Summary
Vi beskrive utviklingen av en spheroid-basert, tredimensjonal i vitro modell som gjør det muliggjør for oss å teste den gjeldende standarden av eksperimentell behandling regimer for hodet og nakken squamous celle carcinoma på cellelinjer, sikte på vurderer terapi mottakelighet og motstand på primære celler fra menneske prøver i fremtiden.
Abstract
Gjeldende behandlingstilbud for avanserte og tilbakevendende hode og nakke squamous celle carcinoma (HNSCC) setter stråling og kjemoterapi-stråling tilnærminger med eller uten kirurgi. Mens platinum-baserte kjemoterapi regimer for tiden representerer gullstandarden når det gjelder effekt og er gitt i de aller fleste tilfeller nye kjemoterapi regimer, nemlig immunterapi dukker opp. Svarprosenten og terapi motstand mekanismer for enten kjemoterapi diett er imidlertid vanskelig å forutsi og fortsatt forstått. Brede varianter av chemo og stråling resistens er kjent ennå. Denne studien beskriver utviklingen av en standardisert, høy gjennomstrømming i vitro analysen å vurdere HNSCC celle linjens svar på ulike behandling regimer, og forhåpentligvis på primære celler fra individuelle pasienter som et fremtidig verktøy for personlig svulst terapi. Analysen er utformet til å bli integrert i kvalitetssikrede standard algoritmen for HNSCC pasienter ved våre tertiær care center; men vil dette være gjenstand for framtidige studier. Teknisk gjennomførbarhet ser lovende for primær celler fra svulst biopsier fra faktiske pasienter. Prøver blir deretter overført til laboratoriet. Biopsier skilles mekanisk etterfulgt av enzymatisk fordøyelsen. Celler er så kultivert i svært lav vedheft celle kultur ampuller som fremmer reproduserbare, standardisert og spontane dannelsen av tredimensjonale spheroid-formet cellen konglomerater. Spheroids er da klar til å bli utsatt for kjemoterapi-stråling protokoller og immunterapi protokoller etter behov. Den endelige cellestørrelsen levedyktighet og formet indikatorer på terapi mottakelighet og derfor kunne trekkes i betraktning i fremtiden å vurdere pasientens sannsynlig terapi svar. Denne modellen kan være en verdifull, kostnadseffektive verktøy mot personlig terapi for hode og nakke kreft.
Introduction
Hodet og nakken squamous celle carcinoma (HNSCC) er den sjette vanligste kreften over hele verden med forekomst av slimhinnene humant papillomavirus (HPV) infeksjon-assosiert patogenese, ved siden av et flertall av tilfeller skyldes overdreven nikotin og alkohol forbruk 1,2. Mens mindre svulster og pre invasiv stadier er vanligvis godt behandles med kirurgisk excision, vanligvis kombinert med cervical lymfeknute disseksjon, fortsatt behandling for avansert stadium og tilbakevendende HNSCC utfordrende på grunn av aggressive svulst invasjonen med metastatisk spredning og motstand mot stråling og kjemoterapi protokoller3,4,5,6,7,8. Nyere studier tyder på en høy variasjon av mobilnettet fenotypen og sub karakterisering av sirkulerende og spres kreftceller har nettopp begynt9,10. Tidligere troen på en solid, uniform svulsten masse måtte revideres i lys av nyere studier i tidligere år,11,,12,,13,,1,4. Gjeldende metoder for svulst karakterisering og identifisering av viktige mutasjoner kan identifisere flere gener som synes å være knyttet til terapi motstand, men fortsatt en kostnadskrevende tilnærming. Videre tillater kunnskap om genotype nødvendigvis ikke en pålitelig forutsigelse av fenotypen og dens behandlingsrespons.
Det har vært noen fremskritt i å forbedre generelle og sykdomsfri overlevelse for avansert stadium og tilbakevendende sykdom. For nikotin - som virus-assosiert carcinoma setter gjeldende behandlingstilbud foruten kirurgi aggressiv stråling og platina-baserte kjemoterapi regimer. Det har vært konsekvenser for ulike svarprosenten mellom HPV-negative og positive karsinom; men dette har ennå ikke føre til en endring i terapi retningslinjer. Motstand mot stråling og kjemoterapi er et utbredt fenomen i alle svulst stadier og finnes for platinum-baserte kjemoterapi så vel som for målrettet terapi (Anti-EGFR; epidermal vekstfaktor reseptor) og nylig fremvoksende checkpoint hemming15. Ineffektiv stråling og kjemoterapi kommer til en høy pris av betydelig pasienten sykelighet dysfagi, mukositt, tørr munn og risikoen for reduksjon av nyre eller hjerte funksjonen blant andre. Forutsi terapi svar før synes vedtaket av en generell terapi for hver enkelt pasient å være det avgjørende målet, forhindrer unødvendige behandling konsepter, bivirkninger og kostnader.
Vi forsøkte å etablere en modell for å teste enkelte pasients behandling mottakelighet mot gjeldende standard kjemoterapi-stråling som kan integreres i regelmessig og kvalitetssikrede oncologic behandling algoritmen fra et teknisk stående punkt. Langt målet var å bruke modellen uten forandret og alderen cellelinjer, som de dårlig representerer faktiske menneskelig kreftceller uten deres variasjon og heterogenitet som vi vet nå, mens etableringen av protokollen ble gjort i ulike linjer. For å bli uavhengig fra kommersielt tilgjengelige cellelinjer, har vi nylig har generert en mellomliggende cellen linje kalt "PiCa" fra primær HNSCC celler fra menneskelige svulst prøver med bevarte mobilnettet indikatorer på dens overflate og begrenset passasjer 16. dette PiCa celle linje bør tjene som en forberedelse til utviklingen av modellen på veien til deretter senere etter forsøk med friske menneskelige celler fra svulst biopsier. Det har vist at celler i tredimensjonale cellen kulturer reagere annerledes og mer i vivo-gjerne administrasjon av kreft narkotika enn de vokser i monolayers17,18,19,20 ,21, hovedsakelig på grunn av bevaring av trekkfugler og sub atskilling egenskaper bestemt celle delsett22,23,24. Her beskriver vi protokoll for en spheroid-basert, tredimensjonal modell fra mellomliggende linjer og primære menneskelige squamous celle carcinoma celler og måter hvordan integrere slik modell i kreftbehandling av hodet og nakken kirurg og onkolog ( Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier vist i dette manuskriptet, nemlig bruken av menneskelig svulst, er beskyttet under og i samtykke med tidligere avgjørelser fra Universitetet medisin av Mainz/universitet av etikk for München Medical Center. Pasienter har gitt samtykke i henhold til nasjonale juridiske retningslinjer aksepterer vitenskapelig bruk av biologisk materiale som ble oppnådd i løpet av deres behandling. Forskning er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd.
1. ta en svulst biopsi fra hodet og pokker Squamous celle Carcinoma
- Utføre generelt (propofol og/eller desflurane, muskel avslappende agent) eller lokale infiltrasjon (2% ultracaine, adrenalin) / overflate (xylocaine) anestesi i operasjonsstuen eller øre eksamen stolen. Visualisere svulst massen i muntlige hulrom/svelg/strupehode/andre deler av den øvre fordøyelsen og respiratoriske skrift med standarden opererer instrumenter og, om nødvendig, under mikroskopet.
- Ta en fersk svulst biopsi fra utkanten av kreft lesjonen med skjærende eller stump instrumenter. Unngå sentrum av lesjonen på grunn av rikelig nekrose i dette området. Sette innhentet vevet en sterile containeren med isoton natriumklorid.
- Etter biopsy, utføre hemostasen etter behov, f.eks., med en bipolar eller monopolar koagulering enhet i tillegg til bruk av vasoconstrictive stoffer.
- Bringe den svulst biopsy brukes for cellekulturer eksperimenter direkte til den tilstøtende laboratorium skrift. Sende andre svulst biopsier til patologen som vanlig å utelukke kreft.
- Kontroller at et laboratorium tekniker er klar til å behandle prøven direkte.
2. behandling svulst prøven
- Plasser svulst prøven på en egnet og sterile overflate og skjær den grundig med sterilt engangs skalpell i mulig biter.
Forsiktig: Kontroller statusen for infeksjonssykdommer og blodbårne er godt dokumentert og teknikeren er i oppmerksomhet institusjoner standard protokoller for å hindre p pinne eller kutte skader med potensielt farlig biologisk pasienten materiale og protokoller å følge etter mulig skade. - Etter nok mekanisk separasjon av primære vev, sette vevet i ampuller som inneholder Collagenase jeg / II og Inkuber 1t på 37 ° C. Sil gjennom en 70 µm falcon celle sil og vask suspensjon Hanks' balansert Salt løsning (HBSS).
-
Etter vellykket separasjon og påfølgende vask, plassere suspensjon som inneholder 1-2 × 106 celler i en MT75 celle kultur flasker (75 cm2) å vokse til sub-confluency på 5% CO2 og temperaturen på 37 ° C. Dette trinnet kan ta opp til 10 dager.
- Bruke spesielle keratinocyte kultur medium som består av følgende: 125 mL Dulbecco modifiserte eagles medium (DMEM), 250 mL Keratinocyte supplert medium (supplert middels bestående av 500 mL Keratinocyte SF Medium, 15 mg av bovin hypofysen ekstra (BPE), 2,5 mL av penicillin/streptomycin, 150 ng rekombinant menneskelige epithelial vekstfaktor (EGF), 516 µL av 300 mM CaCl2, lager blanding å være forberedt på forhånd), 125 mL F12 næringsstoff blanding, 10 mg av BPE (0,75 mL), 75 ng rekombinant menneskelige EGF (2 µL) , 3.75 mL 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (tabell av materialer).
3. seeding cellene i svært lav vedheft celle kultur platene
- Bekreft svulst cellevekst under et mikroskop. Telle celler i kultur (primær eller celle kultur) og frø 5000 primære svulst celler eller 1000-2000 celler av mellomliggende cellen linje / andre cellen linje i 200-300 µL av media (trinn 3.2.) til en svært lav vedheft plate med konkav, runde bunner (96-brønnen).
-
Kultur cellene på 5% CO2 på 37 ° C og i like deler DMEM og luftveier tarmepitelet medium (BEGM), 10% fosterets bovin serum, 1% penicillin/streptomycin, 1% natrium pyruvate, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% L-glutamin (trinn 2.3.). Hvis cellelinjer brukes, er media på grunnlag av DMEM tilstrekkelig.
- Utføre media endringer annenhver dag. Bry ikke Sug opp formet med pipette under media endringer. Kultur på spheroids til nivået av vekst som beskrevet i 3.3 nås (ca 7-10 dager).
- Bekreft spontan formet formasjon under mikroskopet etter tredimensjonale spheroid-formet cellen konglomerater. Ekskludere brønnene med uregelmessig og/eller flere formet formasjon fra videre undersøkelser.
Merk: Spheroids må være synlig med det blotte øye, også tilrettelegge ytterligere behandling og media endringer som beskrevet nedenfor.
4. utsette Spheroids til flere Standard eller eksperimentelle Tumor terapi
- Velg en ønsket behandling diett. Utforme tilstrekkelig stor kontroll grupper at sammenligninger av ubehandlet spheroids eller spheroids mottar bare delvis behandling regimer, f.eks. stråling alene. Kontrollgruppe avhenger forsøksgruppen og kan ikke defineres universelt.
- Utveksle media til media med tilsetningsstoffer, betyr media med chemotherapeutics og/eller monoklonale antistoffer i ønsket konsentrasjoner. Legge til Cisplatin på konsentrasjonen av 2.5/5/10 µM eller 5-fluoruracil (5FU) på 30 µM.
Merk: For høy gjennomstrømning eksperimenter eller stor gruppe størrelser/store antall grupper, kan man bruke en automatisert pipettering robot som vi videre etablerer i forsøkene. - Alternativt utstråle celle kultur platene med spheroids på 2 Gy bruker et egnet stråling anlegg.
Forsiktig: Respekt institusjonens protokoller om forebygging av skadelige stråling ansatte. Fungerer bare angitte og trente teknikere i henhold til retningslinjene for stråling. Hvis ønskelig, legge chemotherapeutics som beskrevet under 4.2. etterpå. - Inkuber celler for 24 h i beskrevet tidligere oppdrettsforholdene (37 ° C, trinn 3.2).
- Etter inkubasjon, fortsette i cellekultur i minst 6 dager med media endringer annenhver dag.
5. vurdering av Spheroid størrelsen og utstrekning av mobilnettet spredning for analysen lese-out
- Måle spheroid størrelsen i forhold til området etter digital foto dokumentasjon på dag 6 (dag 10, dag 16) med en grafisk programvare (parameter 1).
- Etter sentrifugering 520 x g for 2,5 min av platen, fjerne nedbryting. Vask cellene med tilstrekkelig mengde av 1 x PBS og sentrifuger platen igjen som beskrevet, etterfulgt av fjerne nedbryting (PBS).
- Legg 100 µL av enzymatisk celle avdeling løsning til hvert hetteglass tillate spheroids å oppløse. Inkuber platen i 8 min på 37 ° C.
- Se etter vellykkede oppløsning av spheroid under mikroskopet. Legg 100 µL av DMEM. Sentrifuge platen 520 x g for 2,5 min. Fjern nedbryting og suspendere cellene i 100 µL av DMEM.
- Utføre en kommersielt tilgjengelig kolorimetrisk spredning analysen, i eksemplet WST-8 analysen på hvert hetteglass i henhold til produsentens instruksjoner25. Lese ut analysen i en enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) leser (parameter 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi kunne reproduserbar generere spheroids fra enkelt celle suspensjoner, først fra forskjellige linjer inkludert proprietær PiCa celle linjen, senere fra primære menneskelige kreftceller avledet fra frisk svulst biopsier som beskrevet i Hagemann et al . 26. vi vurdert to etablerte metoder for spheroid generasjon; de to er den såkalte hengende slippe (HD) og ultra-lav vedheft (ULA)-metoden, sistnevnte er en mer effektiv og sikker. Vi klarte å fremheve fordelene med metoden ULA sammenlignet med HD, inkludert raskere spheroid vekst, færre problemer med platen håndtering, påfølgende tap av spheroids med sterke vibrasjoner og mer reproduserbar spheroid vekst i ensartethet ( Figur 2). Forekomsten av flere spheroids per medisinglass var mer vanlig i HD-metoden. Vi sjekket for skarpere karakteristikk av spheroid morfologi. Figur 3 viser en immunochemistry flekk for Ki67, merketråd spredning av en spheroid fra PiCa celler. Som beskrevet i litteraturen, består spheroids av en mindre voksende kjernen med et voksende ytre lag, etterligne ulike regioner av spredning av solid HNSCC hos mennesker. I vitro som in vivo, dette er angivelig forårsaket av en gradient næringsstoffer og oksygen fra celle kultur media forårsaker en nedgang fra periferien til midten av svulsten.
Vi prøvde deretter å vise at analysen er kjøpedyktig merker variasjoner i spheroid størrelse etter inkubasjon med cellegifter eller eksponering for ioniserende stråling, her representerer to vanlige standard behandlingsregimer for HNSCC. Før muligens integrere analysen i en pre-behandling rutine, vil validering av sensitiviteten av analysen være en forutsetning. To parametere ble tilgjengelig som endepunktene til analysen: spheroid størrelse (området, parameter 1 fra trinn 5.1.) og spredning (se parameter 2 fra trinn 5.4.), blir en surrogat markør for cellen levedyktighet og vekstpotensial etter terapi. Resultatene av studiene behandling med felles chemotherapeutic og kjemoterapi-stråling protokoller er vist i Figur 4. Eksponering og inkubasjonstiden for spheroids med cisplatin eller 5FU førte til en betydelig reduksjon i veksten fart over tid i forhold til en ubehandlet kontrollgruppen (p< 0,001). Stråling med 2Gy kunne redusere veksten hastighet på en betydelig måte (p< 0,01). Overlevelse analysen (WST-8) kunne oppdage en ekstra, betydelig verdi av kjemoterapi-stråling med cisplatin sammenlignet med stråling alene (p = 0.017), en tidligere usett forskjellen i vurderingen av spheroid størrelse. Dette understreker dens betydning for analysen som helhet, augmenting sin følsomhet for små endringer terapi respons.
Figur 1: design av en modell på vei til fremtidige personlig terapi. Pasienter med enten bakgrunn av slimhinnene HPV-infeksjon og/eller historie av tobakk og alkohol misbruk presentere våre tertiær henvisning bekymre senter for mistenkte diagnostisering av hode og nakke kreft. Biopsies av mistenkelig mucosal områder eller makroskopisk svulst massene er tatt under narkose å sikre diagnose. I tillegg tar vi svulst biopsies å generere tredimensjonale spheroid-formet cellekulturer i laboratoriet. Ved tilstrekkelig veksten av primær-cellen basert spheroids utsette vi dem for gjeldende standard eller eksperimentell behandlingsregimer å teste for individuell terapi svar. Videre analyser av genetiske eller molekylær varianter kan legges etter analyse av terapi resultater. Terapi resultater i vitro kan trekkes i betraktning for prosessen planlegging terapi konsepter for pasienten. Dette tallet er gjengitt fra Hagemann, J. et al. 26, med tillatelse av forfattere og journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: alle linjer kan generere pålitelige spheroids; forskjellene i størrelse og tid for lese-out etter figur 1. Foreløpig eksperimenter, primær cellene ikke danner reproduserbar spheroids i HD men ULA plater (nederst til venstre). Videre studier er foretas evaluere spheroid vekst egenskaper fra primær celler. Antall celler til høyre er det opprinnelige antallet celler innlegge ampullen til en spheroid. Dette tallet er gjengitt fra Hagemann, J. et al. 26, med tillatelse av forfattere og journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ki67 immunochemistry flekker på en spheroid sektor (PiCa). Utkanten av kulturen viser mye høyere spredning enn sentrale celler, etterligne næringsstoffer distribusjon i solid mucosal svulster som viser ofte nekrotisk kjerner. Dette tallet er gjengitt fra Hagemann, J. et al. 26, med tillatelse av forfattere og journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: terapi studier. (A) PiCa celler ble dyrket til å generere spheroids (n = 12 per gruppe) i ULA plater. Cellene ble stimulert i henhold til protokollen med enten PBS som kontroll, cisplatin på 5 µM eller 5FU på 30 µM. størrelser av spheroids var bestemt på dag 6, 10 og 16 ifølge standardprotokoller. Cisplatin og 5FU førte til en betydelig reduksjon i størrelse (p-verdier er gitt venstre nederst i delen (B) identisk eksperimentell design som (A) (n = 12), men med ekstra stråling 2Gy. (C) Plot viser min til max. Ifølge p-verdier i (C), tidligere stråling med 2Gy førte til en betydelig reduksjon i spheroid størrelse i kontrollgruppen, etterligne strålebehandling og viser stråling følsomhet PiCa celler. Stråling i kombinasjon med cisplatin behandling ikke føre til en ytterligere betydelig reduksjon i størrelsen på spheroid (p> 0,05). Plottet viser min Max. (C) beregnet p-verdier fra 2-veis VARIANSANALYSE analyse fra eksperimenter A og B. (D) WST8 analysen utført på dag 16 som et alternativ for planimetric (område) analyse av spheroids. WST8 analyser kunne oppdage en betydelig reduksjon i levende celler etter chemo-stråling (2Gy stråling og cisplatin) forhold til cisplatin alene (p = 0.017), viser derfor fordelen av både planimetric analyse og WST8 kolorimetrisk analysen på tidspunktet for analysen lese-out. Plottet viser min til max. Dette tallet er gjengitt fra Hagemann, J. et al. 26, med tillatelse av forfattere og journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi klarte å etablere en protokoll for å generere reproduserbar spheroids fra cellen suspensjoner, for både linjer og i innledende eksperimenter, primære menneskelige kreftceller. Vi først vurdert to tidligere beskrevet metoder og identifisert ULA-metoden en metode der kultur plater med ultra-lav vedheft flater brukes, være den sikrere og mer pålitelig for generering av uniform tredimensjonale spheroids. Ved å kombinere to separate metoder for analysen skrivebeskyttet ut (/ området og celle levedyktighet), er denne flere analysen tilstrekkelig følsom å identifisere små forskjeller mellom gruppene. Dette er første skritt mot bevis på teknisk gjennomførbarhet senere integrasjon til analysen i klinisk veien på våre tertiært omsorg center. I fremtiden, det kan brukes å (i) vurdere personlige svulst mottakelighet for vanlige første - eller andre-/ tredje linje terapi protokoller (chemo-reagenser, stråling) og eksperimentell terapi protokoller, (ii) ytterligere karakterisere kreftceller fra frisk prøver og koordinere molekylær overflaten eller cytoplasmatiske mønster terapi svar. Spheroids fra prøver kommer fra forskjellige svulst lokaliseringen, f.eks, primær og lymph node metastasering, er tenkelig.
Gjennom etableringen av protokollen og metoden brukt vi ulike kjente cellelinjer, noen er godt etablert i flere tiår. Bare alder cellelinjer reiser tvil tilkobling og sammenlignbarhet til gjeldende faktiske menneskelig svulst cellene, har tapt flere egenskaper og hallmark molekylære markører. Resultatene fra i vitro eksperimenter var vanskelig å gjengi menneskelige eller i vivo forsøk27. Derfor fokuserte vi på en celle nylig generert fra menneskets primære svulst celler i våre anlegg som er godt preget16. Med denne cellen linje PiCa, vi kunne utføre behandling eksperimenter på en større skala og bekreftet forventinger terapi. Dette støtter teorien at PiCa celler gjenspeiler faktiske menneskelig svulst problemet bedre enn andre, mer alderen og passaged cellelinjer som gjennomgikk flere avsnitt. Celler som kan gjennomgå ikke-fysiologiske utvalg på grunn av langsiktig i vitro forhold kan bias chemo-stråling følsomhet. I senere eksperimenter bekreftet vi muligheten med primær celler i forhold til pålitelig formet formasjon; videre og større eksperimenter har imidlertid utføres før du kan implementere analysen i klinisk rutine.
Det antas at spheroids og tredimensjonale cellekultur generelt reagere annerledes sammenlignet med konvensjonelle 2D-kultur når de utsettes for cellegifter eller stråling 28. Arkitekturen av spheroids fører til en stigning av oksygen og ernæring levering fra ytre overflaten til kjernen, og nyere studier har vist at narkotika-leveranser til forskjellige deler av tredimensjonale celle klyngen ikke er ensartet29. Videre synes celler i spheroid kultur å beholde visse genet uttrykk mønstre som er forbundet med resistens i dyr modeller 30. Vi foreslår at også såkalte stråling motstand, en funksjon som er koblet til hode og nakke kreft i mange pasienter, er et resultat av celle-celle samhandling og tydelig microenvironments fører til oksygentilførsel og metabolsk aktivitet. Dette fenomenet kan bli etterlignet i spheroids på grunn av en økt i vivo -funksjonalitet. Avslutningsvis kan bruk av primære celler og generering av spheroids tillate oss å bevare så mange som mulig kjennetegner i vivo tumor vekst i kombinasjon med en kostnadseffektiv analysen for å studere individuell terapi svar.
Det er sikkert begrensninger til tilnærming. Dato er det ukjent hvordan celler fra individuelle pasienter vil utføre i analysen blir utsatt for svulst behandling, og hvor prediktiv analysen er i sammenheng med senere terapi utfallet. Overdreven studier er nødvendig bare sammenligne den ytelse i vitro vs kliniske kurs. Bl nemlig to faktorer bidrar til denne usikkerheten: svulst heterogenitet og mangel på co kultur stromal og immunsystemet cellene. Svulst heterogenitet er et fenomen som ikke helt forstått og eksisterer mellom forskjellige sub områder av primært og mellom primære og metastatisk lokalisering12. Siden nyere studier, det er en tredje området der det er veldig tydelig og spesialiserte kreftceller kan finnes og råde i nisjer: blod og benmarg kan huse sirkulerende og spres tumor celler9,10. Mangel på andre celletyper som stromal celler og T-celler (som en representant for immunsystemet) i cellekultur er ikke begrenset til analysen, men en gyldig ulempe for de fleste i vitro analyser studere tumor terapi mottakelighet. I lys av nylige narkotika godkjenninger og pågående studier som påvirker T-celle respons, må senere eksperimenter for medisiner være gjennomført i en kombinasjon av ulike analyser og metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av en bevilgning av universitetet i München (FöFoLe prosjekt-nei: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
