Summary
Les auteurs décrivent l’évolution d’un modèle tridimensionnel, axée sur le sphéroïde le in vitro qui permet de tester la norme actuelle des régimes de thérapie expérimentale pour la tête et du cou carcinome épidermoïde sur des lignées cellulaires, visant à évaluer la thérapie sensibilité et résistance des cellules primaires de spécimens humains à l’avenir.
Abstract
Les options thérapeutiques actuelles pour avancé et récurrente de tête et cou carcinome spinocellulaire (HNSCC) joindre rayonnement et approches de la chimio-rayons avec ou sans chirurgie. Alors que les chimiothérapies à base de platine actuellement représentent l’étalon-or en termes d’efficacité et sont indiquées dans la grande majorité des cas, les nouveaux schémas de chimiothérapie, à savoir l’immunothérapie font leur apparition. Toutefois, le taux de réponse et les mécanismes de résistance de thérapie pour chaque régime de chimio sont difficiles à prédire et restent insuffisamment compris. Grandes variations de chimiothérapie et radiation des mécanismes de résistance sont connues à ce jour. Cette étude décrit le développement d’un test standardisé, haut débit le in vitro pour évaluer réponse de lignée de cellules HNSCC à divers régimes de thérapie et j’espère que sur les cellules primaires de chaque patient comme un futur outil pour tumeur personnalisé thérapie. Le dosage est conçu pour être intégrée à l’algorithme standard de contrôle de la qualité pour les patients HNSCC à notre centre de soins tertiaires ; Toutefois, ce sera objet d’études futures. Faisabilité technique semble prometteuse pour les cellules primaires de biopsies de tumeurs de patients réels. Les échantillons sont ensuite transférées dans le laboratoire. Les biopsies sont séparées mécaniquement suivie par digestion enzymatique. Cellules sont ensuite cultivées en flacons de culture cellulaire ultra faible adhérence qui favorisent la formation reproductible, standardisée et spontanée des conglomérats de cellule en trois dimensions, en forme d’ellipsoïde. Sphéroïdes sont alors prêts à être exposés à des protocoles de chimio-rayons et protocoles d’immunothérapie au besoin. La taille de sphéroïde et de viabilité des cellules final sont des indicateurs de sensibilité de la thérapie et pourraient donc être tirées en considération à l’avenir pour évaluer la réaction probable de la thérapie des patients. Ce modèle pourrait être un outil précieux et rentable vers une thérapie personnalisée du cancer de la tête et du cou.
Introduction
Tête et cou carcinome épidermoïde (HNSCC) est le cancer le sixième plus répandu dans le monde entier avec une augmentation de l’incidence de la pathogenèse associée à une infection muqueuse virus du papillome humain (VPH), à côté de la majorité des cas causés par l’alcool et la nicotine excessive consommation 1,2. Tandis que les plus petites tumeurs et étapes pré-invasives sont en général bien traitables avec excision chirurgicale, généralement combinée avec dissection des ganglions cervicaux, traitement pour HNSCC avancée et récurrente demeure difficile en raison de l’invasion de tumeur agressive avec métastases et la résistance aux radiations et la chimiothérapie protocoles3,4,5,6,7,8. Des études récentes suggèrent une forte variabilité du phénotype cellulaire et caractérisation secondaire de circulation et les cellules tumorales disséminées vient de commencer9,10. La croyance antérieure d’une tumeur solide et uniforme masse devait être révisée à la lumière des études récentes dans le passé ans11,12,13,14. Les approches actuelles pour la caractérisation de la tumeur et l’identification de mutations clées pourraient identifier plusieurs gènes qui semblent être associés à la résistance de la thérapie, mais reste une démarche coûteuse. En outre, connaissance du génotype ne permet pas nécessairement une prévision fiable de phénotype et sa réponse au traitement.
Il y a eu quelques progrès dans l’amélioration de survie globale et indemne de la maladie pour la maladie avancée et récurrente. Pour la nicotine ainsi que carcinome associées aux virus, les options thérapeutiques actuelles en dehors de la chirurgie joindre rayonnement agressif et les chimiothérapies à base de platine. Il y a eu des répercussions sur les taux de réponse différents entre le carcinome HPV-négatif et positif ; Toutefois, cela n’a pas encore conduire à un changement en général directives de traitement. Résistance à la radiation et chimiothérapie est un phénomène répandu dans toutes les étapes de la tumeur et existe pour la chimiothérapie à base de platine aussi bien en ce qui concerne la thérapie ciblée (Anti-EGFR ; récepteur du facteur de croissance épidermique) et récemment émergentes checkpoint inhibition15. Chimiothérapie et la radiothérapie inefficace viennent à un coût élevé de morbidité importante de patients en termes de dysphagie, mucite, sécheresse de la bouche et risque de diminution de la fonction rénale ou cardiaque, entre autres. Prévoir avant l’intervention thérapeutique la décision d’un concept de thérapie générale pour chaque patient semble être l’objectif essentiel, empêchant les concepts de traitement inutile, les effets secondaires et les coûts.
Nous avons cherché à établir un modèle pour tester la sensibilité de traitement de chaque patient vers actuel chimio-rayonnement standard qui pourrait être intégrée dans l’algorithme de traitement oncologique régulière et contrôle de la qualité d’un point technique permanent. Le but lointain était d’utiliser le modèle sans utiliser des lignées de cellules fortement altérée et vieilli, car ils représentent mal les cellules tumorales humaines réelles sans leur variabilité et hétérogénéité comme nous le savons maintenant, alors que la mise en place du protocole a été faite dans diverses lignées cellulaires. Pour être indépendant qu’à partir de lignées cellulaires disponibles dans le commerce, nous avons généré récemment avec succès une lignée de cellules intermédiaire appelée « PiCa » de cellules primaires de HNSCC d’après des échantillons de tumeur humaine avec les marqueurs cellulaires conservées sur les passages de sa surfaces et limitées 16. lignée cellulaire PiCa ce devrait servir comme une préparation pour le développement du modèle sur la route à puis après essais avec des cellules cancéreuses humaines frais de biopsies tumorales. Il a été démontré que les cellules en trois dimensions cell cultures réagissent différemment et plus en vivo-comme à l’administration de médicaments contre le cancer que celles qui poussent dans les monocouches17,18,19,20 ,21, principalement en raison de la conservation des migrateurs et différenciation sous propriétés de certaines cellules des sous-ensembles22,23,24. Ici, les auteurs décrivent le protocole d’un modèle en trois dimensions, axée sur le sphéroïde de lignées de cellules intermédiaires et moyens et cellules humaines primaires carcinome spinocellulaire comment intègrent ce modèle dans le traitement du cancer de la tête et du cou chirurgien et oncologue ( Figure 1).
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Protocol
Toutes les études sur ce manuscrit, à savoir l’utilisation des échantillons de tumeur humaine, sont protégés en vertu et en accord avec les décisions antérieures de la médecine de Mayence/Université du Comité d’Ethique Centre médicale de Munich. Les patients ont donné un consentement éclairé selon les directives juridiques nationales convenant à un usage scientifique des excès de matériau biologique qui a été obtenu dans le cadre de leur traitement. Recherche a été effectuée dans le respect de toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être de l’humanité.
1. prendre une biopsie de la tumeur de culasse et carcinome épidermoïde Heck
- Effectuer général (propofol et/ou sévoflurane, agent relaxant musculaire) ou infiltration locale (2 % ultracaine, adrénaline) / surface d’anesthésie (xylocaine) dans le fauteuil d’examen opératoire ou ORL. Visualiser la masse tumorale dans orale cavité/pharynx/larynx/autres parties des voies digestives et respiratoires supérieures à la norme instruments opérationnels et, le cas échéant, sous le microscope.
- Prendre une biopsie de la tumeur fraîches de la périphérie de la lésion cancéreuse avec des instruments contondants ou coupes. Éviter le centre de la lésion due à une nécrose abondante dans ce domaine. Mettre le tissu obtenu dans un récipient stérile avec une solution isotonique de chlorure de sodium.
- Après la biopsie, effectuer l’hémostase au besoin, par exemple., avec un dispositif de coagulation bipolaire ou monopolaire, en plus de l’utilisation de substances vasoconstricteurs.
- Apporter la biopsie de la tumeur destinée à être utilisés pour des expériences de culture cellulaire directement sur les voies adjacentes de laboratoire. Envoyer autres biopsies de tumeurs à l’anatomopathologiste comme d’habitude pour éliminer le cancer.
- Assurez-vous que le technicien de laboratoire est prêt à traiter l’échantillon directement.
2. traitement de l’échantillon de la tumeur
- Placer l’échantillon de la tumeur sur une surface appropriée et stérile et coupez-les soigneusement au scalpel stérile à usage unique en morceaux aussi peu que possible.
ATTENTION : Assurez-vous que le statut des maladies infectieuses et transmissibles par le sang est bien documenté et le technicien est l’attention des institutions standards protocoles afin d’empêcher l’aiguille bâton ou coupure avec le matériel du patient de biohazard potentiellement et le protocoles à suivre après une lésion possible. - Après la séparation mécanique suffisante du tissu principal, mettre le tissu dans un flacon contenant la collagénase I / II et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Tamiser à travers un tamis de cellule 70 µm falcon et laver la suspension avec Hanks Balanced Salt solution (HBSS).
-
Après séparation réussie et lavage ultérieur, placer la suspension contenant 1 à 2 × 106 cellules dans un flacons de culture cellulaire (75 cm2) T75, augmenter à sub-confluence à 5 % de CO2 et de la température de 37 ° C. Cette étape peut prendre jusqu'à 10 jours.
- Utiliser le milieu de culture de kératinocytes spécial composé des éléments suivants : 125 mL de Dulbecco modifiée moyen eagles (DMEM), 250 mL de kératinocytes complétée milieu (milieu complétée, composé de 500 mL de milieu de kératinocytes de SF, 15 mg de pituitaire bovine extrait (BPE), 2,5 mL de pénicilline/streptomycine, 150 ng recombinant épithéliales facteur de croissance humain (EGF), 516 µL de 300 mM CaCl2, stock mix à être préparé à l’avance), 125 mL du mélange de nutriments F12, 10 mg de BPE (0,75 mL), 75 ng recombinante humaine EGF (2 µL) , 3,75 mL 200 mm L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (Table des matières).
3. ensemencer les cellules en plaques de Culture cellulaire ultra faible adhérence
- Confirmer la croissance des cellules tumorales sous un microscope. Compter les cellules en culture (primaire ou culture cellulaire) et des graines 5 000 tumeur primaire ou 1 000-2 000 cellules de la lignée cellulaire intermédiaire / autre lignée cellulaire dans 200-300 µL de médias (étape 3.2.) dans une plaque ultra faible adhérence avec concave, rond fond (96 puits).
-
Les cellules à 5 % de CO2 à 37 ° C et en parts égales DMEM et des voies aériennes moyenne de cellules épithéliales (BEGM), sérum de veau fœtal 10 %, 1 % pénicilline/streptomycine, pyruvate de sodium 1 %, 1 % acides aminés non essentiels de la culture 1 % L-glutamine (étape 2.3.). Si les lignées de cellules sont utilisées, les médias sur la base de DMEM suffit.
- Effectuer des changements de médias tous les deux jours. Attention ne pas à aspirer l’ellipsoïde avec la pipette lors des changements de médias. La culture des sphéroïdes jusqu’au niveau de la croissance que décrites en 3.3 est atteinte (environ 7-10 jours).
- Confirmer la formation spontanée de sphéroïde au microscope en recherchant les conglomérats de la cellule en trois dimensions, en forme d’ellipsoïde. Exclure les puits avec irrégulière et/ou formation sphéroïde multiples de complément d’enquête.
NOTE : Sphéroïdes devraient être visibles à le œil nu, aussi, facilitant la poursuite de la procédure et le milieu change comme indiqué ci-dessous.
4. exposer les sphéroïdes à la thérapie de Multimodal tumeurs expérimentales ou Standard
- Choisir un régime de thérapie souhaitée. La conception des groupes de contrôle suffisamment grand qui permettent des comparaisons de traitements non traitées sphéroïdes ou sphéroïdes recevant seulement un traitement partiel de la thérapie, par exemple. rayonnement seul. La taille des groupes de contrôle dépend de la conception du groupe expérimental et ne se définit pas universellement.
- Échanger les médias aux médias avec des additifs, médias de sens avec chimiothérapie et/ou anticorps monoclonaux à la concentration désirée. Ajouter cisplatine aux concentrations de 2,5/5/10 µM ou 5-fluoruracil (5FU) à 30 µM.
Remarque : Pour des expériences de haut débit ou grand groupe tailles/grand nombre de groupes, on peut utiliser un robot de pipetage automatisé que nous mettons en place plus loin dans les expériences. - Vous pouvez également rayonner les plaques de culture cellulaire avec sphéroïdes à 2 Gy à l’aide d’une installation convenable de rayonnement.
ATTENTION : Le Respect des protocoles concernant la prévention de l’exposition aux radiations nocives des employés de l’institution. Travailler uniquement avec des techniciens désignés et formés selon les directives de protection des radiations. Si désiré, ajouter des agents chimiothérapeutiques comme décrit sous 4.2. par la suite. - Incuber les cellules pendant 24 h dans des conditions de culture décrites précédemment (37 ° C, point 3.2).
- Après l’incubation, continuer la culture cellulaire pendant au moins 6 jours avec milieu change tous les jours.
5. évaluation de sphéroïde taille et l’ampleur de la prolifération cellulaire pour test de lecture
- Mesurer la taille sphéroïde en termes de superficie après documentation photo numérique au jour 6 (jour 10, jour 16) avec un logiciel graphique (paramètre 1).
- Après centrifugation à 520 g pendant 2,5 min de la plaque, retirez le surnageant. Laver les cellules avec une quantité suffisante de 1 x PBS et centrifuger la plaque encore une fois comme décrit, puis en enlevant le surnageant (PBS).
- Ajouter 100 µL de solution de détachement cellulaire enzymatique à chaque flacon pour permettre les sphéroïdes à dissoudre. Incuber les plaques pendant 8 min à 37 ° C.
- Cocher pour dissoudre les succès de l’ellipsoïde sous le microscope. Ajouter 100 µL de DMEM. Centrifuger la plaque à 520 g pendant 2,5 min. Retirer le surnageant et suspendre les cellules dans 100 µL de DMEM.
- Effectuer un test de prolifération colorimétriques disponibles dans le commerce, en dosage WST-8 exemple sur chaque flacon selon instructions25 les directives du fabricant. Lire le test dans un lecteur de test ELISA immuno-enzymatique (paramètre 2).
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Representative Results
Nous avons pu de façon reproductible générer sphéroïdes de suspensions de cellules simples, tout d’abord de lignées cellulaires différentes dont la lignée cellulaire PiCa propriétaire, plus tard à partir de cellules cancéreuses humaines primaires provenant de biopsies tumorales frais tel que décrit dans Hagemann et al. . 26. nous avons évalué deux méthodes établies pour la génération de sphéroïde ; les deux étant la pendaison de ce que l'on appelle drop méthode (HD) et la méthode ultra faible adhérence (ULA), ce dernier étant l’un plus efficace et plus sécuritaire. Nous avons pu mettre en évidence les avantages de la méthode ULA comparé à la HD, y compris une croissance plus rapide sphéroïde, moins de problèmes avec le plat de manutention, perte des sphéroïdes avec fortes vibrations et plus reproductible sphéroïde de croissance en termes d’uniformité ( Figure 2). La présence de plusieurs sphéroïdes par flacon était plus fréquente dans la méthode HD. Nous avons vérifié pour une caractérisation plus distincte de la morphologie de l’ellipsoïde. La figure 3 montre un immunochimie coloration de Ki67, un marqueur de prolifération, d’un sphéroïde de cellules de PiCa. Comme décrit dans la littérature, sphéroïdes consistent en un moins proliférant core avec une couche extérieure proliférant, imitant les différentes régions de la prolifération des HNSCC solide chez les humains. In vitro comme in vivo, ceci est censé être causé par un gradient de nutriments et d’oxygène fourni par les milieux de culture cellulaire, provoquant une diminution de la périphérie vers le centre de la tumeur.
Puis, nous avons essayé de montrer que le test est capable de détecter des variations dans la taille de sphéroïde après l’incubation avec les médicaments chimiothérapeutiques ou l’exposition aux rayonnements ionisants, ici représentant deux schémas de traitement standard courant pour HNSCC. Avant d’intégrer éventuellement l’essai dans une routine avant le traitement, la validation de la sensibilité du test serait une condition préalable. Deux paramètres sont disponibles comme points de repère de l’essai : taille sphéroïde (zone ; paramètre 1 de l’étape 5.1.) et la prolifération (voir paramètre 2 de l’étape 5.4.), étant un marqueur de substitution pour le potentiel de croissance et de viabilité cellulaire après thérapie. Les résultats des études traitement chimiothérapeutique commun et des protocoles de chimio-rayons sont indiquées à la Figure 4. Exposition et incubation des sphéroïdes par le cisplatine ou 5FU ont conduit à une réduction significative de la vitesse de croissance au fil du temps par rapport à un groupe témoin (p< 0,001). Rayonnement de 2Gy était en mesure de réduire la vitesse de croissance de manière significative (p< 0,01). L’analyse de survie (WST-8) était capable de détecter une valeur supplémentaire, significative de chimio-rayons avec cisplatine par rapport au rayonnement seul (p = 0,017), un précédemment sans être détecté de différence dans l’évaluation de la taille de l’ellipsoïde. Ceci souligne son importance pour l’analyse dans son ensemble, en augmentant sa sensibilité pour la réponse de la thérapie de petits changements.
Figure 1 : Concept d’un modèle sur le chemin de futur thérapie personnalisée. Patients atteints soit d’infection à VPH muqueuse et/ou histoire d’abus de tabac et d’alcool présent dans notre centre de soins tertiaires référence pour le diagnostic de cancer de la tête et du cou. Les biopsies des zones muqueuses suspectes ou masses tumorales macroscopiques sont prises sous anesthésie pour sécuriser le diagnostic. En outre, nous prenons des biopsies de tumeurs pour générer des cultures de cellules de forme sphéroïde tridimensionnelle en laboratoire. Lors de la croissance suffisante de cellules primaires sphéroïdes basés, nous les exposer aux courants thérapeutiques standard ou expérimentales pour tester la réponse de la thérapie individuelle. De nouvelles analyses des variations génétiques ou moléculaires peuvent être ajoutés après analyse des résultats du traitement. Traitement des résultats in vitro peut être tirée en considération pour le processus de planification des concepts de traitement pour le patient. Ce chiffre est tiré à Hagemann, J. et al. 26, avec l’autorisation accordée par les auteurs et le journal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : toutes les lignées cellulaires pourraient générer des sphéroïdes fiables ; les différences dans la taille et le temps d’affichage sont conformes à la Figure 1. Dans des expériences préliminaires, les cellules primaires ne faisaient pas reproductibles sphéroïdes en HD mais plaques ULA (en bas à gauche). D’autres études doivent être entreprises pour évaluer les caractéristiques de croissance de sphéroïde de cellules primaires. Le nombre de cellules sur la droite est le nombre initial de cellules dans le flacon pour former un sphéroïde. Ce chiffre est tiré à Hagemann, J. et al. 26, avec l’autorisation accordée par les auteurs et le journal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Ki67 immunochimie coloration d’une tranche de sphéroïde (PiCa). La périphérie de la culture montre des taux de prolifération beaucoup plus élevés que les cellules centrales, imitant la distribution des éléments nutritifs dans des tumeurs solides muqueuses qui présentent souvent des carottes nécrotiques. Ce chiffre est tiré à Hagemann, J. et al. 26, avec l’autorisation accordée par les auteurs et le journal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : études thérapie. (A) les cellules PiCa sont cultivés pour produire des sphéroïdes (n = 12 par groupe) dans les plaques de ULA. Les cellules sont stimulées selon le protocole avec deux PBS comme contrôle, cisplatine à 5 µM ou 5FU à 30 µM. tailles des sphéroïdes ont été déterminé au jour 6, 10 et 16 conformément aux protocoles standards. Cisplatine et 5FU traitement a conduit à une diminution significative de la taille (p-valeurs sont indiquées en bas à gauche dans la section expérimental identique comme dans (A) à (B) (n = 12), mais avec un rayonnement additionnel de 2Gy. (C) la courbe montre min au maximum. Selon le p-valeurs figurant au point C, rayonnement précédente avec 2Gy a conduit à une diminution significative de la taille de sphéroïde dans le groupe témoin, imitant une radiothérapie et montrant la sensibilité de rayonnement des cellules de PiCa. Rayonnement en association avec le cisplatine traitement n’a pas conduit à une diminution plue importante taille de l’ellipsoïde (p> 0,05). Graphique montre min max. (C) calculé p-valeurs d’analyse ANOVA 2 voies de dosage d’expériences A et b. WST8 (D) effectuée sur le 16e jour comme une alternative pour l’Analyse planimétrique (quartier) des sphéroïdes. WST8 analyses ont pu déceler une baisse significative dans les cellules vivantes après chimio-rayonnement (rayonnement 2Gy et cisplatine) par rapport au cisplatine seul (p = 0,017), montrant ainsi l’avantage de combiner les analyses planimétriques et WST8 Dosage colorimétrique au moment de la lecture de l’essai. Graphique montre min au maximum. Ce chiffre est tiré à Hagemann, J. et al. 26, avec l’autorisation accordée par les auteurs et le journal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons été en mesure d’établir un protocole pour générer des sphéroïdes reproductibles de suspensions cellulaires, pour les deux lignées cellulaires et, dans des expériences préliminaires, les cellules tumorales humaines primaires. Tout d’abord, nous avons évalué deux méthodes précédemment décrites et identifiées la ULA-méthode, une méthode où sont utilisées des plaques de culture avec ultra basse adhérence, pour être la plus sûre et plus fiable pour la génération des sphéroïdes tridimensionnelles uniformes. En combinant deux méthodes distinctes pour la lecture de test (viabilité taille/zone et de la cellule), cette analyse multimodale est suffisamment sensible pour identifier les petites différences entre les groupes. Il s’agit de la première étape vers la preuve de la faisabilité technique pour une intégration ultérieure du dosage dans le cheminement clinique à notre centre de soins tertiaires. À l’avenir, il pourrait être utilisé (i) évaluer la vulnérabilité de chaque tumeur au premier ou second-/ troisième ligne thérapie des protocoles communs (chimio-réactifs, radiation) et protocoles de thérapie expérimentale, (ii) également caractérisent les cellules tumorales de spécimens frais et établir une corrélation entre les profils moléculaires de surface ou cytoplasmiques à la réponse de la thérapie. Sphéroïdes de spécimens provenant de localisations tumorales différentes, par exemple, du primaire et métastases aux ganglions, sont imaginables.
Tout au long de la mise en place du protocole et de méthode, nous avons utilisé les lignées cellulaires connus, certains étant bien établie depuis des décennies. L’âge simple des lignées cellulaires soulève le doute de leur connexion et de la comparabilité de cellules tumorales humaines réelles actuelles, soi-disant ayant perdu plusieurs propriétés et marque les marqueurs moléculaires. Les résultats des expériences de in vitro étaient difficiles à reproduire en homme ou en vivo essais27. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur une lignée cellulaire récemment générée à partir des cellules de tumeur primaire humain dans notre usine qui est bien caractérisé16. Avec cette lignée cellulaire PiCa, nous étions en mesure de mener des expériences de traitement à grande échelle et a confirmé les attentes actuelles de la thérapie. Ces résultats appuient la théorie que les cellules de PiCa reflètent tumorales humaines réelles comportement mieux que les autres, plus âgés et les subcultures lignées de cellules qui ont subi de nombreux passages. Les cellules qui peuvent subir une sélection non physiologique due in vitro les conditions à long terme pourraient biaiser les sensibilité chimio-rayons. Dans des expériences récentes, nous avons confirmé la faisabilité avec les cellules primaires en ce qui concerne la formation sphéroïde fiable ; Cependant, des expériences nouvelles et plus grandes doivent être effectuées avant d’être en mesure de mettre en œuvre l’analyse en routine clinique.
On présume que les sphéroïdes et culture cellulaire tridimensionnelle en général réagissent différemment par rapport aux classique 2D-culture lorsqu’ils sont exposés aux drogues chimiothérapeutiques ou rayonnement 28. L’architecture des sphéroïdes mène à un gradient de livraison d’oxygène et la nutrition de surface de base, et des études récentes ont montré qu’aussi de médicaments aux différentes parties de l’amas de cellules en trois dimensions n’est pas uniforme29. En outre, les cellules en culture de sphéroïde semblent préserver certains profils d’expression génique qui sont associés à la résistance aux médicaments dans les animaux modèles 30. Nous suggérons que, également, résistance de rayonnement que l'on appelle, une fonctionnalité qui a été liée au cancer de la tête et du cou chez les nombreux patients, est le résultat de l’interaction cellule-cellule et conduisant à des variations de l’alimentation en oxygène et l’activité métabolique des micro-environnements distinctes. Ce phénomène pourrait être imité en sphéroïdes grâce à une fonctionnalité accrue en vivo . En conclusion, l’utilisation de cellules primaires et la génération des sphéroïdes nous permettrait de préserver autant que possibles caractéristiques de la croissance tumorale in vivo en combinaison avec une analyse coût-efficacité pour étudier la réponse de la thérapie individuelle.
Il existe certainement des limites de l’approche. A ce jour, on ne sait pas comment les cellules de patients individuels différents seront produira dans le dosage étant exposé à un traitement de la tumeur, et comment prédictive de l’essai est en corrélation avec les résultats de traitement plus tard. Les études excessives sont nécessaires pour simplement comparer la performance in vitro vs évolution clinique. Entre autres, à savoir deux facteurs contribuent à cette incertitude : l’hétérogénéité tumorale et l’absence de co-culture avec des cellules stromales et immunitaires. L’hétérogénéité tumorale est un phénomène pas entièrement compris et il existe entre les différents sous-sites du primaire, ainsi qu’entre la localisation primaires et métastatiques12. Depuis les études récentes, il y a un troisième site où très distincts et cellules tumorales spécialisés peuvent exister et prévalent dans des niches : sang et la moelle osseuse sont en mesure de loger en circulation et des cellules de tumeur disséminée9,10. L’absence d’autres types de cellules comme les cellules du stroma et des lymphocytes T (à titre de représentant pour le système immunitaire) en culture cellulaire n’est pas limité à l’essai, mais un inconvénient valide la plupart in vitro tests étudier la susceptibilité de thérapie tumorale. À la lumière de la récente approbation des médicaments et des études en cours qui influencent la réponse des lymphocytes, des expériences futures pour la découverte de médicaments doivent être menés dans une combinaison de différents dosages et methodes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par une subvention de l’Université de Munich (projet n° FöFoLe : 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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