micropilon Eppendorf pour tubes de 1,2 à 2 mL	Sigma Aldrich	Z317314	Pilon en polypropylène autoclavable utilisé pour l’homogénéisation de l’estomac
Dissociateur GentleMACs	Miltenyi Biotec	130-093-235	Utiliser un système gentleMACS prédéfini Programmes pour les tissus de l’estomac de souris
M Tubes (bouchon orange)	Miltenyi Biotec	30-093-236
Fluorimètre Qubit	Thermo Fischer Scientific	Q33216
Boucle en plastique stérile	LabServ	LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Système d’encastrement	Leica Biosystems	Sans objet
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6	Sakura, Alphen aan den Rijn	4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System	Sakura, Alphen aan den Rijn	4170
Microtome, Leica RM2235	Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus lames de verre	Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific	4951PLUS4