Summary
Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.
Abstract
Opções atuais do tratamento para avançados e recorrente de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) Coloque a radiação e quimioterapia-radiação abordagens com ou sem cirurgia. Enquanto esquemas de quimioterapia baseados em platina, atualmente, representam o padrão ouro em termos de eficácia e são dadas na grande maioria dos casos, novos regimes de quimioterapia, ou seja, imunoterapia estão surgindo. No entanto, as taxas de resposta e mecanismos de resistência de terapia para qualquer regime de quimioterapia são difíceis de prever e permanecem insuficientemente compreendida. Grandes variações dos mecanismos de resistência a quimioterapia e a radiação são conhecidas até à data. Este estudo descreve o desenvolvimento de um ensaio padronizado, elevado-throughput em vitro para avaliar a resposta da linha celular HNSCC para diferentes regimes de terapia e espero que em células primárias de pacientes individuais como futura ferramenta para tumor personalizado terapia. O ensaio é projetado para ser integrado o algoritmo padrão de controle de qualidade para pacientes com HNSCC em nosso centro de atendimento terciário; no entanto, este será o tema de estudos futuros. Viabilidade técnica parece promissor para as células primárias de biópsias de tumor de pacientes reais. Amostras são então transferidas para o laboratório. Biópsias são mecanicamente separadas seguido por digestão enzimática. Então, as células são cultivadas em frascos de cultura de células de ultra baixa adesão que promovem a formação reprodutível, padronizada e espontânea dos conglomerados de células tridimensionais, em forma de esferoide. Esferoides então estão prontos para ser exposto a protocolos de quimioterapia-radiação e protocolos de imunoterapia conforme necessário. O tamanho de viabilidade e esferoide de final de célula são indicadores de susceptibilidade de terapia e, portanto, poderia elaborar-se em consideração no futuro para avaliar a resposta do provável terapia dos pacientes. Este modelo pode ser uma ferramenta valiosa, custo-eficiente para terapia personalizada para câncer de cabeça e pescoço.
Introduction
Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é o sexto mais comum de câncer em todo o mundo com uma incidência crescente de patogénese associada a infecção da mucosa papilomavírus humano (HPV), ao lado de uma maioria de casos causados por álcool e nicotina excessiva consumo de 1,2. Enquanto tumores menores e estágios pre-invasoras são geralmente bem tratáveis com excisão cirúrgica, geralmente combinado com dissecação de linfonodo cervical, o tratamento para estado avançado e recorrente HNSCC permanece desafiador devido à invasão de tumor agressivo com disseminação metastática e resistência à radiação e quimioterapia protocolos3,4,5,6,7,8. Estudos recentes sugerem uma alta variabilidade do fenótipo celular e caracterização sub circulantes e células tumorais disseminadas começou9,10. A crença anterior de um tumor sólido, uniforme massa teve que ser revisto à luz dos recentes estudos nos últimos anos11,12,13,14. As abordagens atuais para caracterização do tumor e identificação das principais mutações poderiam identificar vários genes que parecem estar associadas com resistência à terapia, mas permanecem uma abordagem de custo elevado. Além disso, conhecimento do genótipo não necessariamente permite uma previsão confiável do fenótipo e sua resposta de tratamento.
Tem havido alguns avanços na melhoria da sobrevivência global e livre de doença para doença estado avançado e recorrente. Nicotina - bem como carcinoma de vírus associado, opções atuais do tratamento além de cirurgia juntar radiação agressiva e esquemas de quimioterapia baseados em platina. Há implicações para as taxas de resposta diferente entre carcinoma de HPV-negativas e positiva; no entanto, isso ainda não conduzir a uma mudança em geral orientações de terapia. Resistência à radiação e a quimioterapia é um fenómeno frequente em todas as fases do tumor e existe para baseada em platina quimioterapia bem como quanto à terapia-alvo (Anti-EGFR; receptor de fator de crescimento epidérmico) e recentemente emergentes de inibição posto15. Quimioterapia e radioterapia ineficaz têm um custo elevado de morbidade paciente significativo em termos de disfagia, mucosite, boca seca e risco de diminuição da função renal ou cardíaca, entre outros. A decisão de um conceito geral de terapia para cada paciente individual prevendo antes da resposta terapêutica parece ser o objetivo crucial, impedindo os conceitos de tratamento desnecessário, efeitos colaterais e custos.
Procuramos estabelecer um modelo para testar a susceptibilidade de tratamento individual do paciente para o atual padrão quimioterapia radiação-que poderia ser integrada o algoritmo de tratamento oncológico regular e controle de qualidade de um ponto técnico permanente. A meta distante foi usar o modelo sem usar linhas de células fortemente alterado e envelhecido, como mal representam as células de tumor humano real sem sua variabilidade e a heterogeneidade como sabemos agora, enquanto o estabelecimento do protocolo foi feita em várias linhas de células. Para ser independente apenas a partir de linhagens celulares disponíveis comercialmente, recentemente com sucesso geramos uma linha de celular intermediário chamada "PiCa" de células HNSCC primárias de espécimes de tumor humano com marcadores celulares conservadas na suas superfície e limitadas de passagens 16. linha de celular essa PiCa deve servir como uma preparação para o desenvolvimento do modelo na estrada para depois mais tarde após testes com células cancerosas humanas frescas de biópsias de tumor. Tem sido demonstrado que as células em uma célula tridimensional culturas reagem de forma diferente e mais na vivo-como a administração de drogas de câncer do que aquelas crescendo em monocamadas17,18,19,20 ,21, devido principalmente à conservação de migratórias e propriedades de sub diferenciação de certas células subconjuntos22,23,24. Aqui, descrevemos o protocolo de um modelo tridimensional, baseado em esferoide de linhas de células intermediárias e maneiras as células primárias humanas carcinoma de células escamosas como integram e tal modelo em tratamento de câncer de cabeça e pescoço cirurgião e oncologista ( Figura 1).
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Protocol
Todos os estudos mostrados neste manuscrito, ou seja, a utilização de amostras de tumor humano, estão protegidos sob e em consentimento com decisões anteriores da Universidade de medicina de Mainz/Universidade da Comissão de ética médica de centro de Munique. Pacientes deram o consentimento informado, de acordo com as diretrizes legais nacionais concordando para uso científico de excesso de material biológico que foi obtido no decorrer de seu tratamento. Pesquisa foi realizada em conformidade com todas as orientações institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano.
1. tendo uma biópsia de Tumor de cabeça e Carcinoma de células escamosas Heck
- Executar geral (propofol e/ou sevoflurano, agente relaxante muscular) ou infiltração local (2% ultracaine, adrenalina) / (xilocaína) anestesia na sala de cirurgia ou Otorrinolaringologia cadeira exame de superfície. Visualize a massa tumoral em orais cavidade/faringe/laringe/outras partes do trato digestivo e respiratório superior com padrão instrumentos de funcionamento e, se necessário, sob o microscópio.
- Leve uma biópsia do tumor fresco da periferia da lesão cancerosa com instrumentos de corte ou sem corte. Evite o centro da lesão devido a necrose abundante nesta área. Colocar o tecido obtido para um recipiente esterilizado com solução isotônica de cloreto de sódio.
- Depois da biópsia, realizar hemostasia, conforme necessário, por exemplo., com um dispositivo de coagulação monopolar ou bipolar, além do uso de substâncias vasoconstritores.
- Trazer a biópsia do tumor que se destina a ser usado para experimentos de cultura celular diretamente para o trato de laboratório adjacente. Envie outras biópsias do tumor para o patologista, como de costume para descartar câncer.
- Certifique-se que um técnico de laboratório está pronto para processar a amostra diretamente.
2. processamento da amostra de Tumor
- Coloque o espécime de tumor sobre uma superfície apropriada e estéril e corte cuidadosamente com um bisturi estéril de uso único em pedaços o mínimo possível.
Atenção: Certifique-se que o status das doenças infecciosas transmitidas pelo sangue é bem documentado e o técnico está na atenção das instituições padrão protocolos para impedir a agulha vara ou lesão de corte com potencialmente material paciente de risco biológico e o protocolos a seguir depois de possíveis lesões. - Após a separação mecânica suficiente do tecido primário, coloque o tecido em um frasco contendo colagenase eu / II e incubar durante 1 h a 37 ° C. Através de um filtro de célula de Falcão µm 70 da peneira e lavar a suspensão com solução de sal balanceada de Hanks (HBSS).
-
Após a separação bem sucedida e posterior lavagem, colocar a suspensão contendo 1-2 × 106 células em frascos de cultura de célula uma T75 (75 cm2) crescer para subconfluência a 5% de CO2 e temperatura de 37 ° C. Esta etapa pode demorar até 10 dias.
- Use o meio de cultura especial queratinócito consistindo dos seguintes: 125 mL de Dulbecco modificada do meio eagles (DMEM), 250 mL do meio de queratinócitos complementado (médio complementado, consistindo de 500 mL do meio de SF queratinócito, 15 mg de pituitária bovina extrato (BPE), 2,5 mL de penicilina/estreptomicina 150 ng recombinante humano epiteliais fator de crescimento (EGF), 516 µ l de 300 mM CaCl2, mistura de estoque para ser preparado com antecedência), 125 mL de mistura de nutrientes F12, 10 mg de BPE (0,75 mL), 75 ng de EGF humano recombinante (2 µ l) , 3,75 mL de 200 mM L-alanil-L-Glutamin-dipeptídeo (tabela de materiais).
3. propagação das células em placas de cultura de célula ultra baixa adesão
- Confirme o crescimento de células de tumor sob um microscópio. Contar as células em cultura (primária ou cultura de células) e semente de 5.000 células do tumor primário ou 1.000-2.000 células de linhagem de células intermediárias / outra linha celular em 200-300 µ l de mídia (passo 3.2.) em uma placa de ultra baixa adesão com côncavo, rodada de fundos (96 poços).
-
Cultura de células em 5% CO2 a 37 ° C e em partes iguais DMEM e vias aéreas médias de células epiteliais (BEGM), 10% de soro fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio 1%, 1% não aminoácidos essenciais, 1% L-glutamina (etapa 2.3.). Se linhas celulares estão sendo usadas, a mídia com base em DMEM é suficiente.
- Execute alterações de mídia todos os dias. Preste atenção para não aspirar o spheroid com pipeta durante as mudanças de mídia. Cultura de esferoides até o nível de crescimento como descibed 3.3 é alcançado (aproximadamente 7-10 dias).
- Confirme a formação espontânea de esferoide sob o microscópio procurando por conglomerados de células tridimensionais, em forma de esferoide. Exclua os poços com irregular e/ou formação de esferoide múltiplas de maiores investigações.
Nota: Esferoides devem ser visíveis a olho nu, também, facilitar a transformação e as mudanças de mídia como descrito abaixo.
4. expor esferoides de terapia Multimodal Tumor padrão ou Experimental
- Escolha um regime de terapia desejada. Criar grupos de controle suficientemente grande que permitem comparações dos tratamentos de esferoides não tratadas ou esferoides recebendo apenas regimes de terapia parcial, por exemplo. radiação sozinha. O tamanho dos grupos de controle varia de acordo com o projeto do grupo experimental e não pode ser definido universalmente.
- Troca a mídia a mídia com aditivos, significado media com chemotherapeutics e/ou anticorpos monoclonais em concentrações desejadas. Adicione cisplatina nas concentrações de 2,5/5/10 µM ou 5-fluoruracil (5FU) em 30 µM.
Nota: Para experimentos de alta taxa de transferência ou grande grupo tamanhos/elevado número de grupos, pode-se usar um robô automatizado de pipetagem como estabelecemos ainda mais nas experiências. - Alternativamente, irradie as placas de cultura de células com esferoides em 2 Gy usando um recurso de radiação apropriado.
Atenção: Respeite os protocolos da instituição em matéria de prevenção da exposição de radiação nociva dos empregados. Trabalhar apenas com técnicos treinados e designados de acordo com as diretrizes de proteção de radiação. Se desejar, adicione chemotherapeutics conforme descrito em 4.2. Depois disso. - Incube as celulas por 24 h em condições de cultura descrito anteriormente (37 ° C, passo 3.2).
- Após a incubação, continue a cultura de pilha pelo menos 6 dias com alterações de mídia todos os dias.
5. avaliação do tamanho do Spheroid e extensão da proliferação celular para ensaio de leitura
- Medir o tamanho de esferoide em termos de área após documentação de foto digital no dia 6 (dia 10, dia 16) com um software gráfico (parâmetro 1).
- Após a centrifugação a 520 x g, durante 2,5 min da placa, remova o sobrenadante. Lave as células com quantidade suficiente de 1X PBS e centrifugar que a placa novamente conforme descrito, seguida de remoção do sobrenadante (PBS).
- Adicione 100 µ l de solução de desprendimento de células enzimático a cada frasco para permitir que os esferoides dissolver. Incubar a placa por 8 min a 37 ° C.
- Seleção para dissolver bem sucedida do spheroid sob o microscópio. Adicione 100 µ l de DMEM. Centrifugue a placa a 520 x g durante 2,5 min. remover o sobrenadante e suspender as células em 100 µ l de DMEM.
- Realize um ensaio de proliferação colorimétrico comercialmente disponível, em exemplo WST-8 ensaio em cada frasco de acordo com instruções25 as indicações do fabricante. Ler o ensaio em um leitor de ensaio (ELISA) enzima-lig da imunoabsorção (parâmetro 2).
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Representative Results
Fomos capazes de gerar reproducibly esferoides de suspensões de célula única, primeiro a partir de linhas de células diferentes, incluindo a linha de celular proprietária da PiCa, depois a partir de células de câncer humano primário derivado de biópsias de tumor fresco conforme descrito em Hagemann et al . 26. foram avaliados dois métodos estabelecidos para a geração de esferoide; os dois sendo o so-called enforcamento cair (HD) método e o método de ultra baixa adesão (ULA), o último sendo o mais eficaz e segura. Fomos capazes de destacar as vantagens do método ULA em relação ao HD, incluindo o crescimento mais rápido de esferoide, menos problemas com a placa de manipulação, consequente perda de esferoides com vibrações pesadas e mais reprodutíveis esferoide crescimento em termos de uniformidade ( Figura 2). A ocorrência de múltiplas esferoides por frasco era mais comum no método HD. Nós procuramos por uma caracterização mais distinta da morfologia esferoide. A Figura 3 mostra uma imunoquímica mancha para Ki67, um marcador de proliferação, de um esferoide de células de PiCa. Conforme descrito na literatura, esferoides consistem de um menos proliferando núcleo com uma camada exterior proliferando, imitando diferentes regiões da proliferação de HNSCC sólido em seres humanos. In vitro como in vivo, isso supostamente é causado por um gradiente de nutrientes e oxigênio fornecido pela mídia de cultura celular, causando uma diminuição da periferia para o centro do tumor.
Então tentamos mostrar que o ensaio é capaz de detectar variações no tamanho do esferoide após a incubação com quimioterápicos ou exposição a radiações ionizantes, aqui representando dois esquemas de tratamento padrão comum para HNSCC. Antes possivelmente integrar o ensaio em uma rotina de tratamento prévio, a validação da sensibilidade do ensaio seria um pré-requisito. Dois parâmetros estavam disponíveis como pontos de extremidade do ensaio: tamanho de esferoide (área; parâmetro 1 da etapa 5.1.) e proliferação (ver parâmetro 2 da etapa 5.4.), sendo um marcador substituto para viabilidade celular e potencial de crescimento após a terapia. Os resultados dos estudos de tratamento com quimioterápico comum e protocolos de quimioterapia-radiação são mostrados na Figura 4. Exposição e incubação dos esferoides com cisplatina ou 5FU levaram a uma redução significativa na velocidade de crescimento ao longo do tempo, em comparação com um grupo controle sem tratamento (p< 0,001). Radiação com 2Gy foi capaz de reduzir a velocidade de crescimento de forma significativa (p< 0,01). O ensaio de sobrevivência (WST-8) foi capaz de detectar um valor adicional, significativo de radiação-quimioterapia com cisplatina em comparação à radiação sozinha (p = 0,017), um anteriormente sem ser detectado diferença na avaliação do tamanho do esferoide. Isto reforça a sua importância para o ensaio como um todo, aumentando a sua sensibilidade para resposta de terapia de pequenas mudanças.
Figura 1: conceito de um modelo no caminho para a futura terapia personalizada. Pacientes com qualquer fundo de infecção por HPV na mucosa e/ou história de abuso de álcool e tabaco presente para nosso centro de atendimento terciário de referência para o diagnóstico de suspeito de câncer de cabeça e pescoço. Biópsias de áreas da mucosa suspeitas ou tumor macroscópico massas são tomadas sob anestesia para assegurar o diagnóstico. Além disso, tomamos a biópsias de tumor para gerar culturas de células em forma de esferoide tridimensional no laboratório. Após crescimento suficiente de esferoides baseado em células primárias, podemos expô-las a atual esquemas de tratamento padrão ou experimental para testar a resposta da terapia individual. Novas análises de variações genéticas ou moleculares podem ser adicionadas após a análise dos resultados da terapia. Terapia resultados em vitro pode ser desenhado em consideração para o processo de planejamento conceitos de terapia para o paciente. Esta figura é reproduzida a partir Hagemann, J. et al. 26, com permissão por autores e diário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: todas as linhas da célula poderiam gerar confiança esferoides; diferenças em tamanho e tempo de leitura são de acordo com a Figura 1. Em experimentos preliminares, as células primárias não formou esferoides pode ser reproduzidos em HD mas placas ULA (inferior esquerdo). Mais estudos devem ser realizadas para avaliar as características de crescimento de esferoide de células primárias. O número de células à direita é o número inicial de células, colocar no frasco para formar um esferoide. Esta figura é reproduzida a partir Hagemann, J. et al. 26, com permissão por autores e diário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ki67 imunoquímica coloração de uma fatia de esferoide (PiCa). Na periferia da cultura mostra muito maiores taxas de proliferação de células centrais, imitando a distribuição de nutrientes em tumores da mucosa sólidos que muitas vezes mostram núcleos necróticos. Esta figura é reproduzida a partir Hagemann, J. et al. 26, com permissão por autores e diário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: estudos de terapia. (A) PiCa as células eram cultivadas para gerar esferoides (n = 12 por grupo) nas placas ULA. As células foram estimuladas de acordo com o protocolo com qualquer PBS como controle, cisplatina em 5 µM ou 5FU em 30 µM. tamanhos dos esferoides, determinaram-se no dia 6, 10 e 16 de acordo com protocolos padrão. Tratamento de cisplatina e 5FU levou a uma diminuição significativa no tamanho (p-valores são dadas na esquerda inferior na seção (B) delineamento idênticos como em (A) (n = 12), mas com a radiação adicional de 2Gy. (C) o enredo mostra min máx. De acordo com o p-valores indicados na alínea C, radiação anterior com 2Gy levou a uma diminuição significativa no tamanho de esferoide no grupo controle, imitando a terapia de radiação e mostrando sensibilidade de radiação de células de PiCa. Radiação em combinação com cisplatina tratamento não conduziu a uma redução ainda mais significativa no tamanho do spheroid (p> 0,05). Enredo mostra min Max. (C) calculado p-valores da análise ANOVA de 2 vias de experimentos A e b. WST8 (D) ensaio realizado no dia 16, como uma alternativa para análise de planimétrico (área) dos esferoides. Análises de WST8 foram capazes de detectar uma diminuição significativa em células vivas após quimioterapia-radiação (radiação 2Gy e cisplatina) em comparação com cisplatina sozinha (p = 0,017), mostrando, portanto, a vantagem de combinar ambos planimétrico análise e WST8 ensaio colorimetric aquando da leitura do ensaio. Enredo mostra min máx. Esta figura é reproduzida a partir Hagemann, J. et al. 26, com permissão por autores e diário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Fomos capazes de estabelecer um protocolo para gerar esferoides reprodutíveis de suspensões celulares, para ambas as linhas de célula e, em experimentos preliminares, as células do tumor primário humano. Nós primeiro avaliados dois métodos anteriormente descritos e identificado o ULA-método, um método onde as placas de cultura com ultra baixa aderência são utilizadas, para ser a mais segura e confiável para a geração de esferoides tridimensionais uniformes. Combinando dois métodos distintos para a leitura do ensaio (tamanho/área e célula viabilidade), este ensaio multimodal é suficientemente sensível para identificar pequenas diferenças entre os grupos. Este é o primeiro passo para a prova da viabilidade técnica, para posterior integração do ensaio na via clínica no nosso centro de atendimento terciário. No futuro, poderia ser usado para (i) avaliar a susceptibilidade individual tumor de primeira-segunda-ou terceira-linha terapia protocolos comuns (reagentes de quimioterapia, radiação) e protocolos experimentais da terapia, (ii) mais caracterizam as células do tumor de amostras frescas e correlacionar padrões moleculares de superfície ou citoplasmáticos de resposta terapêutica. Esferoides de espécimes provenientes de localizações diferentes do tumor, por exemplo, primária e linfonodo metástase, são imagináveis.
Em todo o estabelecimento do protocolo e método, usamos a linha de celular conhecido diferente, alguns sendo bem estabelecida há décadas. A mera idade das linhas celulares gera a dúvida de sua conexão e comparabilidade de células de tumor humano real atual, supostamente tendo perdido vários marcadores moleculares Propriedades e hallmark. Resultados de experimentos em vitro eram difíceis de reproduzir em humanos ou em vivo ensaios27. Enfocamos, portanto, uma linha de celular recentemente gerada a partir de células de tumor primário humano em nossas instalações que é bem caracterizado16. Com esta linha de celular, PiCa, éramos capazes de realizar experimentos de tratamento em uma escala maior e confirmou as expectativas atuais da terapia. Isto suporta a teoria que células PiCa refletem o comportamento de tumor humano real melhor que outros, mais envelhecido e passadas linhas de célula que sofreu numerosas passagens. Células que podem ser submetidos a seleção não-fisiológica devido às condições de longo prazo em vitro podem influenciar sensibilidade quimio-radiação. Em experimentos recentes, confirmamos a viabilidade com as células primárias em relação à formação de esferoide confiável; no entanto, mais e maiores experiências tem que ser executada antes de ser capaz de implementar o ensaio na rotina clínica.
Presume-se que esferoides e cultura de células tridimensionais em geral reagem de forma diferente em relação ao convencional 2D-cultura quando expostos a quimioterápicos ou radiação 28. A arquitetura de esferoides leva a um gradiente de oxigênio e nutrição entrega da superfície externa ao núcleo, e estudos recentes têm mostrado que também entrega da droga para diferentes partes do cluster célula tridimensional não é uniforme,29. Além disso, as células em cultura de esferoide parecem preservar determinados testes padrões da expressão de genes que estão associados com a resistência de droga no animal modelos 30. Sugerimos que, também, resistência de radiação chamada, um recurso que tem sido associada ao câncer de cabeça e pescoço em inúmeros pacientes, é um resultado da interação célula-célula e microambiente distintos, levando a variações no suprimento de oxigênio e atividade metabólica. Este fenômeno pode ser imitado em esferoides devido a uma aumento na vivo de funcionalidade. Em conclusão, o uso de células primárias e a geração de esferoides poderiam permitir-nos preservar tantos como possíveis características na vivo o crescimento do tumor em combinação com um ensaio de custo-eficiente para estudar a resposta da terapia individual.
Certamente existem limitações para a abordagem. Até à data, é desconhecido como células de diferentes pacientes individuais irão realizar no ensaio sendo exposto ao tratamento do tumor, e preditiva como o ensaio é em termos de correlação com o resultado de terapia mais tarde. Excessivos estudos são necessários para simplesmente comparar o desempenho em vitro vs curso clínico. Entre outros, ou seja dois fatores contribuem para esta incerteza: tumor heterogeneidade e falta de co-cultura com células do estroma e imunes. Heterogeneidade de tumor é um fenômeno não é totalmente compreendido e existe entre diferentes sub sites das primárias, bem como entre localização primária e metastática12. Desde estudos recentes, há um terceiro site onde muito distintas e células tumorais especializado podem existir e prevalecer em nichos: sangue e medula óssea são capazes de abrigar circulando e células de tumor disseminada9,10. A falta de outros tipos de células, como células do estroma e as células T (como um representante para o sistema imunológico) na cultura de pilha não é limitada para o ensaio, mas uma desvantagem válida da maioria dos ensaios em vitro estudar suscetibilidade de terapia do tumor. À luz da recente aprovação de drogas e estudos em andamento que influenciam a resposta de células T, futuros experimentos para descoberta de drogas devem ser conduzidos em uma combinação de diferentes ensaios e métodos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado por uma bolsa da Universidade de Munique (FöFoLe projeto-n. º: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
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