Summary
Terapi değerlendirilmesi amaçlayan deneysel tedavi rejimleri hücre hatları, baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için geçerli standart test etmemizi sağlayan bir küresel tabanlı, üç boyutlu vitro modeli evrimi tarif duyarlılık ve direnci Primer hücre insan örnekler üzerinden üzerinde içinde belgili tanımlık gelecek.
Abstract
Güncel tedavi seçenekleri için gelişmiş ve tekrarlayan baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) radyasyon ve kemoterapi-radyasyon yaklaşımlar ile veya ameliyat olmadan alın. Platin tabanlı kemoterapi rejimleri şu anda altın standart etkinliği açısından temsil ve durumlarda, yeni kemoterapi rejimleri, büyük çoğunluğu verilir Yani immünoterapi gelişmekte olan. Ancak, yanıt oranları ve terapi direnç mekanizmaları ya kemoterapi rejimi için tahmin ve yeterince anlaşılır olmaya devam etmek zordur. Kemoterapi ve radyasyon direnç mekanizmaları geniş varyasyonlar Tarih olarak bilinir. Bu çalışmada kişiselleştirilmiş tümör için gelecek bir araç olarak bireysel hastalardan HNSCC hücre kültürünü'nın yanıt çeşitli tedavi rejimleri ve umut verici bir biçimde Primer hücre değerlendirmek için bir standart, yüksek üretilen iş vitro tahlil gelişimi anlatılmaktadır terapi. Tahlil kalite kontrollü standart algoritma Tersiyer bakım merkezimizde HNSCC hastalar için varlık bütünleşmek için tasarlanmıştır; Ancak, bu gelecekteki çalışmaların konusu olacaktır. Teknik fizibilite tümör biyopsi gerçek hastalarda Primer hücre için umut verici görünüyor. Örnek sonra laboratuvar aktarılır. Biyopsi mekanik olarak Enzimatik sindirim ardından ayrılır. Hücreleri sonra üç boyutlu, küresel şeklinde hücre ikinci büyük şirketler tekrarlanabilir, standart ve spontan oluşumu teşvik Ultra düşük yapışma hücre kültür şişeleri kültürlü. Pulcuklarının sonra kemoterapi-radyasyon protokolleri ve gerektiğinde immünoterapi protokolleri maruz hazırız. Son hücre canlılığı ve küresel boyutu terapi duyarlılık göstergeleri vardır ve bu nedenle gelecekte hastaların muhtemel tedavi yanıtı değerlendirmek için dikkate çekilmiş olabilir. Bu model baş ve boyun kanseri için kişiselleştirilmiş terapi doğru değerli, maliyet-etkin bir araç olabilir.
Introduction
Baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) Mukozal insan Papilloma Virus (HPV) enfeksiyon ilişkili Patogenez, çoğu durumda aşırı nikotin ve alkol neden yanında yükselen insidansı ile dünya çapında altıncı en yaygın kanser olduğunu tüketimi 1,2. Daha küçük tümörler ve önceden invazif aşamalarında genellikle de genellikle servikal lenf nodu diseksiyonu ile kombine cerrahi eksizyon ile tedavi edilebilir olmakla birlikte gelişmiş aşama ve tekrarlayan HNSCC için tedavi ile agresif tümör işgali nedeniyle zorlu kalır metastatik yaymak ve direnç radyasyon ve kemoterapi protokolleri3,4,5,6,7,8. Son yıllarda yapılan çalışmalarda hücresel fenotip yüksek bir değişkenliği ve dolaşan alt karakterizasyonu önermek ve Dissemine tümör hücreleri sadece9,10başladı. Önceki inancı sağlam, tek tip tümör kitle vardı geçmişte son çalışmalar ışığında gözden geçirilmesi yıl11,12,13,14. Tümör karakterizasyonu ve anahtar mutasyonlar tanımlaması için geçerli yaklaşımlar tedavi direnci ile ilişkili ancak maliyet-yoğun yaklaşım kalır gibi görünüyor birkaç genler teşhis edebilir. Ayrıca, genotip bilgisine mutlaka fenotip ve onun tedaviye yanıt güvenilir bir tahmin izin vermez.
Gelişmiş aşama ve tekrarlayan hastalığı için genel ve hastalıksız sağkalım iyileştirilmesinde birkaç gelişmeler oldu. Nikotin - yanı sıra için virüs ilişkili Karsinomu, mevcut tedavi seçenekleri yanı sıra ameliyat agresif radyasyona ve platin tabanlı kemoterapi rejimleri alın. HPV-negatif ve pozitif Karsinomu arasında farklı yanıt oranları için etkileri olmuştur; Ancak, bu değil henüz bir değişiklik için genel olarak tedavi yönergeleri kurşun. Radyasyon ve kemoterapi direnci tüm tümör aşamalarında yaygın bir olgudur ve platin tabanlı kemoterapi de hedefe yönelik tedavi (Anti-EGFR; gelince için var epidermal büyüme faktörü reseptörü) ve son denetim noktası inhibisyon15gelişmekte olan. Etkisiz radyasyon ve kemoterapi disfaji, Mukozit, ağız kuruluğu ve diğerleri arasında böbrek veya kalp fonksiyonu azalma riski açısından önemli hasta morbidite yüksek bir maliyetle geliyor. Terapi yanıt önceden tahmin genel tedavi kavramı karar bireysel her hasta için gereksiz tedavi kavramları, yan etkileri ve maliyeti engelleyen çok önemli hedefi olacak gibi görünüyor.
Bireysel hastanın tedavi duyarlılık geçerli standart kemoterapi-düzenli ve kalite kontrollü Onkolojik tedavi algoritması teknik ayakta noktadan içine entegre olabilir radyasyon karşı test etmek için bir model kurmak istedi. Onlar kötü onların değişkenlik olmadan gerçek insan tümör hücreleri temsil ve protokol kurulması sırasında bildiğimiz gibi heterojen çeşitli hücre hatlarında yapıldı gibi ağır değiştirilmiş ve yaşlı hücre hatları, kullanmadan modeli kullanmak için uzak hedef oldu. Yalnızca ticari olarak kullanılabilir hücre satırlarından bağımsız olmak, biz son zamanlarda başarıyla "PiCa" adı verilen bir ara cep çizgi insan tümör numuneler birincil HNSCC hücrelerden onun yüzey ve sınırlı geçişleri korunmuş hücresel imleçli kaynaklandığı 16. bu pika hücre kültürünü görülmesi gerektiğini yolda modeli geliştirilmesi için bir hazırlık olarak sonra sonra denemeler ile taze insan kanser hücrelerinin tümör biyopsi aşağıdaki için. Bu hücreleri üç boyutlu hücre kültürleri tepki farklı ve daha fazla vivo içindegösterilmiştir-yönetim--dan o monolayers17,18,19',20 büyüyen kanser ilaçların ister ,21, özellikle göçmen korunması nedeniyle ve alt farklılaşma özellikleri belirli hücre alt kümeleri22,23,24. Burada, biz küresel tabanlı, üç boyutlu model ara hücre satırlarından Protokolü tanımlamak ve birincil insan Skuamöz Hücre Karsinomu hücre ve yolları nasıl böyle bir model baş ve boyun cerrah ve Onkoloji ( kanser tedavisinde entegre Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makale, yani insan tümör numuneler, kullanımı gösterilen tüm çalışmaları altında ve onayı önceden kararlarının üzerinden Üniversitesi Tıp Mainz/University of Münih Tıp Merkezi Etik Komitesi ile korunmaktadır. Hasta Onam bilimsel tedavi sırasında elde edildi aşırı biyolojik malzeme kullanımı kabul ulusal yasal esaslarına göre verdik. Araştırma insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak yapıldı.
1. baş ve Heck Skuamöz Hücre Karsinomu tümör biyopsi alarak
- Genel (propofol ve/veya sevoflurane, kas rahatlatıcı Ajan) veya yerel infiltrasyon (%2 ultracaine, adrenalin) gerçekleştirmek / yüzey (xylocaine) anestezi ameliyat odası veya kulak burun boğaz muayenesi sandalyede. Üst sindirim ve solunum yolu oral kavite/yutak/gırtlak/diğer bölgelerinde tümör kitle ile standart aletleri Çalışma görselleştirmek ve gerekirse, mikroskop altında.
- Taze tümör biyopsi kanserli lezyon çevre ile künt veya kesme aletleri al. Bu alanda bol nekroz nedeniyle lezyon ortasına kaçının. Alınan doku izotonik Sodyum Klorür solüsyonu ile steril bir kap koymak.
- Gerektiğinde, örneğinsonra biyopsi, hemostazın gerçekleştirmek., vasoconstrictive maddelerin kullanımı yanı sıra iki kutuplu veya monopolar koagülasyon aygıtıyla.
- Hücre kültürü deneyleri doğrudan için bitişik laboratuvar yolu için kullanılmaya yönelik tümör biyopsi getir. Her zamanki gibi kanseri ekarte etmek için patolog diğer tümör biyopsi gönderin.
- Bir laboratuvar teknisyeni örnek doğrudan işlemek hazır olduğundan emin olun.
2. tümör numune işleme
- Tümör numune uygun ve steril bir yüzeye yerleştirin ve iyice steril tek kullanımlık neşterle mümkün olduğu kadar küçük parçalar halinde kesin.
Dikkat: bulaşıcı ve kan yoluyla bulaşan hastalıklar durumunu iyi belgelenmiş ve teknisyen ilgi gibi kurumların standart protokolleri önlemek için iğne sopa ya da potansiyel olarak biohazard hasta malzeme ile kesme yaralanma olduğundan emin olun ve protokolleri olası yaralanma sonra izleyin. - Birincil doku yeterli mekanik ayrılıktan sonra doku Collagenase içeren bir flakon koymak ı / II ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 70 µm Şahin hücre süzgeç aracılığıyla elek ve süspansiyon Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın.
-
Başarılı ayırma ve sonraki yıkama sonra alt-confluency 37 ° c sıcaklık ve % 5 CO2 büyümeye bir T75 hücre kültür şişeler (75 cm2) içine 1-2 × 106 hücreleri içeren süspansiyon yerleştirin Bu adım 10 gün sürebilir.
- Özel keratinosit kültür ortamı aşağıdaki görevlerden oluşan kullanımı: Dulbecco 125 mL 250 mL tamamlanmaktadır keratinosit orta (keratinosit SF orta, 500 mL sığır hipofiz 15 mg oluşan çıkarılan orta Kartallar orta (DMEM), modifiye (BPE), 2.5 mL penisilin/streptomisin, 150 ng rekombinant insan epitelyal büyüme faktörü (EGF), 300 mm CaCl2516 µL, hisse senedi karışımı önceden hazırlıklı olmak için F12 besin karışımı, BPE (0.75 mL), 75 ng rekombinant insan EGF 10 mg 125 mL ayıklamak) (2 µL) , 200 mm L-Alanyl-L-Glutamin-dipeptid (tablo malzemelerin) 3.75 mL.
3. tohum hücreleri Ultra düşük yapışma hücre kültür kalıplara
- Tümör hücre büyümesini mikroskop altında onaylayın. Kültür hücreleri saymak (birincil veya hücre kültür) ve 5000 birincil tümör hücreleri veya ara hücre kültürünü hücrelerinin 1.000-2.000 tohum / 200-300 µL medya (Adım 3.2.) içbükey, ultra düşük yapışma plakalı içine diğer hücre kültürünü yuvarlak dipleri (96-de).
-
% %1 5 CO2 37 ° C'de ve eşit parçaya DMEM ve hava yolu epitel hücre orta (BEGM), % 10 fetal sığır serum, % 1 penisilin/streptomisin, % 1 sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, hücre kültür L-glutamin (Adım 2.3.). Hücre hatları kullanılıyorsa, medya DMEM temelinde yeterli olur.
- Medya değişikliklerini her geçen gün gerçekleştirmek. Pipet ile küresel medya değişiklikleri sırasında Aspire edin değil dikkat. 3.3 descibed (yaklaşık 7-10 gün) ulaştı olarak pulcuklarının büyüme düzeyine kadar kültür.
- Spontan küresel oluşumu mikroskop altında üç boyutlu, küresel şeklinde hücre ikinci büyük şirketler için bakarak onaylayın. Düzensiz ve/veya daha fazla araştırma yapılması üzerinden birden çok küresel oluşumu ile kuyuları hariç.
Not: Pulcuklarının de, işleme daha fazla ve medya değişiklikler aşağıda açıklandığı gibi kolaylaştıran çıplak gözle görünür olması gerekir.
4. açığa pulcuklarının Multimodal standart veya deneysel tümör tedavisi için
- İstenilen tedavi rejimi seçin. Tedavi edilmemiş pulcuklarının veya yalnızca kısmi tedavi rejimleri, e.galma pulcuklarının tedavilere karşılaştırmalar izin yeterince büyük kontrol grubu tasarım. radyasyon yalnız. Denetim grupları boyutu üzerinde deney grubu tasarım bağlıdır ve evrensel olarak tanımlanamaz.
- Döviz medya ortamına katkı maddeleri ile chemotherapeutics ve/veya istenen konsantrasyonlarda monoklonal antikorlar ile anlam medya. Sisplatin 2.5/5/10 µM veya 5-fluoruracil (5FU) 30 µM, konsantrasyonları ekleyin.
Not: daha fazla deneylerde kuruyoruz yüksek işlem hacmi deneyler veya grupları boyutları/çok sayıda büyük bir grup için bir otomatik bir pipetting robot kullanabilirsiniz. - Alternatif olarak, hücre kültür plakaları pulcuklarının 2 Gy uygun radyasyon tesisi kullanarak, ile yayılır.
Dikkat: kurumun protokolleri zararlı radyasyona maruz kalma çalışanların önlenmesi ile ilgili saygı. Sadece radyasyon koruma esaslarına göre belirlenmiş ve eğitimli teknisyenler çalışmak. İsterseniz, küçük 4.2 açıklandığı gibi chemotherapeutics öneki. daha sonra. - Yukarıda açıklanan kültür koşullarında (37 ° C, adım 3.2) 24 h için hücreleri kuluçkaya.
- Kuluçka sonra hücre kültürü en az 6 gün için ortam değişiklikleri ile her geçen gün devam.
5. küresel boyutu ve tahlil okuma için hücresel proliferasyonu ölçüde değerlendirilmesi
- Küresel büyüklüğü açısından alan dijital fotoğraf belgeleri 6 gün sonra (10 gün, gün 16) grafik yazılımı (parametre 1) ile ölçmek.
- Vasıl 520 x g plaka 2.5 dk aralıklarla sonra süpernatant kaldırın. 1 x PBS ve plaka tekrar açıklandığı gibi süpernatant (PBS) kaldırarak takip santrifüj yeterli miktarda hücrelerle yıkayın.
- Enzimatik hücre dekolmanı çözeltinin 100 µL çözülmeye pulcuklarının izin vermek için her şişe ekleyin. 8 dk. 37 ° C'de plaka kuluçkaya
- Mikroskop altında küresel başarılı eriterek için kontrol edin. DMEM 100 µL ekleyin. Plaka 520 x g 2.5 dk. Kaldır de süpernatant santrifüj kapasitesi ve DMEM 100 µL hücrelerde askıya alma.
- Piyasada bulunan Renkölçer yayılması tahlil örnek WST-8 tahlil üreticinin yönergeleri25göre her şişe üzerinde gerçekleştirin. İçinde enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) okuyucu (parametre 2) tahlil okumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz tekrarlanarak pulcuklarının tek hücre süspansiyonlar, gelen ilk daha sonra birincil insan kanser hücrelerinden Hagemann ve ark içinde açıklandığı gibi taze tümör biyopsi türetilen özel pika hücre hat dahil olmak üzere farklı hücre satırları oluşturmak başardık . 26. küresel oluşturulmasında; iki kurulan yöntemleri değerlendirildi sözde asılı olan iki damla (HD) yöntemi ve ikinci daha etkili ve güvenli bir varlık Ultra düşük adezyon (ULA) yöntemi. Yöntemin avantajları, HD daha hızlı küresel büyüme, dahil olmak üzere, karşılaştırıldığında ULA plaka işleme, bunun sonucunda ağır titreşimleri ve tekdüzelik ( açısından daha tekrarlanabilir küresel büyüme ile pulcuklarının kaybı ile daha az sorunları vurgulamak başardık Şekil 2). Şişe başına birden fazla pulcuklarının oluşumunu HD yönteminde daha yaygındı. Küresel Morfoloji daha farklı bir karakterizasyonu için kontrol ettik. Şekil 3 Ki67, PiCa hücrelerden bir küresel, bir nükleer silahların yayılmasına karşı marker için boyama bir İmmünokimya gösterir. Literatürde açıklandığı gibi pulcuklarının Proliferasyona bir dış tabaka ile çekirdek Proliferasyona, hızla çoğalmak-in katı HNSCC insanlarda farklı bölgelerinde taklit bir daha az oluşur. İçinde vitro in vivoolarak, bu sözde bir degrade besin ve oksijen hücre kültür bir düşüş çevre tümör merkezine neden medya tarafından sağlanan kaynaklanır.
Biz sonra tahlil kemoterapötik ilaçlar veya iyonizan radyasyon, kuluçka sonra küresel boyutta varyasyonları tespit etmek mümkün olduğunu göstermek burada HNSCC için iki ortak standart tedavi rejimleri temsil eden çalıştı. Ön arıtma rutin içine tahlil muhtemelen Tümleştirme önce testin duyarlılığı doğrulama bir ön koşul olacaktır. İki parametre testin bitiş noktaları mevcut idi: küresel boyutu (alanı; parametre 1 adım 5.1.) ve nükleer silahların yayılmasına karşı (bakınız parametre 2 adım 5.4.), hücre canlılığı ve büyüme potansiyeli bir surrogate marker terapisinden sonra olmak. Ortak kemoterapi ve radyasyon kemoterapi protokolleri ile tedavi çalışmaların sonuçları şekil 4' te gösterilmiştir. Pozlama ve sisplatin veya 5FU ile pulcuklarının kuluçka liderliğindeki bir tedavi edilmemiş kontrol grubuna göre zaman içinde büyüme hızı önemli bir azalma (p< 0.001). Radyasyon 2Gy ile anlamlı bir şekilde büyüme hızı azaltmak mümkün (p< 0,01). Hayatta kalma tahlil (WST-8) ile radyasyon yalnız karşılaştırıldığında sisplatin kemoterapi-radyasyon ek, önemli bir değerini tespit etmek mümkün (p = 0.017), bir fark küresel boyutta değerlendirmede daha önce tespit edilmemiş. Bu hassasiyeti için küçük değişiklikler terapi yanıt artırmada bir bütün olarak tahlil için önemini vurgular.
Şekil 1: gelecekteki kişiselleştirilmiş terapi giderken bir model kavramı. Mukozal HPV enfeksiyonu ya da arka plan ve/veya tütün ve alkol kötüye kullanımı Tersiyer bakım merkezimize mevcut şüpheli baş ve boyun kanser tanısı için öyküsü olan hastalar. Şüpheli Mukozal alanlar veya makroskopik tümör kitleleri biyopsi anestezi altında tanı güvenliğini sağlamak için alınır. Ayrıca, laboratuvarda üç boyutlu küresel şeklindeki hücre kültürleri oluşturmak için tümör biyopsi alın. İlköğretim-hücre tabanlı pulcuklarının yeterli büyüme, biz onları için bireysel terapi yanıtlarını sınamak için geçerli standart veya deneysel tedavi rejimleri için maruz. Genetik veya moleküler değişimleri daha fazla analizleri tedavi sonuçları analiz sonra eklenebilir. Tedavi sonuçları vitro terapi kavramları hasta için planlama işleminin dikkate çizilebilir. Bu rakam Hagemann, J. ve ark. yayımlanmaktadır 26, yazarlar ve günlük tarafından verilen izinle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: tüm hücre satırlarını güvenilir pulcuklarının yaratacaktır; boyut ve zaman okuma farklılıkları şekil 1'e according. Ön deneyler, Primer hücre tekrarlanabilir pulcuklarının HD'de ULA tabak (sol alt) formu değil. Daha fazla çalışmaları küresel büyüme özellikleri gönderen Primer hücre değerlendirmek için üstlenilen üzeresiniz. Sağdaki hücre sayısı bir küresel oluşturmak üzere şişede koymak hücreleri ilk sayısıdır. Bu rakam Hagemann, J. ve ark. yayımlanmaktadır 26, yazarlar ve günlük tarafından verilen izinle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Ki67 İmmünokimya küresel dilim (pika) boyama. Çevre Kültür Merkezi hücreleri kez nekrotik çekirdek göster: solid Mukozal tümör besin dağıtım taklit eden, daha çok daha yüksek nükleer silahların yayılmasına karşı oranları gösterir. Bu rakam Hagemann, J. ve ark. yayımlanmaktadır 26, yazarlar ve günlük tarafından verilen izinle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: terapi çalışmaları. (A) pika hücreleri pulcuklarının oluşturmak için ekili (n = 12 grup başına) ULA tabak içinde. Kontrolü, 5 mikron, sisplatin veya 5FU 30 µM. boyutlarında pulcuklarının günde 6, 10 ve 16 Standart protokolleri göre belirlendi gibi hücreleri ya da PBS ile protokolüne göre teşvik. Sisplatin ve 5FU tedavi liderliğindeki için boyutu önemli bir azalma (p-değerleri (A) (B) aynı deneysel tasarım bölümünde sol altta verilmiştir (n = 12), ama 2Gy ek radyasyon ile. (C) arsa min max gösterir. Göre p-2Gy ile önceki radyasyon değerleri, (C) verilen liderliğindeki için küresel boyutu kontrol grubunda radyoterapi taklit ve radyasyon duyarlılığı pika hücre gösteren önemli bir azalma. Radyasyon sisplatin tedavisi ile birlikte değil yol açar daha da önemli bir azalma küresel boyutunu (p> 0.05). Arsa min maxgösterir. (C) hesaplanan p-2 yönlü ANOVA analizi üzerinde pulcuklarının planimetric (alan) analizi için alternatif olarak 16 gün gerçekleştirilen deneyler A ve B. (D) WST8 tahlil değerleri. WST8 analizleri kemoterapi-radyasyon karşılaştırıldığında sisplatin yalnız (2Gy radyasyon ve sisplatin) sonra canlı hücreler önemli bir azalma tespit etmek mümkün (p = 0.017), dolayısıyla planimetric analizi ve WST8 birleştirerek avantajı gösterilen Renkölçer tahlil tahlil okuma zaman. Arsa min max gösterir. Bu rakam Hagemann, J. ve ark. yayımlanmaktadır 26, yazarlar ve günlük tarafından verilen izinle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz tekrarlanabilir pulcuklarının hücre süspansiyonlar, her iki hücre hatları için ve ön deneylerde, birincil insan tümör hücreleri oluşturmak için bir protokol kurmayı başardık. İlk iki önceden açıklanan yöntemleri değerlendirildi ve ULA-yöntem, ultra düşük yapışma yüzeyler ile Kültür plakalar, üniforma üç boyutlu pulcuklarının nesil için daha güvenli ve daha güvenilir biri olarak kullanıldığı bir yöntem tanımlanır. Tahlil okuma (boyutu/alan ve hücre canlılığı) için iki ayrı yöntem birleştirerek, multimodal bu tahlil gruplar arasındaki küçük farkları belirlemek için yeterince duyarlı olduğunu. Bu daha sonra entegrasyon Tersiyer bakım merkezimizde klinik yolu testin Teknik fizibilite kanıtı doğru ilk adımdır. Gelecekte, (i) ortak ilk veya ikinci/üçüncü satırı tedavi protokolleri (kemoterapi-reaktifler, radyasyon) bireysel tümör duyarlılık değerlendirmek için kullanılabilir ve deneysel tedavi protokolleri, (ii) daha fazla taze örnekler üzerinden tümör hücreleri karakterize ve tedavi yanıt moleküler yüzey veya sitoplazmik desenleri aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Farklı tümör yerelleştirmeler, örneğinİlköğretim Okulu ve lenf nodu metastazı, gelen örnekler üzerinden pulcuklarının hayal.
Protokolü ve yöntemi kurulması, biz birkaç olmak iyi kurulmuş yıllardır farklı bilinen hücre hatları kullanılır. Hücre hatları sadece yaşın şüphe onların bağlantısı ile karşılaştırılabilir sözde çeşitli özellikleri ve hallmark moleküler işaretleyiciler kaybettiği geçerli gerçek insan tümör hücreleri için yükseltir. Vitro deney sonuçlarından insan veya in vivo çalışmalarda27' yeniden oluşturulması zor. Bu nedenle son zamanlarda insan birincil tümör hücreleri de karakterize16yaşında tesisimizde üretilen bir hücre satırı üzerinde duruldu. Bu hücre kültürünü pika ile tedavi daha büyük bir ölçekte deney başardık ve geçerli terapi beklentileri doğruladı. Bu pika hücreler gerçek insan tümör davranış çok sayıda pasajlar uygulanan diğer, daha yaşlı ve pasajlı hücre çizgiler iyi yansıtmak teorisini destekler. Uzun vadeli vitro koşulları nedeniyle fizyolojik olmayan seçim tabi olabilir hücreleri kemoterapi-radyasyon duyarlılığı önyargı. Son deneylerinde Primer hücre açısından güvenilir küresel oluşumu ile fizibilite doğruladı; Ancak, daha fazla ve daha büyük deneyler klinik rutin içine tahlil uygulamak mümkün edilmeden önce gerçekleştirilmesi gerekir.
Pulcuklarının ve üç boyutlu hücre kültürü genel olarak tepki farklı geleneksel 2D-kültür kemoterapötik ilaçlar veya radyasyon 28maruz zaman karşılaştırıldığında kabul edilir. Dış yüzey oksijen, besin teslim çekirdek için bir degrade pulcuklarının mimarisini yol açar ve son çalışmalar da ilaç dağıtım üç boyutlu hücre kümesinin farklı bölümlerine tek tip29olmadığını göstermiştir. Ayrıca, küresel kültür hücrelerde ilaç direnci hayvan ile ilişkili olan gen ifade desenleri modelleri 30belirli korumak gibi görünüyor. Biz de sözde Radyasyon direnci, çok sayıda hastalarda baş ve boyun kanseri bağlantılı bir özelliği hücre-hücre etkileşim ve farklı microenvironments oksijen kaynağı ve metabolik aktivite için önde gelen bir sonucu olduğunu göstermektedir. Bu olay nedeniyle bir artış içinde vivo işlevselliği pulcuklarının taklit. Sonuç olarak, Primer hücre kullanımı ve pulcuklarının nesil bize vivo içinde tümör büyüme bireysel terapi yanıt çalışmak için maliyet-etkin bir tahlil ile birlikte olası özellikleri kadar korumak izin verebilir.
Kesinlikle yaklaşım için sınırlamalar vardır. Bugüne kadar ne kadar farklı bireysel hastaları hücrelerinden Tümörü tedaviye maruz kalma tahlil gerçekleştirir ve daha sonra tedavi sonucu ile ilişki açısından tahlil ne kadar akıllı olduğunu bilinmemektedir. Aşırı çalışmalar sadece klinik seyir vs performans vitro karşılaştırmak gereklidir. Diğerleri arasında Yani bu belirsizlik için iki faktör katkıda: tümör heterojenite ve stromal ve bağışıklık hücreleri ile ortak kültür eksikliği. Tümör heterojenite tamamen anlaşılır bir olgudur ve ilköğretim farklı alt siteler arasında hem de birincil ve metastatik Yerelleştirme12arasında bulunmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda beri orada üçüncü bir yerde çok farklı site ve özel tümör hücreleri var ve niş hakim: kan ve kemik iliği dolaşan ev edebiliyoruz ve Dissemine tümör hücreleri9,10. Hücre kültüründe stromal hücreler ve T-hücreleri (olarak bağışıklık sistemi için bir temsilci) gibi diğer hücre tipleri eksikliği tahlil ama tümör tedavisi duyarlılık eğitimi çoğu vitro deneyleri geçerli bir dezavantajı sınırlı değildir. Son ilaç onayları ve T hücreli yanıt etkisi devam eden çalışmalar ışığında, gelecekteki deneyler için ilaç keşif farklı deneyleri ve yöntemleri bir arada yürütülmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje Münih Üniversitesi bir grant tarafından finanse edildi (FöFoLe Proje-No: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
