एकल-सेल संकल्प प्रतिदीप्ति लार्वा मस्तिष्क संस्कृति में Drosophila Circadian घड़ियों की लाइव इमेजिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए लंबी अवधि के प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग के साथ circadian आणविक लय की निगरानी करने के लिए अनुकूलित पूर्व vivo Drosophila लार्वा मस्तिष्क संस्कृति स्थापित करने के लिए है । औषधीय परख करने के लिए इस विधि के आवेदन भी चर्चा की है ।
Abstract
circadian पेसमेकर सर्किट इस तरह के दिन/रात चक्र के रूप में पर्यावरण cues के साथ समंवित लयबद्ध व्यवहार और शारीरिक outputs के उद्घोष । प्रत्येक पेसमेकर के भीतर आणविक घड़ी ंयूरॉन जीन अभिव्यक्ति है, जो लयबद्ध ंयूरॉन आबाद सर्किट के संचालन के लिए आवश्यक कार्यों में circadian लय उत्पंन करता है । पेसमेकर न्यूरॉन्स के विभिन्न उपवर्गों में व्यक्तिगत आणविक oscillators के गुणों की जांच और न्यूरॉन सिग्नलिंग पैदावार circadian पेसमेकर सर्किट की एक बेहतर समझ के साथ उनकी बातचीत. यहां, हम एक समय चूक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म दृष्टिकोण को संस्कृतिपूर्ण Drosophila लार्वा मस्तिष्क की घड़ी ंयूरॉंस में आणविक घड़ी पर नजर रखने के लिए विकसित वर्तमान । इस विधि एकल सेल संकल्प पर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट circadian पत्रकारों की लय की बहु दिन की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । इस सेटअप औषधीय जोड़तोड़ के साथ संयुक्त किया जा सकता है बारीकी से विभिंन यौगिकों के लिए आणविक घड़ी की वास्तविक समय प्रतिक्रिया का विश्लेषण । circadian लय से परे, शक्तिशाली Drosophila आनुवंशिक तकनीक के साथ संयोजन में इस बहुउद्देशीय विधि लाइव मस्तिष्क ऊतक में विविध न्यूरॉन या आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है.
Introduction
Circadian घड़ियां जीवों को पृथ्वी के 24 घंटे के रोटेशन द्वारा उत्पन्न आवधिक पर्यावरणीय परिवर्तनों के अनुकूल बनाने में मदद करती हैं । इंटरलॉकिंग transcriptional-शोधों प्रतिक्रिया छोरों सामांयतः प्रजातियों के पार circadian घड़ियों की आणविक मशीनरी आबाद1। घड़ी युक्त न्यूरॉन्स से बना circadian पेसमेकर सर्किट दैनिक शारीरिक की एक बहुतायत की लय का उद्घोष करने के लिए, इस तरह के प्रकाश/अंधेरे (एलडी) और तापमान चक्र के रूप में पर्यावरण cues, द्वारा प्रेषित समय के दिन की जानकारी को एकीकृत करता है और व्यवहार प्रक्रियाओं2,3। न्यूरॉन इनपुट और outputs के साथ आणविक लय का समन्वय circadian सर्किट के संचालन के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है, लेकिन केवल आंशिक रूप से समझा रहता है.
Drosophilaमें, आणविक घड़ी के मूल में, घड़ी/चक्र (CLK/CYC) heterodimer की प्रतिलिपि को सक्रिय करता है अवधि (प्रति) और कालातीत (टिम) । प्रति और टिम एक जटिल फार्म और नाभिक, जहां वे CLK/CYC और फलस्वरूप अपने प्रतिलेखन के transcriptional गतिविधि को बाधित प्रवेश । पोस्ट-transcriptional और बाद के शोधों के नियमों के अनुसार CLK/CYC-मध्यस्थता प्रतिलेखन और दमन के बीच देरी के कारण प्रति/टिम, लगभग 24-एच आणविक दोलनों की पीढ़ी को सुनिश्चित करना1,3,4 . इन आणविक घड़ियों युक्त के बारे में १५० न्यूरॉन्स एक सर्किट फार्म वयस्क के circadian व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए5मक्खियों. एक बहुत सरल अभी तक पूरी तरह कार्यात्मक circadian सर्किट घड़ी ंयूरॉंस के 3 समूहों से मिलकर-5 ventral पार्श्व ंयूरॉंस (LNvs; 4 pdf-पॉजिटिव LNvs और एक पीडीएफ-नेगेटिव LNv, नीचे देखें), 2 पृष्ठीय न्यूरॉन 1s (DN1s) और 2 पृष्ठीय न्यूरॉन 2s (DN2s)-लार्वा में मौजूद है मस्6,7.
सरल लार्वा circadian सर्किट एक उत्कृष्ट मॉडल के लिए अंतर के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन संचार और आणविक घड़ी प्रदान करता है । TDT, जो प्रति प्रोटीन और उसके सेलुलर स्थान के स्तर की नकल हमारे नव विकसित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का प्रयोग, हम लार्वा circadian सर्किट में अलग घड़ी ंयूरॉन उपसमूहों में आणविक घड़ी की गतिशीलता विशेषताएं की मांग की 8. इसके अलावा, neuropeptide वर्णक-dispersing फैक्टर (पीडीएफ) की महत्वपूर्ण भूमिका जानने के लिए ंयूरॉन स्तर पर circadian लय को विनियमित करने में 4 LNvs द्वारा उत्पादित9,10,11, हम प्रत्यक्ष की जांच करना चाहता था आणविक घड़ियों पर पीडीएफ का प्रभाव । इस अंत करने के लिए, हम समय-चूक फोकल माइक्रोस्कोपी से कई दिनों से अधिक लार्वा मस्तिष्क explant में circadian जीन अभिव्यक्ति लय पर नजर रखने के लिए एक विधि विकसित की है । प्रोटोकॉल भी औषधीय परख के लिए अनुकूलित करने के लिए प्रति-TDT के स्तर पर पीडीएफ या अंय यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण किया गया । इस प्रकार, अनुकूलन मस्तिष्क explant संस्कृति दवा आवेदन करने के लिए सुलभ बनाने के होते हैं, एक छोटी अवधि के लिए लौकिक संकल्प और इमेजिंग बढ़ रही है ।
विभिंन विकासात्मक चरणों के Drosophila दिमाग की पूर्व वीवो संस्कृति पहले से स्थापित किया गया है12,13,14,15,16,17 ,18. जबकि इन प्रोटोकॉल इमेजिंग विभिंन जैविक घटना के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनमें से कुछ एकल सेल संकल्प पर इमेजिंग के साथ संगत नहीं कर रहे है या अधिक से अधिक कई घंटे के लिए संस्कृति का समर्थन नहीं करते । वैकल्पिक विधियों में circadian न्यूरॉन्स की दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग करने के लिए Drosophila में आणविक लय के bioluminescence इमेजिंग19,20,21 और प्रतिदीप्ति इमेजिंग शामिल प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के साथ कैल्शियम सूचक22,23. हालांकि bioluminescence इमेजिंग उच्च लौकिक संकल्प प्राप्त कर सकते है और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी vivo इमेजिंग में के लिए अनुकूलनीय जा सकता है, वे स्थानिक संकल्प पर सीमित है और विशेष माइक्रोस्कोप सिस्टम की आवश्यकता है ।
विधि यहां वर्णित एक से अधिक दिनों में एक सेल संकल्प पर पूरे मस्तिष्क संस्कृति में फ्लोरोसेंट संकेतों कल्पना सिलवाया है । इस सतही और बहुमुखी विधि संस्कृति वयस्क मक्खी दिमाग और औषधीय प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए Drosophila तंत्रिका में कई विभिंन समस्याओं का अध्ययन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम लंबी अवधि के प्रतिदीप्ति समय के लिए विधि वर्णित है, संस्कृति लार्वा दिमाग की चूक माइक्रोस्कोपी । इस प्रकार के प्रयोगों की सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है, जैसे संस्कृति के स्वास्थ्य, मस्तिष्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी सदस्यता और समर्थन के लिए इस विधि के विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान माइकल Rosbash धंयवाद । यह काम JST सफ़ाई प्रोग्राम, स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (31003A_149893 और 31003A_169548), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-StG-३१११९४), नोवार्टिस फाउंडेशन फॉर मेडिकल-बायोमेडिकल रिसर्च (13A39) और जिनेवा विश्वविद्यालय द्वारा वित्तपोषित किया गया था .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 – Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O’Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
