Summary
Describimos la evolución de un modelo tridimensional, basado en el esferoide en vitro que nos permite poner a prueba el estándar actual de los regímenes de terapia experimental para cabeza y cuello de células escamosas en líneas celulares, con el objetivo de evaluar la terapia susceptibilidad y resistencia en células primarias de muestras humanas en el futuro.
Abstract
Opciones actuales de tratamiento para avanzados y recurrente de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) incluyen enfoques de quimio-radiación con o sin cirugía y radiación. Mientras que los regímenes de quimioterapia basados en platino actualmente representan el estándar de oro en cuanto a eficacia y en la mayoría de los casos, nuevos regímenes de quimioterapia, es decir, la inmunoterapia están surgiendo. Sin embargo, las tasas de respuesta y mecanismos de resistencia de la terapia para cualquier régimen de quimioterapia son difíciles de predecir y permanecen insuficientemente entendido. Amplias variaciones de mecanismos de resistencia de radiación y quimio son conocidas hasta la fecha. Este estudio describe el desarrollo de un análisis estandarizado, de alto rendimiento en vitro para evaluar la respuesta de la línea celular HNSCC a varios regímenes de tratamiento y ojalá en células primarias de pacientes individuales como una futura herramienta para tumor personalizada terapia. El ensayo está diseñado para ser integrado en el algoritmo estándar de control de calidad para los pacientes HNSCC en nuestro centro de atención terciaria; sin embargo, esto será tema de futuros estudios. Viabilidad técnica parece prometedora de células primarias de las biopsias tumorales de pacientes reales. Las muestras se transfieren en el laboratorio. Las biopsias se separan mecánicamente seguido por digestión enzimática. Las células son luego cultivadas en ultra baja de la adherencia de la célula los frascos de cultivo que promueven la formación de conglomerados de células tridimensionales en forma de esferoide, reproducible, estandarizada y espontánea. Esferoides son entonces listos para ser expuestos a protocolos de quimio-radiación y protocolos de inmunoterapia según sea necesario. El tamaño de la célula final viabilidad y esferoide son indicadores de susceptibilidad de la terapia y por lo tanto se pueden sacar en cuenta en el futuro para evaluar respuesta a terapia probablemente los pacientes. Este modelo podría ser una herramienta valiosa y rentable hacia una terapia personalizada para el cáncer de cabeza y cuello.
Introduction
Carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo con una creciente incidencia de mucosa virus del papiloma humano (VPH) asociada a infección patogenia, junto a una mayoría de casos causada por el alcohol y la nicotina excesiva consumo 1,2. Mientras que tumores más pequeños y las etapas pre-invasivas son generalmente bien tratables con la supresión quirúrgica, generalmente combinada con la disección del nodo de linfa cervical, tratamiento para HNSCC estadio avanzado y recurrente sigue siendo difícil debido a la invasión de tumor agresivo con diseminación metastásica y resistencia a la radiación y la quimioterapia protocolos3,4,5,6,7,8. Estudios recientes sugieren una alta variabilidad del fenotipo celular y sub-caracterización de la circulación y las células del tumor diseminado ha empezado9,10. La creencia anterior de un tumor sólido, uniforme masa tuvo que ser revisada a la luz de estudios recientes en el pasado años11,12,13,14. Enfoques actuales para la caracterización del tumor y la identificación de mutaciones claves podrían identificar varios genes que parecen estar asociados con la resistencia de la terapia, pero siguen un enfoque de coste-intensivo. Por otra parte, el conocimiento del genotipo no permite necesariamente una predicción confiable de fenotipo y su respuesta al tratamiento.
Ha habido pocos avances en mejorar la supervivencia general y libre de enfermedad para la enfermedad de estadio avanzado y recurrente. Para nicotina así como carcinoma asociado a virus, opciones actuales de tratamiento además de cirugía incluyen radiación agresivo y los regímenes de quimioterapia basados en platino. Ha habido implicaciones para las tasas de respuesta diferente entre carcinoma VPH negativos y positivo; sin embargo, esto todavía no conducen a un cambio en general pautas de la terapia. Resistencia a la radiación y la quimioterapia es un fenómeno generalizado en todas las etapas de tumor y existe para quimioterapia con platino, así como para la terapia dirigida (Anti-EGFR; receptor de factor de crecimiento epidérmico) y recientemente de la inhibición de control15. Quimioterapia y radioterapia ineficaces vienen a un costo alto de morbosidad paciente significativa en cuanto a la disfagia, mucositis, boca seca y el riesgo de disminución de la función renal o cardíaca, entre otros. Predecir a antes de la terapia respuesta la decisión de un concepto general de la terapia para cada paciente parece ser el objetivo fundamental, prevenir conceptos innecesarios del tratamiento, efectos secundarios y los costos.
Se buscó establecer un modelo para probar susceptibilidad de tratamiento de cada paciente hacia la actual quimio-radiación estándar que podría integrarse en el algoritmo de tratamiento oncológico regular y control de calidad desde un punto técnico permanente. El lejano objetivo era utilizar el modelo sin usar líneas celulares muy alterada y envejecida, como mal que representan células del tumor humano real sin su variabilidad y heterogeneidad como sabemos ahora, al establecimiento del Protocolo se realizó en varias líneas celulares. Para ser independiente sólo desde líneas celulares disponibles en el mercado, nos recientemente con éxito genera una línea intermedia de la célula llamada "PiCa" de las células primarias de HNSCC de muestras tumorales humanas con marcadores celulares conservados en sus pasajes superficiales y limitadas 16. línea de celular esta PiCa debe servir como una preparación para el desarrollo del modelo en el camino para más adelante siguiendo los ensayos con células de cáncer humanas frescas procedentes de biopsias de tumor. Se ha demostrado que las células en la célula tridimensional las culturas reaccionan de manera diferente y más en vivo-como a la administración de fármacos contra el cáncer que crecen en monocapas17,18,19,20 ,21, debido principalmente a la conservación de migratorias y diferenciación de las propiedades de ciertos subconjuntos de células22,23,24. Aquí, describimos el protocolo de un modelo tridimensional, basado en el esferoide de líneas de células intermedias y formas y células de carcinoma de célula squamous humanos primario Cómo integran este modelo en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello cirujano y oncólogo ( Figura 1).
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Protocol
Todos los estudios que se muestra en este manuscrito, es decir, el uso de muestras de tumores humanos, están protegidos bajo consentimiento con anteriores decisiones de la Universidad de medicina de Maguncia/Universidad del Comité de ética médica de centro de Munich. Pacientes han dado consentimiento según las disposiciones legales nacionales de acuerdo al uso científico de exceso de material biológico que se obtuvo en el curso de su tratamiento. Investigación se ha realizado en cumplimiento de todas las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano.
1. tomar una biopsia del Tumor de cabeza y Carcinoma de célula Squamous Heck
- Realizar infiltración local (ultracaine 2%, adrenalina) o general (propofol o sevoflurano, agente relajante muscular) superficie (Xilocaína) anestesia en la sala de operaciones u Otorrinolaringología silla de examen. Visualizar la masa tumoral en orales cavidad/faringe/laringe/otras partes del tracto digestivo y respiratorio superior con instrumentos de funcionamiento estándar y, si es necesario, bajo el microscopio.
- Tomar una biopsia de tumor fresco de la periferia de la lesión cancerosa con instrumentos romos o corte. Evitar el centro de la lesión debido a la necrosis abundante en esta zona. Poner el tejido obtenido a un recipiente estéril con solución de cloruro de sodio isotónica.
- Después de la biopsia, realizar hemostasia según se necesite, por ej., con un dispositivo de coagulación bipolar o monopolar, además del uso de sustancias vasoconstrictoras.
- Traer la biopsia del tumor destinada a ser utilizado para experimentos de cultivo celular directamente a la zona de laboratorio adyacente. Enviar otras biopsias de tumor para el patólogo como de costumbre para descartar un cáncer.
- Asegúrese que un técnico de laboratorio está preparado para procesar a la muestra directamente.
2. procesamiento de la muestra de Tumor
- Coloque al espécimen del tumor en una superficie adecuada y estéril y cortar bien con un bisturí estéril de un solo uso en piezas lo menos posibles.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la situación de las enfermedades infecciosas y transmitidas por la sangre está bien documentada y es el técnico en atención de las instituciones estándar protocolos para evitar que la aguja corte lesiones potencialmente material paciente biohazard o palo y de la protocolos a seguir después de lesiones. - Después de suficiente separación mecánica de los tejidos primarios, ponga el tejido en un frasco que contienen colagenasa I / II e incubar 1 h a 37 ° C. Tamiz a través de un tamiz de célula de halcón μm 70 y lavar la suspensión con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS).
-
Tras exitosa separación y posterior lavado, coloque la suspensión que contiene 1-2 x 106 células en un frascos de cultivo de célula T75 (75 cm2) para crecer a sub-confluencia a 5% CO2 y temperatura de 37 ° C. Este paso puede tardar hasta 10 días.
- Utilizar medio de cultivo de queratinocitos especial que consiste en lo siguiente: 125 mL de Dulbecco de modificado medio de águilas (DMEM), 250 mL de Keratinocyte complementado medio (complementa consisten en 500 mL de medio de SF de queratinocitos, 15 mg de hipófisis bovina Extracto (BPE), 2,5 mL de penicilina/estreptomicina 150 ng recombinante humano epitelial factor del crecimiento (EGF), 516 μl 300 mm CaCl2, mezcla acción a preparar con antelación), 125 mL de la mezcla de nutrientes F12, 10 mg de BPE (0,75 mL), EGF humano recombinante de 75 ng (2 μL) , 3,75 mL de 200 mM L-Alanil-L-Glutamin-dipéptido (tabla de materiales).
3. siembra las células en placas ultra baja de la adherencia de la célula
- Confirman el crecimiento de la célula del tumor bajo un microscopio. Contar las células en cultivo (primaria o célula cultura) y 5.000 células del tumor primario o 1.000-2.000 células de la línea intermedia de la célula de la semilla / la otra línea celular en 200-300 μL de medios (paso 3.2.) en una placa de adherencia muy bajas con cóncavo, redonda fondos (96 pocillos).
-
Cultura las celdas de 5% CO2 a 37 ° C y en medio de partes iguales DMEM y vía aérea célula epitelial (BEGM), suero bovino fetal 10%, 1% de penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio 1%, los de aminoácidos no esenciales 1%, 1% L-glutamina (paso 2.3.). Si se utilizan líneas celulares, medios de comunicación sobre la base de DMEM son suficiente.
- Realizar cambios de los medios de comunicación todos los días. Prestar atención no a aspirar el esferoide con la pipeta durante los cambios de los medios de comunicación. Cultura los esferoides hasta el nivel de crecimiento como describen en 3.3 se alcanza (aproximadamente 7-10 días).
- Confirmar la formación esferoide espontánea bajo el microscopio en busca de conglomerados de células tridimensionales, en forma de esferoide. Excluir los pozos con irregular o la formación múltiple del esferoide de más investigación.
Nota: Esferoides deben ser visibles a simple vista, también, facilitar el tratamiento posterior y cambios de los medios de comunicación como se describe a continuación.
4. exposición de esferoides a la terapia Multimodal Tumor estándar o Experimental
- Elegir un régimen de terapia deseada. Diseño de grupos de control lo suficientemente grande que permiten comparaciones de tratamientos esferoides o esferoides reciben sólo parcial regímenes, por ejemplo. radiación sola. El tamaño de los grupos de control depende del diseño del grupo experimental y no se puede definir universalmente.
- Intercambio de los medios de comunicación a medios con aditivos, medios de comunicación de significado con quimioterapia o anticuerpos monoclonales en las concentraciones deseadas. Agregar cisplatino en las concentraciones de 2,5/5/10 μm o 5-fluoruracil (5FU) en 30 μm.
Nota: Para experimentos de alto rendimiento o grupo grande tamaños grandes número de grupos, uno puede utilizar un robot de pipeteo automatizado como estamos estableciendo aún más en los experimentos. - Por otra parte, irradian las placas de cultura de célula con esferoides en 2 Gy usando una facilidad conveniente de la radiación.
PRECAUCIÓN: Respetar los protocolos de la institución en materia de prevención de exposición a la radiación perjudicial de los empleados. Trabajar sólo con técnicos capacitados y designados según las directrices de protección de radiación. Si se desea, agregar quimioterapia como se describe en 4.2. luego. - Incube las células durante 24 h en condiciones de cultivo previamente descritos (37 ° C, paso 3.2).
- Después de la incubación, continuar el cultivo celular de al menos 6 días con los cambios de los medios de comunicación cada día.
5. evaluación del tamaño del esferoide y el grado de proliferación celular para lectura de ensayo
- Medir el tamaño del esferoide en términos de área después de la documentación digital de la foto el día 6 (día 10, día 16) con un software gráfico (parámetro 1).
- Después de la centrifugación a 520 x g durante 2,5 min de la placa, retirar el sobrenadante. Lavar las células con suficiente cantidad de 1 x PBS y centrifugar la placa otra vez como se describe, seguida por retirar el sobrenadante (PBS).
- Añada 100 μl de solución de separación enzimática de la célula a cada frasco para permitir que los esferoides a disolver. Incube la placa durante 8 min a 37 ° C.
- Compruebe la disolución acertada de la esferoide bajo el microscopio. Añada 100 μl de DMEM. Centrifugar la placa a x 520 g 2,5 min retirar el sobrenadante y suspender las células en 100 μl de DMEM.
- Realizar un ensayo de proliferación colorimétricos disponibles comercialmente, en ensayo WST-8 de ejemplo en cada frasco de acuerdo con las instrucciones25 el fabricante. Leer el ensayo en un lector de ensayo (ELISA) de enzima-ligado del inmunosorbente (parámetro 2).
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Representative Results
Hemos sido capaces de generar reproducible esferoides de suspensiones de la célula, primero de diferentes líneas celulares incluyendo la propia línea de celular de PiCa, más adelante de cáncer primario en humanos en células de biopsias de tumor fresco como se describe en Hagemann et al. . 26. se evaluaron dos métodos establecidos para la generación de esferoide; las dos son el supuesto ahorcamiento drop (HD) método y el método de adherencia muy bajas (ULA), el último siendo el más efectivo y seguro. Hemos sido capaces de destacar las ventajas del método ULA comparado con HD, incluyendo el crecimiento más rápido del esferoide, menos problemas con la placa de manipulación, la consiguiente pérdida de esferoides con vibraciones pesadas y más crecimiento reproducible esferoide en términos de uniformidad ( Figura 2). La ocurrencia de varios esferoides por frasco era más común en el método de HD. Se revisaron para una caracterización más clara de morfología esferoide. La figura 3 muestra una inmunoquímica para Ki67, un marcador de la proliferación de un esferoide de las células de la PiCa. Como se describe en la literatura, esferoides consisten en menos la base con una proliferación de la capa externa de la proliferación, imitando diferentes regiones de proliferación de HNSCC sólido en los seres humanos. In vitro como in vivo, esto supuestamente es causado por un gradiente de nutrientes y de oxígeno suministrada por los medios de cultivo celular causando una disminución de la periferia al centro del tumor.
Entonces tratamos de mostrar que el ensayo es capaz de detectar variaciones de tamaño esferoidal después de la incubación con drogas quimioterapéuticas o la exposición a radiaciones ionizantes, representan dos regímenes de tratamiento estándar común de HNSCC. Antes posiblemente integrar el análisis de una rutina de tratamiento previo, la validación de la sensibilidad del ensayo sería un requisito previo. Estaban disponibles como puntos finales del análisis dos parámetros: tamaño de esferoide (zona; parámetro 1 del paso 5.1.) y proliferación (ver parámetro 2 en el paso 5.4.), siendo un marcador sustituto para viabilidad celular y potencial de crecimiento después de la terapia. Los resultados de los estudios de tratamiento con quimioterapéuticos comunes y protocolos de quimio-radiación se muestran en la figura 4. Exposición y la incubación de los esferoides con cisplatino o 5FU condujeron a una reducción significativa en la velocidad de crecimiento con el tiempo en comparación con un grupo control sin tratar (p< 0,001). Radiación con 2Gy fue capaz de reducir la velocidad de crecimiento en forma significativa (p< 0.01). El análisis de supervivencia (WST-8) fue capaz de detectar un valor adicional significativo de quimio-radiación con cisplatino en comparación con la radiación sola (p = 0.017), previamente no se detectan diferencias en la evaluación del tamaño del esferoide. Esto subraya su importancia para el análisis como un todo, aumentando su sensibilidad de respuesta a la terapia pequeños cambios.
Figura 1: concepto de modelo en la manera a la futura terapia personalizada. Pacientes con cualquiera de los dos antecedentes de infección mucosa y/o historia de abuso de alcohol y tabaco presente a nuestro centro de atención terciario de referencia para el diagnóstico de sospecha de cáncer de cabeza y cuello. Se toman biopsias de áreas sospechosas de mucosa o masas de tumor macroscópico bajo anestesia para asegurar el diagnóstico. Además, tomamos biopsias de tumor para generar cultivos celulares tridimensionales en forma de esferoide en el laboratorio. A un crecimiento suficiente de esferoides base primaria de la célula, les exponemos a actuales regímenes de tratamiento estándar o experimentales para probar la respuesta a la terapia individual. Más análisis de las variaciones genéticas o moleculares pueden agregarse después de análisis de los resultados de la terapia. Resultados de la terapia en vitro pueden establecerse en consideración para el proceso de planificación conceptos de terapia para el paciente. Esta figura es reimpreso de Hagemann, J., et al. 26, con permiso concedido por la revista y los autores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: todas las líneas celulares podrían generar esferoides confiables; diferencias en tamaño y tiempo de lectura según figura 1. En experimentos preliminares, células primarias no formaron esferoides reproducibles en HD pero las placas de la ULA (inferior izquierda). Estudios adicionales deben realizarse para evaluar características de crecimiento del esferoide de células primarias. El número de células de la derecha es el número inicial de células en el frasco para formar un esferoide. Esta figura es reimpreso de Hagemann, J., et al. 26, con permiso concedido por la revista y los autores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ki67 tinción inmunoquímica de un segmento de esferoide (PiCa). La periferia de la cultura muestra tasas mucho más altas de proliferación de las células centrales, imitando la distribución de nutrientes en tumores sólidos de mucosa que a menudo muestran núcleos necróticos. Esta figura es reimpreso de Hagemann, J., et al. 26, con permiso concedido por la revista y los autores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: estudios de la terapia. (A) células PiCa fueron cultivadas para generar esferoides (n = 12 por grupo) en las placas de la ULA. Las células fueron estimuladas según el protocolo con cualquiera PBS como control, cisplatino en 5 μm o 5FU a 30 μm. tamaños de los esferoides se determinaron en el día 6, 10 y 16 según protocolos estándar. Tratamiento cisplatino y 5FU llevó a una disminución significativa en el tamaño (p-los valores están dados en la parte inferior izquierda en la sección (B) idéntico diseño experimental como en (A) (n = 12), pero con radiación adicional de 2Gy. (C) muestra min al máximo. Según el p-valores indicados en (C), radiación anterior con 2Gy condujo a una disminución significativa en el tamaño del esferoide en el grupo control, imitando a radioterapia y que muestra la sensibilidad de la radiación de las células de la PiCa. Radiación en combinación con cisplatino tratamiento no condujo a una disminución más significativa en tamaño del esferoide (p> 0.05). Muestra min a max. (C) calcula p-valores de análisis ANOVA de 2 vías de análisis de los experimentos A y B. WST8 (D) realizada el día 16 como una alternativa para el análisis planimétrico (área) de los esferoides. Análisis de WST8 fueron capaces de detectar una disminución significativa en células vivas después de quimio-radiación (radiación de 2Gy y cisplatino) comparada con cisplatino solo (p = 0.017), por lo tanto, con la ventaja de combinar el análisis planimétrico y WST8 ensayo colorimétrico en el momento de la lectura del ensayo. Muestra min al máximo. Esta figura es reimpreso de Hagemann, J., et al. 26, con permiso concedido por la revista y los autores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos sido capaces de establecer un protocolo para generar esferoides reproducibles a partir de suspensiones celulares, para ambas líneas celulares y, en experimentos preliminares, las células humanas del tumor primario. Primero evaluaron dos métodos anteriormente descritos e identificó el ULA-método, un método donde se utilizan placas con superficies de adherencia muy bajas, para ser la más segura y más confiable para la generación de esferoides tridimensionales uniforme. Mediante la combinación de dos métodos independientes para lectura de ensayo (viabilidad de tamaño o área y celular), este análisis multimodal es suficientemente sensible para identificar pequeñas diferencias entre los grupos. Este es el primer paso para la prueba de viabilidad técnica para la integración posterior del ensayo en la vía clínica en nuestro centro de atención terciaria. En el futuro, podría utilizarse para (i) evaluar la susceptibilidad de cada tumor a primera-segunda-o tercero-línea terapia protocolos comunes (reactivos de quimioterapia, radiación) y protocolos de terapia experimental, (ii) más caracterizan a las células tumorales de muestras frescas y correlacionar patrones moleculares de la superficies o citoplasmáticos en respuesta a la terapia. Esferoides de especímenes procedentes de localizaciones del tumor diferentes, por ejemplo, primaria y la metástasis de nodo de linfa, son imaginables.
A través de la creación del protocolo y método, hemos utilizado diferentes conocidas líneas celulares, unos están bien establecidos durante décadas. La mera edad de las líneas celulares plantea la duda de su conexión y la comparabilidad a las células de tumor humano real actual, supuestamente después de haber perdido varios marcadores moleculares propiedades y sello. Resultados de experimentos en vitro eran difíciles de reproducir en humanos o en vivo ensayos27. Por lo tanto nos centramos en una línea de células recientemente generada de células humanas del tumor primario en nuestras instalaciones que es bien caracterizado16. Con esta línea celular PiCa, fueron capaces de realizar experimentos de tratamiento a una escala mayor y confirmó las expectativas actuales de la terapia. Esto apoya la teoría de que las células PiCa reflejan comportamiento de tumor humano real mejor que otras, más años de edad y los líneas de celulares que sufrió numerosos pasos. Las células que pueden experimentar la selección no fisiológicos debido a las condiciones en vitro a largo plazo podrían sesgar sensibilidad de quimio-radiación. En experimentos recientes, se confirmó la viabilidad con células primarias en lo que respecta a formación esferoide confiable; sin embargo, más y más grandes experimentos tienen que realizarse antes de poder aplicar el análisis en rutina clínica.
Se supone que esferoides y cultivo celular tridimensional en general reaccionan diferentemente con respecto a cultura 2D convencional cuando se expone a drogas quimioterapéuticas o la radiación 28. La arquitectura de esferoides conduce a un gradiente de oxígeno y la nutrición entrega de superficie exterior al núcleo, y estudios recientes han demostrado que también entrega la droga a diferentes partes de la agrupación tridimensional de la célula no es uniforme29. Además, las células en cultivo de esferoide parecen preservar ciertos patrones de expresión génica asociados a resistencia a los fármacos en animales modelos 30. Le sugerimos que también resistencia a la radiación llamada, una característica que se ha relacionado con cáncer de cabeza y cuello en numerosos pacientes, es el resultado de la interacción célula-célula y microambientes distintos conducen a variaciones en el suministro de oxígeno y actividad metabólica. Este fenómeno podría mímico en esferoides debido a una funcionalidad más en vivo . En conclusión, el uso de pilas y la generación de esferoides podrían permitirnos preservar tantos como posibles características en vivo del crecimiento del tumor en combinación con un análisis costo-eficiente para el estudio de respuesta a la terapia individual.
Ciertamente existen limitaciones al enfoque. Hasta la fecha, se desconoce cómo las células de los pacientes individuales diferentes llevará a cabo en el ensayo de exponerse al tratamiento del tumor, y el ensayo predictivo cómo es en cuanto a la correlación con el resultado de la terapia más tarde. Estudios excesivos son necesarios simplemente comparar el rendimiento en vitro y curso clínico. Entre otros, es decir, dos factores contribuyen a esta incertidumbre: heterogeneidad del tumor y la falta de co-cultivo con células stromal e inmunes. Heterogeneidad del tumor es un fenómeno no totalmente entendido y existe entre los diferentes subsitios de la primaria, así como localización primaria y metastásica12. Desde estudios recientes, hay un tercer sitio donde muy diferenciadas y células tumorales especializado pueden y prevalecen en nichos: sangre y médula ósea son capaces de circular de la casa y tumor diseminado células9,10. La falta de otros tipos celulares como células del estroma y las células T (como representante para el sistema inmunológico) en cultivos celulares no se limita a la prueba, pero una desventaja válida de la mayoría en vitro ensayos estudio de susceptibilidad de la terapia de tumor. A la luz de las últimas aprobaciones de medicamentos y estudios en curso que influyen en la respuesta de células T, se realizarán experimentos futuros para el descubrimiento de medicamentos en una combinación de diferentes ensayos y métodos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por una beca de la Universidad de Munich (no. FöFoLe proyecto: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
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