Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

doi: 10.3791/56999 Published: January 2, 2018

Summary

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Abstract

עלבונות pathophysiological רבים יכולים לגרום נזק קרום התא, כאשר משולב עם פגמים מולדים תיקון קרום התא או תקינות, עלול לגרום למחלות. להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס סביב תיקון קרום התא, לפיכך, הוא מטרה חשובה להתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן המחלות הקשורות dynamics קרום התא לא מתפקדת. מחקרים רבים בתוך חוץ גופית ו ויוו להבנת קרום התא חתימת בהקשרים שונים של המחלה לנצל אבלציה לייזר שני הפוטונים כסטנדרט לקביעת תוצאות תפקודי בעקבות ניסיוני טיפולים. ב הזה assay, קרום התא הם נתון ופצעו עם לייזר שני הפוטונים, הגורמת קרום התא ועד לשתל הפלורסנט לחדור לתא. ניתן לנטר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך התא ואז לכמת את היכולת של התא לאטום מחדש את עצמו. ישנן מספר שיטות חלופיות להערכת קרום התא בתגובה לפציעה, כמו גם וריאציה נהדרת הלייזר שני הפוטונים ופצעו את הגישה עצמה, לכן, מודל אחד, מאוחד של התא ופצעו ישרת לטובה כדי להקטין וריאציה בין אלה מתודולוגיות. במאמר זה, אנו מכינים לייזר שני הפוטונים פשוטה ופצעו את פרוטוקול להערכת קרום התא תיקון במבחנה בשני בריא וב פיברובלסט החולה dysferlinopathy תאים transfected עם או בלי פלסמיד dysferlin באורך מלא.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קרום התא של התאים האיקריוטים מורכב שכבה כפולה של פוספוליפידים משובץ-חלבון אשר מגדיר את סביבת חוץ-על/תאי "אינטרה" של התא היא חיונית לשמירה על הישרדות הומאוסטזיס ותא הסלולר. קרום התא פציעות הנובעות עלבונות כימי או מכני הם דבר שבשגרה בסוגים בתרבית של תאים שונים, לרבות שלד, שריר הלב, הקיבה והריאות תאים1,2,3,4. בנוסף פציעות הסוגר יומי תפקיד פיזיולוגי, קרום התא יכול גם להיות נפגע על ידי עלבונות סביבתיים רעלים חיידקי, פגיעה reperfusion איסכמי5. כישלון כדי לחתום מחדש יתבקע קרום התא מוביל תזרים ללא פיקוח של חוץ-תאית Ca2 +- יחד עם רכיבים אחרים חוץ-תאית רעיל - לתוך התא, מפעילה cascades האות במורד הזרם, אשר עלולה לגרום במהירות בתא מוות1,4,5,6.

עד כה, היו מספר דגמים המוצע לתיקון ממברנה בתאים. אולי ניתן להפעיל מנגנוני תיקון שונים תלוי בגודל אופי העלתה קרום. כך למשל, הוא הציע כי קרום התא עשויים לנצל זרימת לרוחב או חלבון סתימת לתקן שיבושים קטנים (< 1 ננומטר). המודל פיוז'ן לרוחב מציעה כי קרום יתבקע במהירות לתיקון דרך גיוס לרוחב של המכילות dysferlin ממברנה7, ואילו החלבון סתימת דגם מרמז כי נקבים קטנים הם לתיקון דרך הצטברויות של חלבון (בעיקר annexins) 8. לעומת זאת, לעורר נגעים ממברנה גדולות Ca2 +-שלפוחית התלויים, בתיווך dysferlin פיוז'ן ועל היווצרות טלאי תיקון. במודל טלאי תיקון, Ca2 + הזרימה המהירה לתוך התא מפעילה הגיוס של חלבונים מרובים (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ו EDH חלבונים) אשר ליצור מתחם או "תיקון", יחד עם שילוב של שלפוחית תאיים או lysosomes באתר של הממברנה גורם נזק4,9,10,11,12. חשוב לשים לב כי מודלים אלה אינם בהכרח סותרים, אולי לעבוד ביחד כדי להקל על תיקון קרום. כשל לחתום כראוי נזק קרום התא משויך מספר מצבי מחלה, כולל ניוון שרירים (dysferlinopathy - כולל מיושי מיופתיה, חגורת הגפיים-ניוון שרירים מסוג IIB, מיופתיה דיסטלי עם תחילת הטיביאלי הקדמי) 13, קרדיומיופתיה14ו- Chediak-היגאשי תסמונת (CHS)15.

נתון זה שלמות קרום התא המתאים וחתימה מחזות תפקיד כה חשוב על בריאות ומחלה, הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המולקולריים הבסיסית של תיקון קרום התא יהיה מועיל בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות. לכן,, יש להחזיק טכניקות ניסיוני המתאים כדי לפקח על קינטיקה, להעריך את היכולת של תיקון קרום התא. מספר במבחנה שיטות לסימולציה תיקון קרום עוצבו. אסטרטגיה אחת כרוכה פגיעה מכנית, אשר ניתן להקל באמצעות תא גירוד עם תער/להב פיפטה/כירורגי או על ידי גלגול חרוזי זכוכית על תאי ה-16. עם זאת, סוג זה של פציעה מכני יוצר נגעים גדולים ויוצרת רמה גבוהה של וריאציה תא לפציעה, הן בתוך והן בין תרבויות.

שיטה נוספת של יצירת פצעים ממברנה היא אבלציה לייזר על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. בניגוד לייזר מסורתיות מיקרוסקופיה קונפוקלית מעסיקה עירור פוטון יחיד, הלייזר שני הפוטונים משתמשת בו זמנית שני פוטונים ארוך באורך הגל, אנרגיה נמוכה כדי להקל את עירור של אלקטרון בעל אנרגיה גבוהה17. תהליך ליניארי זה יוצר עירור אך ורק בתוך המטוס מוקד וגם לא לאורך כל הנתיב אור17 (איור 1). זה מופחת עירור העוצמה מסייעת למזער את נזקי כאשר הדמיה תאים חיים18,19. חוקרים ולכן מסוגלים לייצר נגעים מדויקת קרום התא וחתימה צג ממברנה בזמן אמת באמצעות צבעי פלורסנט ו התבוננות שינויים בעוצמת פלורסצנטיות כמו קרום התא יתבקע ולאחר מכן החתימות מחדש.

בגישה זו נעשה שימוש שוב ושוב ללמוד ממברנה ופצעו בתוך חוץ גופית ו ויוו וסוגי בתא מספר20,21. לדוגמה, ממברנה לתקן פגמים fibroblasts, myotubes נגזר dysferlinopathy חולים היו העריך באמצעות טכניקה זו,22,23. כמו כן, סיבי שריר בודד מבודד עכברים שימשו כדי לפקח על תיקון תיקון היווצרות13,24,25. התנועה של חלבונים מתויגות fluorescently יכול גם להיות שנצפו במהלך תיקון קרום סיבי השריר יחידה9. יתר על כן, התהליך של תיקון sarcolemmal בעקבות שני הפוטונים לייזר ופצעו בדג זברה העוברים נראים גם בזמן אמת אין ויוו26.

במאמר זה, אנו מכינים מתודולוגיה להערכת הדינמיקה תיקון קרום התא של fibroblasts באמצעות לייזר שני הפוטונים ופצעו, למרות מתודולוגיה זו שניתן להחיל על סוגי תאים שונים לצורך לכימות קרום פלזמה חתימת יכולת במבחנה. בשיטה זו, תאים מודגרת עם FM4-64, צבע lipophilic, התא אטום אשר במהירות שזוהר כמו זה נקשר באופן שלילי טעונה פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה עם כניסתו לתא דרך ממברנה הנגע (איור 2& 3)-כימות של זריחה צבע סמוכים הנגע ממברנה מאפשר ניטור הזמן שלוקח את קרום התא לחתום מחדש את עצמו. לצורך המחשה השירות של שיטה זו, אנו משתמשים dysferlinopathy החולה fibroblasts transfected עם פלסמידים מצומדת-GFP באורך מלא dysferlin (DYSF) כדי להעריך את החילוץ של תיקון קרום התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאי פיברובלסט האנושי השתמשו במחקר זה נעשה שימוש באישור ועדת האתיקה האנושית של הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים באוניברסיטת אלברטה.

1. תרביות תאים תאים עם פלסמיד DYSF באורך מלא

  1. התרבות תאי פיברובלסט בבקבוקון T225 המכיל 40 מ של צמיחה מדיה - בינוני נשר שונה (DMEM) של 36 מ"ל Dulbecco, 4 מיליליטר סרום שור עוברית (FBS) ו 20 µL של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) - ב חממה2 CO ב 37 º C.
    הערה: התאים צריכים להיות בתרבית עד כ 70-80% confluency, אסור להפוך confluent לחלוטין.
  2. כדי להתכונן זריעת תאי, לשטוף את התאים 40 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) פעמיים ולאחר מכן הוסף 5 מ של 0.05% טריפסין כדי לנתק את התאים. להחזיר התאים 37 ° C CO2 מגשים, דגירה התאים במשך 5 דקות.
    1. כאשר התאים מנותק לחלוטין, להוסיף 40 מ"ל של צמיחה מדיה כדי לעצור את התגובה טריפסין.
    2. לספור את התאים באמצעות hemocytometer או תא אחר ספירת ההתקנים.
  3. זרע 2 מ"ל של תאים-עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל 35 מ מ מצופה קולגן זכוכית-התחתון מנות. דגירה בין לילה בתאים חממה2 CO ב 37 º C.
    הערה: תאים צריך להיות כ- 50-60% confluent למחרת.
  4. מסיר את המדיה צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של הפרעות-סרום התקשורת (מדיה צמיחה בלי FBS).
  5. Transfect התאים עם פלסמיד באורך מלא dysferlin באמצעות lipotransfection.
    1. להכין µL 150 של הפרעות-סרום מדיה צינור 1.5 mL (שפופרת אחת עבור כל מנה להיות transfected).
    2. להוסיף 3 µL של תרביות תאים ריאגנט כל שפופרת 1.5 mL המכיל הפרעות-סרום מדיה. דגירה זה לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. בשפופרת mL 1.5 נפרדת, מוסיפים µL 175 של מדיה הפרעות-סרום µg 3.5 של פלסמיד ה-DNA.
      הערה: להכפיל את הכמויות הנ עבור כל מנה נוספת להיות transfected.
    4. לשלב 150 µL של המדיה המכילה פלסמיד DNA לתוך צינור עם 150 µL הפרעות-סרום ומדיה ריאגנט תרביות תאים. תקופת דגירה זה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. פזר באופן שווה 300 µL של התקשורת עם ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים על-פני המנה. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב חממה2 CO ב 37 º C.
  6. החלף את המדיה צמיחה טריים המדיה המכילה סרום, תקופת דגירה זה של h 24 נוספים ב חממה2 CO ב 37 º C.

2. הכנה של תאים assay ופצעו שני הפוטונים

  1. להסיר כלי התקשורת על-ידי pipetting, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode טריים המכילים µL 1 של 2.5 מ מ FM צבע 4-64.
    הערה: הריכוז הסופי של FM 4-64 צבען הוא 2.5 מיקרומטר.
  2. אם הערכה של תיקון קרום בסביבה מדולדל סידן רצוי, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל 1 מ מ EGTA.
    הערה: כפי PBS יגרמו התאים לנתק לאורך זמן, וזמינותו wounding צריך להשלים מהר ככל האפשר.

3. שני הפוטונים לייזר assay ופצעו

  1. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה והתוכנה התוכנית המשויכת אליו, ליצור מטרה מיקרומטר 0.2 µm x 2 והנח אותו בקצה של קרום התא כך קו המטרה חופף הוא בניצב לכיוון קרום התא (איור 2).
  2. משתמשים בלייזר הנה 543-nm לרגש FM לצבוע אות ולקבוע טווח זיהוי עבור 600-760 ננומטר. השתמש לייזר ארגון 488 ננומטר לרגש GFP אות (איור 4) ולקבוע טווח זיהוי עבור 500-550 ננומטר.
    1. צור סידרה זמן 5 דקות של סריקות תמונה רציפה, הדמיה תאים כל 5 s.
    2. ליצירת פצע ממברנה, אקונומיקה התאים באמצעות לייזר שני הפוטונים מוגדר כ- 820-nm, באמצעות 15% לייזר כוח עם 10 חזרות, אקונומיקה תאים 25 s לאחר תחילת סדרת הזמן.
  3. כדי לכמת FM 4-64 לצבוע פלורסצנטיות, להשתמש בתוכנה לצייר אזור מיקרומטר מיקרומטר x 6 6 עניין (ROI) ואת למקם אותו סמוך אל המיקום wounding, בתוך התא (איור 3).
    הערה: להימנע דגימה תחומי פיקסל oversaturation באמצעות הפונקציה "טווח מחוון" בתוכנה - ביישום זה, הפיקסלים האדומים מייצגים פיקסלים רווי. לייצא ערכים פלורסצנטיות גולמיים לתוך גיליון אלקטרוני אלקטרונית של לשם ניתוח סטטיסטי.
  4. לחשב פלורסצנטיות יחסי ערכים עבור כל נקודת זמן על-ידי חיסור הערך רקע (זריחה אומר ערך של timepoints לפני ממברנה ופצעו) ואת חלוקת העלייה נטו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הערך ב- t = 0 (איור 5, 6) .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fibroblasts אנושי בריא fibroblasts החולה dysferlinopathy שאינם מטופלים, החולה fibroblasts transfected עם פלסמיד המכיל רצף באורך מלא dysferlin היו נתונים שני הפוטונים לייזר ופצעו להעריך ממברנה חתימת יכולת בזמן אמת. פיברובלסטים אנושי בריא מוצגים רמות נמוכות של הפעלת פלורסצנטיות FM 4-64 בעקבות לייזר ופצעו. שאינם מטופלים fibroblasts החולה הציגו רמה גבוהה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי בעקבות פגיעה (איור 5& 6 ). התאים המטופלים היו transfected עם פלסמיד dysferlin באורך מלא הראה FM יחסית מופחתת עוצמת קרינה פלואורסצנטית 4-64 לעומת שאינם מטופלים פקדים החולה והיו דומה עם פלורסצנטיות הערכים שנמדדו הפקד בריא (איור 5& 6).

Figure 1
איור 1 . פוטון אחד לעומת מיקרוסקופ שני הפוטונים. במערכת מיקרוסקופים פוטונים זה מסורתי, פוטון יחיד אנרגיה גבוהה (UV או הספקטרום) משמש כדי לרגש fluorophore (א). במערכת שני הפוטונים, שני פוטונים נמוכה יותר של אנרגיה (ליד אינפרא-אדום) משמשים כדי לרגש של fluorophore (B). מתואר בתוך הצילינדרים היא האות פלורסצנטיות שנוצר לאורך המטוס מוקד, הממחיש כיצד מערכת לייזר שני הפוטונים יכול להתמקד עירור אור בתוך אזור מסוים (B) תכלול אור מ- out-of-להתמקד מטוסים (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . הצבת מטרה-קרום התא. שימוש בתוכנה, מטרה מיקרומטר 0.2 µm x 2 נמשך, להציב חופפים, בניצב קרום התא. החץ מצביע על המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . קרינה פלואורסצנטית אות FM צבע כפי שהוא מחלחל התא דרך ממברנה קרע. כמו קרום התא יתבקע, צבען FM 4-64 lipophilic מחלחל התא, שזוהר כאשר הוא נקשר-אניון פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה. שימוש בתוכנה, אזור בעל עניין (ROI) יכול להיות מצוירות (לבנה), קרינה פלואורסצנטית ערכים בתוך תיבת יכול לשמש כדי לחשב פלורסצנטיות יחסית שינויים בתוך התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . קרינה פלואורסצנטית האיתות מצומדת-GFP פלסמיד DYSF באורך מלא- בעקבות פלסמיד תרביות תאים, פיברובלסטים החולה מבטאים את החלבון DYSF באורך מלא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . כימות של קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן. קרינה פלואורסצנטית ערכים המחושבים על-ידי תוכנת מחשב מ בתוך רועי יכול לשמש כדי לקבוע פלורסצנטיות היחסית משתנה לאורך זמן עבור כל קבוצת הטיפול. החץ מצביע על הזמן של אבלציה לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . שינוי פלורסצנטיות יחסית לאורך זמן. קרינה פלואורסצנטית היחסי (RF) ערכים עבור כל נקודת זמן מחושבים באמצעות החסרת הערך פלורסצנטיות רקע (מחושבת הממוצע של ערכי פלורסצנטיות timepoints לפני ממברנה ופצעו) מתוך הערכים נתון קרינה פלואורסצנטית (אות עוצמה - רקע = ΔF) ולהגדיל את חלוקת הרשת (ΔF) על-ידי קרינה פלואורסצנטית הערך t = 0 (F0). לכן, RF = ΔF/F0. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שני הפוטונים לייזר פציעתו של קרום התא הוא טכניקה מדויק ופסיביות להערכת את הדינמיקה של קרום חתימה מחדש בתוך חוץ גופית. במאמר זה, אנו המתואר פרוטוקול לקביעת קרום התא חתימת יכולת בתאי החולה dysferlinopathy באמצעות הלייזר שני הפוטונים ופצעו וזמינותו. התוצאות שלנו להראות כי dysferlinopathy החולה תאים פגומים ב קרום התא חתימה, אשר עולה בקנה אחד עם הממצאים על ידי חוקרים אחרים, אשר בהמשך מדגיש את הדמיון הבולט בקרום התא חתימת דינמיקה בין שרירים ו תא שריר שאינו סוגי3,11,15,22. גם הבחנו כי החולה תאים transfected עם פלסמיד המכיל את רצף באורך מלא dysferlin חולצו מן שלהם ממברנה פגומים חתימת פנוטיפ, הממחיש את פלסמיד dysferlin באורך מלא יכול להציל פנוטיפ בשריר שאינם סוגי תאים באותה מידה כמו שריר27.

יחד, התוצאות שלנו לחזק את היתכנות והאמינות של שני הפוטונים ממברנה wounding וזמינותו כתא תקן הזהב למדידת יכולת חתימה מחדש של הממברנה בתוך חוץ גופית. עם זאת, עלות וזמינות הקשורים עם מיקרוסקופ שני הפוטונים יכול להיות פוטנציאל גורם לכמה קבוצות מחקר המבקשים לנצל את הקרום שני הפוטונים ופצעו assay מגביל. יתר על כן, ההתקנה שלנו מנצל מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה, אשר ולסדרם לעבודה בתוך vitro אך עשוי להיות פחות מתאים ויוו הדמיה.

חשוב לציין כי הדיוק של יישור שני הפוטונים לייזר הוא קריטי להצלחה של הטכניקה. מניסיוננו, פתרון בעיות של יישור הלייזר היה הנושא הנפוץ ביותר נתקל. בעיות אחרות אשר יכול להשפיע על היכולת לצבור להיטים מוצלחים במהלך לייזר ופצעו כוללים את מכונות להשמה והפצה של המנה זכוכית-התחתון על הבמה, כמו גם את הכיוון של התאים בפתרון.

וזמינותו חל הנוכחיים והעתידיים מחקרים חוקרת מצבי מחלה שבה שלמות קרום התא או חתימה הוא מוטרד, והיעילות של טיפולים, כגון ריפוי גנטי וטיפול antisense מבוססי oligonucleotide, אשר ירוויחו מהצורך assay יעיל עבור אפיון ממברנה dynamics אפשרויות טיפוליות הרומן שניתן יהיה חקר28,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלברטה הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים, חברים של גארט קאמינג מחקר יו ר הקרן, קרן כיסא של מחקרים המדע של HM Toupin נוירולוגיות, ניוון שרירים קנדה, קנדה קרן עבור חדשנות (CFI), אלברטה מתקדם החינוך והטכנולוגיה (הארכה), קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR), המסע של ג'סי - הקרן ג'ין, טיפול בתאי, הנשים, הילדים הבריאות מכון המחקר (WCHRI), ומחדש אלברטה פתרונות בריאות (AIHS ).

ברצוננו להודות ד ר סטיבן לאוול לספק לנו פלסמיד dysferlin באורך מלא. אנחנו רוצים גם תודה ד ר קצויה מיאקי עצות טכניות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312, (3), L371-L391 (2017).
  2. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
  3. McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96, (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
  4. McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (6), 499-505 (2005).
  5. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95, (4), 1205-1240 (2015).
  6. Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261, (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
  7. McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28, (8), 3660-3670 (2014).
  8. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, (Unit 4), 11-24 (2013).
  9. Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213, (6), 705-718 (2016).
  10. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140, (5), 1097-1109 (1992).
  11. Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137, (1), 93-104 (1997).
  12. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, (2), 157-169 (2001).
  13. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, (6936), 168-172 (2003).
  14. Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117, (7), 1805-1813 (2007).
  15. Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (48), 16795-16800 (2004).
  16. Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
  17. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  18. Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3, (3), 231-237 (2000).
  19. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, (5), 1808-1817 (2003).
  20. McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4592-4597 (2003).
  21. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
  22. Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
  23. Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
  24. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, (1), 56-64 (2009).
  25. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (16), 6004-6009 (2014).
  26. Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22, (3), 515-529 (2012).
  27. Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287, (33), 27629-27636 (2012).
  28. Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Springer Japan. 87-102 (2016).
  29. Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17, (9-10), 875-882 (2011).
Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).More

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter