Summary
Microinjection av Nasonia vitripennis embryo er en viktig metode for å generere arvelige genom endringene. Beskrevet her er en detaljert prosedyre for microinjection og transplantasjon av Nasonia vitripennis embryoer, som vil forenkle fremtidige genomet manipulasjon i denne organismen.
Abstract
Juvelen veps Nasonia vitripennis har dukket opp som en effektiv modellsystem for studiet av prosesser inkludert kjønn målbevisstheten, haplo-diploide kjønn målbevisstheten, gift syntese og vert-symbiont vekselsvirkningene, blant andre. En stor begrensning av arbeider med denne organismen er mangel på effektiv protokoller utføre regissert genom endringene. En viktig del av genomet modifisering er redigering reagenser, inkludert CRISPR/Cas9 molekyler, i embryo gjennom microinjection. Mens microinjection er godt etablert i mange modell organismer, denne teknikken er spesielt utfordrende å utføre i N. vitripennis hovedsakelig på grunn av liten embryoet størrelsen, og det faktum at embryonale utvikling skjer utelukkende innenfor en parasitter larvestadiene puppe. Følgende overvinner disse betydelige utfordringer mens demonstrere en strømlinjeformet, og prosedyre for å effektivt fjerne veps embryoer fra parasitter vert pupae, microinjecting dem, og nøye transplanting dem tilbake til verten for videreføring og gjennomføring av utvikling. Denne protokollen vil sterkt forbedre evnen til forskning holdene å utføre avanserte genom endringene i denne organismen.
Introduction
Juvelen veps, N. vitripennis, er en av fire arter i slekten Nasonia som er ectoparasitoids av kjøtt spiser fluer som Sarcophaga bullata1. På grunn av deres raske generasjonene perioder, enkel oppdrett i laboratoriet, og et utvalg av unike og viktige biologiske attributter, har N. vitripennis vært et fokus for utvikling av flere eksperimentelle verktøy som finnes i tradisjonelle modellen organismer . For eksempel inkluderer noen unike biologiske egenskaper en haplo-diploide reproduksjon system2, et forhold til mikrobiologiske og genetiske parasitter3,4og supernumary (B) kromosom5,6 ,7. Sammen gjør disse N. vitripennis en betydelig eksperimentelle system for eksperimenter sikte på Klargjørende de molekylære og mobilnettet aspektene av disse prosessene, i tillegg til andre inkludert gift produksjon8, 9, sex besluttsomhet10,11, og evolusjon og utvikling av aksen mønsteret formasjon12,13,14. Videre genetisk verktøysettet å studere biologi av N. vitripennis har dramatisk økt det siste tiåret eller så, med sekvensering av en høyoppløselig genomet15, flere genuttrykk studerer16,17,18, og muligheten til å avbryte funksjonelt genuttrykk avhengig RNA-interferens (RNAi)19,20, som sammen har forbedret tractability og evner til å utføre omvendt genetikk i denne organismen.
Til tross for de mange viktige vitenskapelige fremskritt og utvidet verktøy i denne organismen, i dagens kunnskap har bare én gruppe gjennomført embryonale microinjections å generere arvelige genom endringene21. Dette er hovedsakelig på grunn av vanskelighetene med å arbeide med embryoene til N. vitripennis som de er ganske skjør og små, blir ~2/3 størrelsen på Drosophila melanogaster embryoer, noe som gjør dem generelt vanskelig å manipulere. I tillegg innskudd N. vitripennis kvinner eggene til pre stukket larvestadiene pupae, som hele embryogenesis, larver, og pupal utvikling skjer. Derfor for vellykket microinjections, før blastoderm scenen, må embryo effektivt samles fra verten pupae, raskt microinjected og umiddelbart transplantert tilbake til sine verter for utvikling. Denne fremgangsmåten krever presisjon og behendighet å unngå skade på microinjected embryoer, eller pupal vertene, gjør teknikken svært utfordrende. Uansett, det er en kort protokoll publisert over et tiår siden som beskriver N. vitripennis fosteret microinjection22. Men denne fremgangsmåten krever at de nylig lagt embryoene være desiccated, bruker selvklebende tape for å forankre egg for microinjection, og inkluderer ikke en visuell demonstrasjon av teknikken. Derfor beskrevet her er en oppdatert og revidert protokollen, inkludert en visuell prosedyre, detaljering en forbedret trinnvise protokoll for N. vitripennis fosteret microinjections som kan følges av alle grunnleggende lab å generere arvelige genom endringer i denne viktig modell insekt.
Protocol
1. N. Vitripennis koloni oppdrett
- Definere flere kolonier (~ 3-5) ved å plassere 200-500 N. vitripennis voksne (med 3:1 forholdet kvinne: mann) i feil dorm bur.
Merk: Alternativ til å bruke feil dorms, veps kan også overføres i flere små reagensglass plugget med bomull med ca 15-20 veps/hetteglass.- Opprettholde veps på 25 ± 1 ° C med 30% relativ fuktighet og en 12:12 lys mørke syklus, mate dem daglig med små dråper på 1:10 (v/v) sukrose/vann.
Merk: Overføring av veps kolonier og samlinger kan også utføres ved romtemperatur uten kontrollert fuktighet; men lavere temperaturer enn 25 ° C vil litt lavere utviklingsmessige timing av embryoene.
- Opprettholde veps på 25 ± 1 ° C med 30% relativ fuktighet og en 12:12 lys mørke syklus, mate dem daglig med små dråper på 1:10 (v/v) sukrose/vann.
- Tillate veps å mate i minst 4 dager før injeksjoner.
- For de første to dagene, la parret kvinner å spise fersk S. bullata pupae, samt små dråper på en 1:10 (v/v) sukrose/vann.
- For følgende to dager, kan du fjerne de larvestadiene pupae å frata de kvinnelige veps av en oviposition området, noe som gjør dem svært gravid.
2. innsamling og justering av N. Vitripennis før blastoderm scenen embryo
- Tillate kvinnelige veps til parasitize (oviposit embryo) til unge verter (S. bullata pupae). For å holde verter frisk, lagre verter i 4 ° C umiddelbart etter å ha dem og Fjern bare når behøvde.
Merk: Unge verter kan bestemmes ved å ha rød farget blodsugende mens eldre verter har mørkere farget blodsugende (figur 1A).- Plassere individuelle frisk S. bullata pupae i et skum stopper med pupae størrelse hull skåret i midten. Vise bare ~ 0,2 cm den fremre delen (foretrukket oviposition område) av verten for maksimal konsentrasjon av parasitization og lettere embryoet samling.
Merk: Den fremre delen avrundet, mens den bakre enden er tykkere og inneholder en "krateret-like" åpning (figur 1B). - Plasser vert pupae (omtrent 5 vert pupae per 100 veps) i denne ordningen i buret og vente cirka 45 min for å tillate veps å parasitize dem (figur 2- ii).
Merk: Det er viktig at embryoene er så små som mulig, ideelt i den første timen av å være oviposited, for å sikre at de er i pre blastoderm scenen. Gamle embryo (> 1,5 t) ikke skal settes inn. - Fjerne parasitter verter ved å hente dem for hånd og mildt penselen/blåse ut alle bosatt veps. Erstatte dem med fersk verter etter hver ~ 15 min fortsette å samle tidlig iscenesatt egg under injeksjoner.
- Plassere individuelle frisk S. bullata pupae i et skum stopper med pupae størrelse hull skåret i midten. Vise bare ~ 0,2 cm den fremre delen (foretrukket oviposition område) av verten for maksimal konsentrasjon av parasitization og lettere embryoet samling.
- Fjern ferske parasitized vertene fra buret for hånd. Under dissecting mikroskop, ved hjelp av pinsett, nøye skrelle bort bakre slutten (0,4 cm) på den utvendige blodsugende (pupal shell) å avsløre N. vitripennis egg (figur 2- iii).
Merk: Må være forsiktig å unngå punktering pupal huden; Hvis dette skjer, vil hemolymph fukt veps embryoer, som vil være svært vanskelig å fjerne microinjection. - Bruk flytende lim til å festes en dekkglassvæske til en ren objektglass å forberede et embryo justering lysbilde (Figur 3).
Merk: En høy ytelse øyeblikkelig lim brukes til å øke bindestyrke og tørking hastighet, men noen lim som kan holde dekkglassvæske fra å flytte rundt på lysbildet er akseptabelt. - Brush-off embryoer fra verten med en våt fin-spissen pensel, sørge for ikke å skade den myke pupal huden på verten.
Merk: en "embryoet hakke," som er i hovedsak en halv av et par Ultrafin tang, kan brukes i stedet for en pensel. - Overføre ~ 20 embryo ett og ett på lysbildet umiddelbart ved siden av dekkglassvæske med en våt pensel. Plasser den fremre delen av fosteret kant dekke lysbildet slik at den bakre enden av embryoene peker i samme retning (figur 2- iv). Dette vil tillate høyere presisjon sprøytebruk i samme posisjon blant alle embryoer.
Merk: Denne forbedret teknikken krever ikke dobbeltsidig selvklebende tape å fikse embryoer på lysbildet som beskrevet tidligere21,22. I tillegg ikke la overflaten tørke ut embryoer, eller dekke eggene med halocarbon olje under injeksjon som beskrevet tidligere for N. vitripennis fosteret microinjection22.
3. nål forberedelse til Microinjections
- Plass en kapillært aluminiumsilikatglass i en nål avtrekker.
Merk: En god nål er avgjørende for vellykket N. vitripennis embryo injeksjoner. Injeksjon nålene bør ha en skarp og fin-spissen for å la enkel penetrasjon gjennom plasmocitara. Kvarts og borosilicate kapillær nåler også kan brukes (Figur 4). - Angi varme til 605, hastighet til 130, forsinkelse til 80, trekke 70 og press til 500 på en nål avtrekker.
Merk: Ekstra p avtrekker innstillinger for trekking kvarts og Borosilicate nåler kan sees i tabell 1. parameterne kan variere for forskjellige svindlere og filamenter. - Aktivere nål puller for å skape riktig nålen. Gjenta etter behov for produksjon av flere nåler.
Merk: Trakk nåler kan lagres ved å plassere dem i en Petriskål inneholder flere parallelle ruller av kommersielle modeler leire. - Skråkant pinne-spissen av litt berøre tuppen av diamant slipende platen rundt 10 s ved 25 ° C (figur 2- iii).
Merk: Injeksjon nålene nytte av innstillingsmuligheter ved å fremme inntreden i embryo med minimal skade samtidig samtidig forbedre flyten av regents gjennom nålen.
4. embryo Microinjection
- Forberede injeksjon blanding bestående av genomet endring reagenser (f.eks transposon + hjelper transposase, eller CRIPSR reagenser, osv.), og oppbevar det på isen.
- Last injeksjon nålen med 2 µL av injeksjon blandingen ved hjelp microloader tips.
Merk: Injeksjon blandingen i protokollen består av enkelt-guide RNA (sgRNA) (s) og rekombinant Cas9 protein blandet i H2O. - Sett av objektglass med foret embryoer på scenen av en satt mikroskop.
- Nøye inn nålen den bakre enden av embryoet med en loddrett vinkel for 25-35 °.
Merk: Hvis for mye injeksjon blanding injiseres i fosteret kan det briste dispelling cytoplasma fra fosteret. I tillegg, feil skråkant eller ødelagte pinner med for stor for åpning kan også forårsake embryoet brudd.
- Prøv re beveling nåler hvis tilstopping oppstår. Cytoplasm i N. vitripennis embryoer er uvanlig tyktflytende og klissete, som fører til hyppige nål tilstopping (1/25 injeksjoner).
Merk: Det er viktig å holde embryoene fuktig i injeksjon perioden ved regelmessig å legge de-ionisert vann med pensel. Hvor mye vann på penselen er nøkkelen til flytte embryo rundt og justere med letthet. For mye vann resulterer i embryo flytende og for lite vann gjør dem vanskelig å flytte rundt. - Injisere ~ 20-40 egg samtidig (bør ta omtrent 10 min), så stopp. Overføre injisert eggene med en våt pensel ved å trykke lett injisert egg og plassere dem i en vert. Fortsett deretter injisere igjen med en frisk nylig lagt gruppe med egg (> 1 h gamle).
Merk: Ideelt denne protokollen er mest effektiv hvis en person er kontinuerlig innsamling og kø egg, mens en annen person er sprøytebruk genomet endring komponentene og transplanting injisert embryo til verten pupae.
5. transplanting injisert G0 N. vitripennis embryoer på Pre-stung vert
- Forsiktig plassere de injiserte G0 embryoene til en tidligere stukket S. bullata pupae (figur 2- vi) med en våt pensel etter microinjection.
Merk: De vert pupae brukes til å samle embryo for microinjection fungerer for dette formålet. Også, til tross for betydelig innsats, det er ingen tilgjengelige kunstig diett som kan bli brukt22.- Plassere opptil 40 injisert embryo en samtidig på en enkelt pre stukket vert å unngå overbefolkning og larver konkurranse.
Merk: Injeksjon vil skade embryoene; uforsiktig transplantasjon av injisert embryoene til de vert pupae kan presse injisert komponenten eller eggeplomme ut, og føre til døden av embryoene.
- Plassere opptil 40 injisert embryo en samtidig på en enkelt pre stukket vert å unngå overbefolkning og larver konkurranse.
- Plasser de vert pupae i en Petriskål med fuktig filter papir og bomull baller og ruge dem ved 25 ° C med omtrent 70% luftfuktighet til injisert embryo klekkes (ca 1-2 dager) (figur 2- vii).
Merk: Viktigere, verter kan stå med en skrelte av blodsugende og N. vitripennis egg vil utvikle normalt så lenge de er ruges i en fuktet kammer (Petriskål med fuktig filter papir og bomull baller) for å hindre uttørking. Rugende ved romtemperatur og fuktighet fra dempet bomull baller er tilstrekkelig i tilfelle fuktighet ikke kan kontrolleres. - Overføre de vert pupae i en ny Petriskål på 70% fuktighet og 25°C etter G0 embryo luke.
- Overvåke vert pupae og injisert G0 Larvene daglig. Hvis de vert pupae har en stygg lukt, overføre injisert Larvene til nye sunn vert pupae.
6. screening for Genova endringer
- Fjern hver N. vitripennis pupae fra verten bruker en fin pensel eller embryoet plukke. Injisert G0 Larvene skal forpuppe seg rundt 8 dager innlegget injeksjon.
- Plasser hver fjernet puppe i en isolert hetteglass koblet med bomull og tillate dem å fremstå som G0 voksne, sikrer at skravert kvinner vil være jomfru som vil hjelpe med nedstrøms genetisk kors.
Merk: Kvinner kan sorteres menn av vingen lengde: kvinner har lengre vinger som strekker seg forbi kroppen profilen når slått på siden. Alle microinjected kvinnelige pupae kan plasseres sammen i plugget ampuller, og det samme gjelder for mannlige pupae. - Skjermen G0 personer, etter eclosion, enten PCR eller visuelt (hvis forstyrre et fenotypiske gen). For eksempel hvis CRISPR brukes til å opprette slettinger i et gitt gen og forstyrret genet gir en synlig fenotype, deretter sortere og holde individer med en mutert versjon av berørte fenotypen (figur 2- viii)21. Hvis imidlertid berørte genet koder for et usynlige fenotype, som en mutant av en viktig genet, utføre en krysset ordningen (kryss G0 mannlige med wild type kvinne eller kryss G0 kvinnelige med wild type mann) for å gjenopprette og skjerm for arvelige mutanter gjennom assaying dødelighet eller sterilitet.
Merk: Ligner på D. melanogaster, N. vitripennis voksne kan bli immobilisert av eksponering for CO2 muliggjør enkel manipulering. Videre vil Hvitkantet gi opphav til 100% haploid mann han funderer, så derfor en mutant unmated kvinner kan gi opphav til mange mutant menn som kan brukes for senere analyse.
Merk: Mutasjoner i viktige gener må holdes av parring overlevende G0 injisert kvinner (antagelig heterozygote for en mutasjon) til vill type menn; i dette tilfellet, skulle halvparten av G1 mannlige avkommet dø på grunn av arv av dødelige mutasjonen, mens halvparten av G1 kvinnelige avkom er bærere av den dødelige. - Høylytt protest G0 voksne og skjermen G1 avkom for transgene innsettinger bruker transgenesis markører hvis målet er transgenesis. For tiden gjenstår transgenesis å bli demonstrert i N. vitripennis.
Representative Results
Denne protokollen gir detaljerte retningslinjer for kolonien oppdrett, pre blastoderm embryoet samling, justering, microinjection og påfølgende transplantasjon etter injeksjon og kan brukes for effektiv genomet engineering i N. vitripennis. Som vist i figur 2, generelle sekvensen av trinn for en vellykket microinjection i N. vitripennis inkluderer: (i) tillater mannlige og kvinnelige voksne å mate (~ 4 dager), (ii) å levere ferske vert fly pupae (S. bullata) plassert i en modifisert skum plugg til parret kvinner og tillate oviposition (~ 45 min), (iii) forsiktig peeling unna parasitter vert pupae cuticle for å avdekke og samle pre blastoderm scenen veps embryo (~ 15 min), (iv) justere samlet embryo (~ 15 min), (v) microinjecting genomet endring komponenter i embryo (~ 15 min), (vi) forsiktig plassere injisert embryo tilbake i pre stukket verter å tillate riktig utvikling (~ 15 min), og (vii) forhindrer dehydrering av injisert embryoet/vert ved å overføre dem i en fuktet kammer med omtrent 70% relativ fuktighet (~ 15 min). Parasitter verter er deretter ruges i ca 14 dager for at fullstendig utvikling av N. vitripennis embryoer. Når injiseres, voksne dukke fra verten (viii), isolere, kompis og skjermen dem enkeltvis etter forventet mutasjoner.
Effektiv nål gjennomtrenging og microinjection i N. vitripennis embryo, er flere typer kapillær glass nåler med filament inkludert kvarts, aluminosilicate og borosilicate typer testet. Det er funnet at kvaliteten på nålen er avgjørende for å unngå brudd/tilstopping under injeksjon, og for å oppnå høy forekomst av både embryoet overlevelse og transformasjon effektivitet. For hver glass, en effektiv protokoll som ble utviklet for å trekke nåler for å få en ønsket sprøyte-like lang tips effektivt for N. vitripennis fosteret microinjection bruker forskjellige brønnene pullers (P-1000 og P-2000) (tabell 1 Figur 4).
For å optimalisere prosedyren, måles overlevelse etter injeksjon av varierende mengder genomet endring komponenter. Genova endringer komponentene som brukes her var blandet guide RNAs og Cas9 protein for CRISPR-mediert genomet redigering, som ble vist tidligere for å fungere godt i N. vitripennis21. Ligner på det som tidligere ble rapportert, her en sgRNA målretting Sinober genet er designet og syntetisert. Målretting og forstyrre dette genet, sett en lett identifiserbare fenotypiske endringer i øyenfarge organisme19,21. En injeksjon blanding kombinerer en rekke konsentrasjoner av sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 og 320 ng/µL) med Cas9 protein (0, 20, 40, 80, 160 og 320 ng/µL) opprettes og injisert i embryo wild type N. vitripennis. Overlevelse av injisert embryo blir funnet for å være doseavhengig (tabell 2)21. Økt konsentrasjon av sgRNA og Cas9 protein føre til redusert overlevelse (tabell 2), kanskje på grunn av additiv off-målet effekter. Høy luftfuktighet (~ 70%) er også funnet for å være viktig for fosteret overlevelse etter transplantasjon til verter, som lav luftfuktighet (~ 10%) resulterte i 100% død til alle injisert embryoer.
Figur 1 . Utarbeidelse av verten pupae (S. bullata) for N. vitripennis fosteret oviposition. (A) Unge og gamle S. bullata pupae. Eldre pupae har en mørkere cuticle mens yngre pupae har et mer rødlig skjær til deres cuticle. Yngre pupae foretrekkes for å maksimere oviposition. Fremre og bakre ender pupae kan også være preget av en "krater som åpning på den bakre enden, mens den fremre delen gjelder et avrundet punkt. (B) vert (S. bullata) puppe forberedelse til N. vitripennis fosteret oviposition. Setter inn de vert pupae i en skum plugg som har hatt en pupae størrelse hull skåret ut. Har den bakre siden av verten pupae ansiktet inside pluggen mens 0,2 cm den fremre delen utsatt for å tillate maksimal konsentrasjon av oviposition i fremre området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Tidslinjen for å lage N. vitripennis mutanter av microinjection. Tidslinje N. vitripennis embryoet samling, CRISPR/Cas9 microinjection og etter injeksjon prosedyrer. N. vitripennis voksne kunne kompis i fravær av et oviposition område i 4 dager (jeg). Etter, en frisk, kjøtt fly vert pupae, S. bullata, plassert inne i et skum stopper som viser bare 0,5 cm av bakre end, ble introdusert til gravid kvinner i 45 min å tillate parasitization (ii). Samtidig var brukerutstyr inkludert microinjection nåler og CRISPR/Cas9-komponenter forberedt (iii). Embryo var samlet fra verten (iv), justert (v) og injisert med CRISPR/Cas9 komponenter (vi). De injiserte embryoene var nøye overført tilbake til en pre stukket vert (vii) og ruges til fullt utviklet (14 dager) (viii). Når voksne kom, ble mutanter vist for fenotyper av forventet CRISPR/Cas9 indusert mutasjoner i genet mål (ix). Hele prosedyren tar vanligvis 19 dager å fullføre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Modifisert microscope skyve til fôr embryoer. (A) A dekkglassvæske. (B) en microscope skyve. (C) en embryoet innretting enheten.En dekkglassvæske kan festes til et mikroskop lysbilde skal brukes til linje embryo for injeksjon. Formålet med dekkglassvæske er å fungere som en kant for enkel manipulering og foring av embryo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Injeksjon nål forberedelse. (A) eksempler på gode og dårlige aluminosilicate glass nåler. (B) tips av en grensesnittfigur riktig skrå og dårlig skrå nål. Aluminosilicate glass kapillær rør ble trukket ved hjelp av en brønnene avtrekker. Produsert pinnespissene ble deretter åpnet forsiktig og raffinert med en beveler. God skrå nålen har en veldig skarp tips og dårlig skrå nålen har en butt tupp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kapillær Glass Type | Sutter nål avtrekker modell | Varme | Filament | Hastighet | Forsinkelse | Trekk | Trykk |
| Kvarts | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| Aluminosilicate | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| Borosilicate | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
Tabell 1. Innstillinger for p avtrekker.
Merk: P avtrekker innstillingen variere fra maskin til maskin så hver lab må optimalisere egne nål avtrekker innstillinger. Denne tabellen er endret fra Li et al. 21
| sgRNA-1 | Cas9 | Totalt embryo | Transplantasjon (10% fuktighet) | Transplantasjon (70% fuktighet) | |||
| Larvene overlevende | Larvene overlevende | Voksen overlevende | |||||
| Totalt (%) | Totalt (%) | ♂ | ♀ | Totalt (%) | |||
| Ingen injeksjon | Ingen injeksjon | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| Vann | Vann | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 ng/µL | 20 ng/µL | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 ng/µL | 40 ng/µL | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 ng/µL | 80 ng/µL | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 ng/µL | 160 ng/µL | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 ng/µL | 320 ng/µL | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
Tabell 2. Injeksjon og transplantasjon survivorship og mutagenese priser basert på injeksjoner av ulike konsentrasjoner av sgRNA og Cas9. Denne tabellen er endret fra Li et al. 21
Discussion
Den siste sekvensering av N. vitripennis genomet har utløst et viktig behov for molekylære verktøy å funksjonelt karakterisere ukjent gener innenfor denne arter23. CRISPR-Cas9 systemet, og mange andre gene redigeringsverktøy, har vist seg for å være verdifulle i gransker genet funksjoner for en rekke organismer24. Vil generere arvelige mutasjoner, krever imidlertid disse verktøyene utfører fosteret microinjections. Derfor vist her er en detaljert visuell teknikk som inkluderer en rekke innovasjoner som tillater effektiv N. vitripennis fosteret microinjections.
Samlet denne detaljerte teknikken tilbyr en rekke viktige nyvinninger, med hensyn til eksisterende metoder23, som gir mulighet for effektiv N. vitripennis fosteret microinjections. For eksempel for å lette rask innsamling av embryo, en oviposition verktøyet (skum disables) opprettes og brukes til å begrense egglegging helt til den bakre enden av verten (figur 1), som sterkt forenkler samling av mange embryoer innen en kort periode. Teknikker for oppdrett veps kolonier med store tall å samle større antall egg er også forbedret og definert. I tillegg for å akselerere embryoet justering, er et embryo innretting enheten som tillater embryo effektivt justert og injisert uten å bruke dobbeltsidig selvklebende tape for å sikre embryoene på plass (Figur 3) utviklet.
Videre er det funnet at ved å holde embryoene fuktig med vann under injeksjon og ikke desiccating embryoene eller dekke dem med olje bedre overlevelse. I tillegg flere kapillær glasstypene er testet og parameterne for å sette de perfekte pinnene for N. vitripennis microinjection (tabell 1, Figur 4) bestemmes. Videre følgende microinjection, fosteret overlevelse priser er betydelig øke på grunn av rugende injisert egg i pre stukket verter plassert i svært høy luftfuktighet (70%) kamre. Disse nyvinningene gir en mer strømlinjeformet og vellykket microinjection prosedyre for N. vitripennis.
Mindre endringer injeksjon apparater samt rearing prosedyrer kan gjøres til denne protokollen, avhengig av brukerens preferanser. Men vil en rekke viktige trinn være avgjørende for å kunne generere mutanter i N. vitripennis. For eksempel arbeider raskt slik at injisert embryo > 1 h gamle, og at injeksjon nåler er skarpe nok til å minimere fosteret vil begge være avgjørende. Mens denne protokollen skal være effektive for å generere mutasjoner i mange (hvis ikke alle) gener, er ettall større begrensningen CRIPSR/Cas9 behovet å målrette en PAM (NGG)-sekvens som vil diktere målet sekvensen.
Avslutningsvis kan denne forbedret teknikken brukes til å generere mange typer Genova endringer, for eksempel mutasjoner, slettinger og muligens også innsettinger bruker CRIPSR/Cas9 teknologier21eller selv transgene innsettinger for å generere transgene N. vitripennis, som bør sterkt akselerere funksjonelle forskning i denne organismen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en sjenerøs University of California, Riverside (UCR) laboratorium oppstart fondet O.S.A, USDA National Institute of Food og landbruk (NIFA) Luke project (1009509) O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
