Summary
Mikroskop Nasonia vitripennis embryon är en viktig metod för att generera ärftliga genomet ändringar. Beskrivs här är ett detaljerat förfarande för Mikroskop och transplantation av Nasonia vitripennis embryon, som kommer att underlätta framtida genomet manipulation i denna organism.
Abstract
Juvel getingen Nasonia vitripennis har vuxit fram som en effektiv modellsystem för att studera processer inklusive sex bestämning, haplo-diploida kön beslutsamhet, venom syntes och värd-symbiont interaktioner, bland andra. En stor begränsning av att arbeta med denna organism är bristen på effektiva protokoll att utföra riktad genomet ändringar. En viktig del av genomet modifiering är leverans av redigering reagenser, inklusive CRISPR/Cas9 molekylar, in embryon genom Mikroskop. Mikroskop är väl etablerad i många modellorganismer, denna teknik är särskilt utmanande att utföra i N. vitripennis främst på grund av sin lilla embryo storlek, och det faktum att embryonal utveckling sker helt inom en parasiterade spyfluga puppa. Följande procedur övervinner dessa betydande utmaningar medan demonstrerar en strömlinjeformad, visuella förfarande för effektivt avlägsnande geting embryon från parasiterade värd puppor, microinjecting dem, och noggrant transplantera dem tillbaka in i mottagande för fortsättning och slutförande av utveckling. Detta protokoll kommer att starkt förbättra forskargrupper förmåga att utföra avancerade genomet ändringar i denna organism.
Introduction
Juvel getingen, N. vitripennis, är en av de fyra arterna inom släktet Nasonia som är ektoparasitoider av kött äter flugor såsom Sarcophaga bullata1. På grund av deras snabba-generationsskifte perioder, användarvänlighet uppfödning i laboratoriet, och en rad unika och viktiga biologiska attribut, har N. vitripennis varit fokus för utvecklingen av flera experimentella verktyg som finns i traditionella modellorganismer . Till exempel inkluderar vissa unika biologiska attribut en haplo-diploida reproduktion system2, en relation med mikrobiell och genetiska parasiter3,4och en vitrobefruktning (B) kromosom5,6 ,7. Sammantaget göra dessa N. vitripennis en viktig experimentella system för experiment som syftar till att klarlägga de molekylära och cellulära aspekterna av dessa processer, förutom andra inklusive venom produktion8, 9, sex beslutsamhet10,11, och evolution och utveckling av axis mönster bildas12,13,14. Dessutom den genetiska toolkit att studera biologi N. vitripennis har ökat dramatiskt det senaste decenniet eller så, med sekvenseringen av en högupplöst genomet15, flera genuttryck studier16,17,18, och förmåga att funktionellt störa genuttryck som förlitar sig på RNA-interferens (RNAi)19,20, som tillsammans har förbättrat tractability och kapacitet att utföra omvänd genetik i denna organism.
Trots många viktiga vetenskapliga framsteg och utökade verktygslådor i denna organism, per nuvarande kunskap har bara en grupp framgångsrikt utfört embryonala microinjections för att generera ärftliga genomet ändringar21. Detta beror främst på svårigheterna med att arbeta med embryon av N. vitripennis eftersom de är ganska sköra och små, är ~2/3 storleken på Drosophila melanogaster embryon, vilket gör dem generellt svåra att manipulera. Dessutom, in N. vitripennis honor sina ägg på pre stucken spyfluga puppor, inom vilken hela embryogenes, larver, och Pupp utveckling uppstår. Därför, för framgångsrik microinjections, före blastoderm scenen, embryon måste effektivt samlas från värd puppor, snabbt microinjected och omedelbart transplanteras tillbaka i deras värdar för utveckling. Dessa steg kräver precision och skicklighet att undvika att skada microinjected embryon eller Pupp värdar, vilket gör tekniken exceptionellt utmanande. Trots detta finns det en kort protokoll publicerade över ett decennium sedan som beskriver N. vitripennis embryo Mikroskop22. Dock denna procedur kräver att nymalen laid embryon vara uttorkad, det använder tejp för att förankra äggen för Mikroskop, och inkluderar inte en visuell demonstration av tekniken. Därför beskrivs här är en uppdaterad och reviderad protokoll, inklusive visuella förfarande detailing ett förbättrat stegvisa protokoll för N. vitripennis embryo microinjections som kan följas av någon grundläggande lab att generera ärftliga genomet ändringar i denna viktiga modell insekt.
Protocol
1. N. Vitripennis koloni uppfödning
- Ställa in flera kolonier (~ 3-5) genom att placera 200-500 N. vitripennis vuxna (med en 3:1 förhållandet mellan hona: hane) i bugg dorm burar.
Obs: Alternativ till att använda bugg sovsalar, getingar kan också spridas i flera, små glas provrör pluggas med bomull med cirka 15-20 getingar/injektionsflaska.- Upprätthålla getingar på 25 ± 1 ° C med 30% relativ luftfuktighet och en 12:12 ljus mörka cykel, utfodra dem dagligen med små droppar av 1:10 (v/v) lösning sackaros/vatten.
Obs: Förökning av wasp kolonier och samlingar kan också utföras vid rumstemperatur utan kontrollerad luftfuktighet; dock lägre temperaturer än 25 ° C sänks något utvecklande timingen av embryon.
- Upprätthålla getingar på 25 ± 1 ° C med 30% relativ luftfuktighet och en 12:12 ljus mörka cykel, utfodra dem dagligen med små droppar av 1:10 (v/v) lösning sackaros/vatten.
- Tillåta getingar att para för minst 4 dagar före injektioner.
- För de första två dagarna, tillåta Parade honor att livnära sig på färska S. bullata puppor, liksom små droppar av en 1:10 (v/v) lösning sackaros/vatten.
- För de följande två dagarna, ta bort de spyfluga puppor för att beröva de kvinnliga Getingarna av ovipositionen plats, vilket gör dem mycket dräktig.
2. insamling och justering av N. Vitripennis före blastoderm scenen embryon
- Tillåta kvinnliga getingar att snylta (oviposit embryon) till unga värdar (S. bullata puppor). För att hålla värdar färska, förvara värdar i 4 ° C omedelbart efter erhålla dem och bara ta bort när det behövs.
Obs: Unga värdar kan bestämmas genom att ha en röd färgade puparium medan äldre värdar har en mörkare färgade puparium (figur 1A).- Placera enskilda färska S. bullata puppor i en skum propp med ett puppor och medelstora hål skär i mitten. Exponera endast ~ 0,2 cm främre ände (Rekommenderad ovipositionen webbplats) värden för maximal koncentration av parasitization och lättare embryosamlingsgruppen.
Obs: Främre slutet avrundas, medan den bakre änden är tjockare och innehåller en 'krater-liknande' öppning (figur 1B). - Placera värd puppor (ungefär 5 värd puppor per 100 getingar) i detta arrangemang in i buren och vänta ungefär 45 min för att tillåta getingar att snylta dem (figur 2- ii).
Obs: Det är mycket viktigt att embryon är så unga som möjligt, helst inom den första timmen av att vara oviposited, för att säkerställa att de är i fasen före blastoderm. Gamla embryon (> 1,5 h) ska inte injiceras. - Ta bort parasiterade värdar genom att hämta dem för hand och försiktigt borsta/blåser bort någon bosatt getingar. Ersätta dem med färska värdar efter varje ~ 15 min att fortsätta samla tidigt iscensatt ägg under injektioner.
- Placera enskilda färska S. bullata puppor i en skum propp med ett puppor och medelstora hål skär i mitten. Exponera endast ~ 0,2 cm främre ände (Rekommenderad ovipositionen webbplats) värden för maximal koncentration av parasitization och lättare embryosamlingsgruppen.
- Ta bort de nybakade parasitized värdarna från buren för hand. I dissekera Mikroskop, använda pincett, dra försiktigt bort bakre ände (0,4 cm) de yttre puparium (Pupp shell) att exponera N. vitripennis äggen (figur 2- iii).
Obs: Försiktighet måste iakttas för att undvika punktering Pupp huden; om detta händer, kommer hemolymph Fukta geting embryon, som kommer att vara mycket svårt att ta bort för Mikroskop. - Använd flytande lim för att limma ett täckglas på en ren glasskiva att förbereda ett embryo justering bild (figur 3).
Obs: En högpresterande instant lim används för att öka bindningsstyrkan och torkning hastighet, men något lim som kan hålla täckglaset från att flytta runt i bilden är acceptabelt. - Borsta-off embryon från värden noggrant med en våt böter-tips pensel, se till att inte skada mjuka Pupp huden av värden.
Obs: ett ”embryo plocka,' som är i huvudsak en halva av ett par av ultrafina pincett, kan användas i stället för en pensel. - Överföra ~ 20 embryon one-by-one in i bilden, direkt anslutning till sidan av täckglaset med en blöt pensel. Rikta den främre änden av embryot mot locket bildens kant så att den bakre änden av embryon är pekade i samma riktning (figur 2- iv). Detta möjliggör högre precision för att injicera i samma position bland alla embryon.
Obs: Denna förbättrade teknik kräver inte dubbelsidig tejp fixar embryon till bild som tidigare beskrivits21,22. Dessutom inte ut embryon eller täcka äggen med halocarbon olja under injektion som tidigare beskrivits för N. vitripennis embryo Mikroskop22.
3. nålen förberedelse för Microinjections
- Placera ett aluminiumsilikat kapillär glas i en nål avdragare.
Obs: En bra nål är avgörande för framgångsrik N. vitripennis embryon injektioner. Injektionsnålar bör ha en skarp och fin-tips till tillåter enkel penetrering genom chorion. Kvarts och Borsilikat kapillär nålar kan också användas (figur 4). - Inställd värme till 605, hastighet 130, dröjsmål till 80, de dra på 70, och trycket till 500 på en nål avdragare.
Obs: Ytterligare nål avdragare inställningar för att dra kvarts och Borsilikat nålar kan ses i tabell 1. parametrarna kan variera för olika avdragare och filament. - Aktivera den nål avdragare för att skapa rätt nålen. Upprepa vid behov för produktion av flera nålar.
Obs: Drog nålar kan lagras genom att placera dem i en petriskål som innehåller flera parallella rullar av kommersiella modeler's lera. - Kantskär nålspetsen genom att lätt röra spetsen på diamond slipande plattan runt 10 s vid 25 ° C (figur 2- iii).
Obs: Injektionsnålar nytta avfasning genom att främja trätt i embryon med minimal skada samtidigt samtidigt förbättra flödet av regents genom nålen.
4. embryot Mikroskop
- Förbered injektionsstället blandningen bestående av genomet modifiering reagens (t.ex. transposon + helper transposase, eller CRIPSR reagens, etc.), och hålla det på is.
- Fyll injektionsnålen med 2 µL av injektion blandning med hjälp av microloader tips.
Obs: Injektion blandningen visat i protokollet består av singel-guide RNA (sgRNA) (s) och rekombinant Cas9 protein blandas i H2O. - Placera glasskiva med fodrad embryona på scenen av ett compound-Mikroskop.
- Försiktigt in nålen i den bakre änden av embryot med en vertikal vinkel av 25-35 °.
Obs: Om för mycket injektion blandning injiceras i embryot det kan brista skingra cytoplasman från embryot. Dessutom, felaktigt avfasade eller brutna nålar med är för stora för en öppning kan också orsaka embryo bristning.
- Prova nytt beveling nålar om igensättning uppstår. Cytoplasman i N. vitripennis embryon är ovanligt trögflytande och klibbig, vilket leder till frekventa nål igensättning (1/25 injektioner).
Obs: Det är viktigt att hålla embryon fuktig under perioden injektion genom att regelbundet lägga avjoniserat vatten med pensel. Mängden vatten på borsten är nyckeln till flytta embryon och justera med lätthet. För mycket vatten resulterar i embryon flytande och för lite vatten gör dem svåra att flytta runt. - Injicera ~ 20-40 ägg på en gång (bör ta ungefär 10 min), sedan stoppa. Överföra de injicerade ägg med en blöt pensel genom att lätt trycka injicerade äggen och placera dem i en värd. Sedan fortsätta injicering igen med en fräsch nyligen lade parti ägg (> 1 h gamla).
Obs: Idealiskt detta protokoll är mest effektiv om en person kontinuerligt samlande och rada upp ägg, medan en annan person är injicering genomet modifiering komponenterna och omplantering injicerade embryon till värd puppor.
5. omplantering Injected G0 N. vitripennis embryon på Pre-stung värd
- Placera försiktigt de injicerade G0 embryona till en tidigare stucken S. bullata puppor (figur 2- vi) med en blöt pensel efter Mikroskop.
Obs: The host puppor brukade samla in embryon för Mikroskop fungerar för detta ändamål. Också, trots betydande ansträngning finns det för närvarande inga tillgängliga artificiell diet som kan vara används22.- Placera upp till 40 injicerade embryon en i taget på en pre stucken värd att undvika överfulla och larver konkurrens.
Obs: Injektion kommer skada embryon; slarvig transplantation av injicerade embryon till the host puppor kan pressa den injicerade komponenten eller äggulan ut och leda till döden av embryon.
- Placera upp till 40 injicerade embryon en i taget på en pre stucken värd att undvika överfulla och larver konkurrens.
- Placera de värd puppor i en petriskål med fuktig filterpapper och bomullstussar och inkubera dem vid 25 ° C med ungefär 70% luftfuktighet tills injicerade embryon kläcks (ungefär 1-2 dagar) (figur 2- vii).
Obs: Viktigt, värdar kan lämnas med en skalade utanför puparium och den N. vitripennis ägg kommer utvecklas normalt så länge de inkuberas i en fuktig kammare (petriskål med fuktig filterpapper och bomullstussar) för att förhindra uttorkning. Inkubation i rumstemperatur och luftfuktighet från fuktad bomull bollar räcker om fukt inte kan kontrolleras. - Över de värd puppor till en ny petriskål på 70% luftfuktighet och 25°C efter G0 embryon hatch.
- Övervaka värd puppor och injicerade G0 larver dagligen. Om the host puppor har en illaluktande doft, överföra de injicerade larvaena till nya friska värd puppor.
6. screening för genomet ändringar
- Ta bort varje N. vitripennis puppor från värden med hjälp av en fin pensel eller embryo plocka. Injicerade G0 larver ska förpuppas runt 8 dagar efter injektionen.
- Placera varje borttagna pupa i en isolerad glasflaska som pluggas med bomull och tillåta dem att framstå som G0 vuxna, så att de kläckta honorna oskuld som hjälper med nedströms genetiska korsar.
Obs: Honor kan sorteras från hanar wing längd: honorna har längre vingar som sträcker sig förbi kroppen profilen när den slås på sidan. Alla microinjected kvinnliga puppor kan placeras tillsammans i en nätansluten injektionsflaska, och detsamma gäller manliga puppor. - Skärmen G0 individer, efter eclosion, med antingen PCR eller visuellt (om störa en fenotypisk gen). Till exempel om CRISPR används för att skapa borttagningar i en viss gen och störd genen ger en synlig fenotyp, sedan sortera och hålla individer med en muterad version av den drabbade fenotypen (figur 2- viii)21. Om emellertid den drabbade genen kodar för en icke-synliga fenotyp, såsom en mutant av en viktig gen, utföra ett passage system (cross G0 hane med vild typ hona eller cross G0 hona med vild typ hane) för att återställa och skärm för ärftlig mutanter genom testmetoder dödlighet eller sterilitet.
Obs: Liknar D. melanogaster, N. vitripennis vuxna kan vara orörlig med exponering för CO2 möjliggör enkel manipulation. Dessutom kommer att individer honor ge upphov till 100% haploida manliga kullar, så därför en mutant individer kvinna kan ge upphov till stort antal mutant hanar som kan användas för efterföljande analys.
Obs: Mutationer i gener som nödvändigt måste behållas av parning överlevande G0 injiceras honor (förmodligen heterozygota för en mutation) till vildtyp män; i detta fall, bör hälften av G1 manliga avkomman dör på grund av arv av dödlig mutation, medan hälften av G1 kvinnliga avkomman blir bärare av den dödliga. - Ropen G0 vuxna och skärmen G1 avkomma för transgenens infogningar med genmodifiering markörer om målet är genmodifiering. För närvarande återstår genmodifiering påvisas i N. vitripennis.
Representative Results
Detta protokoll innehåller detaljerade riktlinjer för kolonin uppfödning, före blastoderm embryosamlingen, justering, Mikroskop och efterföljande transplantation efter injektion och kan användas för effektiv genomet engineering i N. vitripennis. I figur 2visas den allmänna sekvensen av steg för en framgångsrik Mikroskop till N. vitripennis omfatta: (i) tillåter manliga och kvinnliga vuxna att para (~ 4 dagar), (ii) tillhandahålla färska värd flyga puppor (S. bullata) placeras i en modifierade skum plug Parade tikar och möjliggör ovipositionen (~ 45 min), (iii) noggrant peeling bort parasiterade värd puppor nagelbanden för att exponera och samla före blastoderm scenen geting embryon (~ 15 min), (iv) justera samlas in embryon (~ 15 min), (v) microinjecting genomet modifiering komponenter i embryon (~ 15 min), (vi) noggrant placera injicerade embryon tillbaka i pre stucken värdar att möjliggöra lämplig utveckling (~ 15 min), och (vii) att förhindra uttorkning av den injicerade embryo/värden genom att överföra dem i en fuktig kammare med ungefär 70% relativ luftfuktighet (~ 15 min). Parasiterade värdar inkuberas därefter i ungefär 14 dagar för att tillåta fullständig utveckling av N. vitripennis embryon. När injiceras, vuxna ur värden (viii), isolera, mate, och skärmen dem individuellt för förekomst av förväntade mutationer.
För effektiv nål penetration och Mikroskop till N. vitripennis embryon, är flera typer av kapillär glas nålar med glödtråd inklusive kvarts, aluminiumsilikat och Borsilikat typer testade. Det visar sig att kvaliteten på nålen är kritiskt för att undvika brott/igensättning under injektion, och för att uppnå höga andelen båda embryo överlevnad och förvandling effektivitet. För varje typ av glas, en effektiv protokollet har utvecklats för att dra nålar för att få en önskad hypodermic-liknande lång spets effektivt för N. vitripennis embryo Mikroskop använder olika mikropipett avdragare (P-1000 och P-2000) (tabell 1 Figur 4).
För att optimera förfarandet, mäts överlevnaden efter injektion av varierande mängder av genomet modifiering komponenter. Genomet modifiering komponenterna används här var blandade guide RNAs och Cas9 protein för CRISPR-medierad genomet redigering, som konstaterats tidigare fungerar bra i N. vitripennis21. Liknar det som tidigare var rapporterade, här en sgRNA inriktning cinnabar genen är utformad och syntetiseras. Genom att rikta och störa denna gen, är en lätt identifierbara fenotypisk förändring ses i ögonfärgen av organismen19,21. En injektion blandning kombinerar en mängd olika koncentrationer av sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 och 320 ng/µL) med Cas9 protein (0, 20, 40, 80, 160 och 320 ng/µL) skapas och injiceras i embryon av vildtyp N. vitripennis. Överlevnaden av injicerade embryon befinns vara dosberoende (tabell 2)21. En ökad koncentration av sgRNA och Cas9 protein leder till minskad överlevnad (tabell 2), kanske på grund av additiva off-target effekter. Hög luftfuktighet (~ 70%) är också visat sig vara viktigt för embryo överlevnad efter transplantation till värdar, som låg luftfuktighet (~ 10%) resulterade i 100% död alla injicerade embryon.
Figur 1 . Beredning av värd puppor (S. bullata) för N. vitripennis embryo ovipositionen. (A) Unga och gamla S. bullata puppor. Äldre puppor har en mörkare nagelband medan yngre puppor har en mer rödaktig nyans på sina nagelband. Yngre puppor föredras för att maximera ovipositionen. Bakre och främre ändarna av puppor kan också urskiljas genom en ”krater-liknande öppning på den bakre delen, medan den främre änden kommer till en rundad spets. (B) värden (S. bullata) pupa förberedelse för N. vitripennis embryo ovipositionen. Infoga de värd puppor i en skum plugg som har haft en puppor storlek hål ristat. Har den bakre sidan av värd puppor ansiktet släpper kontakten medan 0.2 cm från den främre änden utsätts för maximal koncentration av ovipositionen in i främre området. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Tidslinje för att skapa N. vitripennis mutanter av Mikroskop. Tidslinje av N. vitripennis embryosamlingen, CRISPR/Cas9 Mikroskop och efter injektion förfaranden. Subst. vitripennis vuxna tilläts mate i avsaknad av en ovipositionen plats i 4 dagar (jag). En färsk, kött flyga värd puppor, S. bullata, placeras inuti en skum propp om bara exponera 0,5 cm av bakre utgången, efter, och introducerades till dräktiga honorna för 45 min för parasitization (ii). Samtidigt utarbetades injektion material inklusive Mikroskop nålar och CRISPR/Cas9 komponenter (iii). Embryon som samlats in från mottagande (iv), linje (v) och injiceras med CRISPR/Cas9 komponenter (vi). De injicerade embryona var noggrant överförs tillbaka till en pre stucken värd (vii) och inkuberas tills fullt utvecklad (14 dagar) (viii). När vuxna framkom, som mutanter screenades för fenotyper av förväntade CRISPR/Cas9 inducerade mutationer i målgenen (ix). Hela proceduren tar i allmänhet 19 dagar att slutföra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Modifierade objektglas för foder embryon. (A) A täckglas. (B) en objektglas. (C) en embryo justering enhet.Ett täckglas kan limmas på ett objektglas som ska användas till linje embryon för injektion. Syftet med täckglaset är att agera som en kant för att lätt manipulation och beklädnad av embryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Injektion nål förberedelse. (A) exempel på bra och dåliga aluminiumsilikat glas nålar. (B) tips av en unbeveled, korrekt avfasade och dåligt avfasade nål. Aluminiumsilikat glas kapillärrör drogs med hjälp av en mikropipett avdragare. De producerade nål tips sedan öppnades försiktigt och förfinas med hjälp av en fasmaskin. Bra fasade kanylen har en mycket vass spets och dåligt avfasade nålen har en trubbig spets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kapillär glas typ | Sutter nål avdragare modell | Värme | Glödtråden | Hastighet | Fördröjning | Dra | Tryck |
| Quartz | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| Aluminiumsilikat | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| Borosilikatglas | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
Tabell 1. Inställningar för nål avdragare.
Obs: Nål avdragare inställningen varierar från maskin till maskin så varje lab kommer att behöva optimera sina egna inställningar för avdragare av nålen. Den här tabellen har ändrats från Li et al. 21
| sgRNA-1 | Cas9 | Totala embryon | Transplantation (10% fukt) | Transplantation (70% luftfuktighet) | |||
| Larverna överlevande | Larverna överlevande | Vuxna överlevande | |||||
| Totalt (%) | Totalt (%) | ♂ | ♀ | Totalt (%) | |||
| Ingen injektion | Ingen injektion | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| Vatten | Vatten | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 ng/µL | 20 ng/µL | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 ng/µL | 40 ng/µL | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 ng/µL | 80 ng/µL | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 ng/µL | 160 ng/µL | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 ng/µL | 320 ng/µL | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
Tabell 2. Injektion och transplantation survivorship och mutagenes priser utifrån injektioner av olika koncentrationer av sgRNA och Cas9. Denna tabell har ändrats från Li et al. 21
Discussion
Den senaste sekvenseringen av N. vitripennis genomet har utlöst ett viktigt behov för molekylära verktyg att funktionellt karakterisera okända gener inom denna art23. CRISPR-Cas9 systemet, och många andra gen redigeringsverktyg, har visat sig vara värdefull i undersöker gen funktioner för ett antal organismer24. Dessa verktyg kräver dock generera ärftliga mutationer, utför embryo microinjections. Därför visade här är en detaljerad visuell teknik som inkluderar ett antal innovationer som möjliggör effektiv N. vitripennis embryo microinjections.
Sammantaget denna detaljerade teknik erbjuder ett antal viktiga innovationer, med avseende på befintliga metoder23, som möjliggör effektiv N. vitripennis embryo microinjections. Till exempel för att underlätta snabb insamling av embryon, ett ovipositionen verktyg (skum propp) skapas och används för att begränsa ägg om helt till bakre ände värden (figur 1), vilket avsevärt underlättar insamling av talrikt embryon inom en kort tidsperiod. Tekniker för uppfödning av wasp kolonier med ett stort antal att samla större antal ägg är också förbättrat och definieras. För att påskynda embryo justering, utvecklas dessutom ett embryo justering enhet som tillåter för embryon effektivt anpassas och injiceras utan att behöva använda dubbelhäftande tejp för att säkra embryona på plats (figur 3).
Det finns dessutom att genom att hålla embryon fuktiga med vatten under injektion och inte desiccating embryon eller täcka dem med olja förbättrat överlevnaden. Dessutom flera kapillär glas typer är testade och parametrar för att konstruera de perfekta nålarna för N. vitripennis Mikroskop (tabell 1, figur 4) bestäms. Dessutom följande Mikroskop, embryo överlevnad skattesatserna kunna öka betydligt på grund av ruvning injicerade ägg i förväg stucken värdar placeras i hög luftfuktighet (70%) kammare. Dessa innovationer tillåter en mer strömlinjeformad och framgångsrika Mikroskop förfarande för N. vitripennis.
Mindre ändringar i form av injektion apparater och uppfödning förfaranden kan göras till detta protokoll, beroende på användarens preferenser. Dock kommer att ett antal kritiska steg vara avgörande för att framgångsrikt skapa mutanter i N. vitripennis. Exempelvis arbeta snabbt så att injicerade embryon är > 1 h gammal, och att säkerställa att injektionsnålar är tillräckligt skarp för att minimera skador på embryot kommer båda vara väsentliga. Medan detta protokoll ska vara effektiv för att skapa mutationer i gener som många (om inte alla), är en stor begränsning CRIPSR/Cas9 kravet att rikta en PAM (NGG) sekvens som kommer att diktera sekvensen mål.
Avslutningsvis kan denna förbättrade teknik användas för att generera många typer av genomet modifieringar, såsom mutationer, borttagningar, och eventuellt även infogningar för att generera transgena i CRIPSR/Cas9 teknik21eller ens transgenens infogningar Subst. vitripennis, som bör kraftigt påskynda funktionell forskning i denna organism.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en generös University of California, Riverside (UCR) laboratorium startfonden O.S.A, en USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk (NIFA) Hatch-projektet (1009509) till O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
