Summary
Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.
Abstract
Le circuit de pacemaker circadien orchestre rythmiques sorties comportementales et physiologiques, en coordination avec les signaux environnementaux, tels que les cycles jour/nuit. L’horloge moléculaire au sein de chaque neurone stimulateur génère les rythmes circadiens dans l’expression des gènes, qui sous-tendent les fonctions neuronales rythmiques essentielles au fonctionnement du circuit. Étude des propriétés des oscillateurs moléculaires individuelles dans les différentes sous-classes de neurones pacemaker et leur interaction avec la signalisation neuronale permet de mieux comprendre le circuit de pacemaker circadien. Ici, nous présentons une approche de Time-lapse microscopie fluorescente mis au point pour surveiller l’horloge moléculaire dans les neurones d’horloge de cultivées cerveau larve de drosophile . Cette méthode permet l’enregistrement de plusieurs jour des rythmes de reporters circadiennes fluorescents génétiquement encodées à cellule unique résolution. Cette configuration peut être associée à des manipulations pharmacologiques pour analyser attentivement la réponse en temps réel de l’horloge moléculaire de composés. Au-delà des rythmes circadiens, cette méthode polyvalente en combinaison avec les techniques génétiques puissantes Drosophila offre la possibilité d’étudier différents processus neurones ou moléculaires dans le tissu cérébral direct.
Introduction
Horloges circadiennes aident les organismes à s’adapter aux changements environnementaux périodiques générées par la rotation de 24h de la terre. Les boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel contrefil communément sous-tendent la machinerie moléculaire des horloges circadiennes ensemble espèce1. Le circuit de pacemaker circadien composé horloge contenant des neurones intègre time-of-day information véhiculée par les signaux environnementaux, tels que la lumière/obscurité (LD) et les cycles de température, d’orchestrer les rythmes d’une pléthore de quotidien physiologique et les processus comportementaux2,3. La coordination des rythmes moléculaires avec neuronales entrées et sorties est cruciale pour le fonctionnement du circuit circadien, mais reste que partiellement compris.
Chez la drosophile, au cœur de l’horloge moléculaire, l’hétérodimère/CYCLE d’horloge (CLK/CYC) active la transcription de la période (par) et intemporels (tim). PER et TIM forment un complexe et entrer dans le noyau, où ils inhibent l’activité transcriptionnelle de CLK/CYC et, par conséquent, leur propre transcription. Règlement post-transcriptionnelle et post-traductionnelles entraînent des retards entre CLK/CYC-mediated transcription et de la répression par p. / TIM, assurer la génération de circa oscillations moléculaires 24 h1,3,4 . Environ 150 neurones contenant ces horloges moléculaires forme un circuit de contrôle circadien comportement d’adulte vole5. Un beaucoup plus simple et entièrement fonctionnelles circadiens circuit composé de 3 groupes de neurones de l’horloge - 5 neurones latérale ventrale (LNvs ; 4 LNvs PDF-positif et un négatif PDF LNv, voir ci-dessous), 2 dorsales neurone 1 s (DN1s) et 2 dorsales neurone 2 s (DN2s) - est présent dans les larves cerveau6,7.
Le circuit circadien larvaire simple offre un excellent modèle pour étudier les interactions entre la communication inter neuronale et l’horloge moléculaire. À l’aide de notre reporter fluorescent nouvellement mis au point par-TDT, qui imite les niveaux de protéine et sa localisation subcellulaire, nous avons cherché à caractériser la dynamique de la mécanique moléculaire en sous-groupes de neurone horloge différentes dans le circuit circadien larvaire 8. en outre, connaissant le rôle essentiel du facteur de dispersion de pigment neuropeptide (PDF) produit par 4 LNvs dans la régulation des rythmes circadiens au niveau neuronal9,10,11, nous avons voulu examiner le direct effet de PDF sur les horloges moléculaires. À cette fin, nous avons développé une méthode pour contrôler l’expression des gènes circadiens rythmes dans cerveau larvaire explant sur plusieurs jours en Time-lapse microscopie confocale. Le protocole a été également adapté pour les essais pharmacologiques tester l’effet de PDF ou d’autres composés sur le niveau de p.-TDT. Ainsi, l’adaptation se compose de vulgariser la culture d’explants de cerveau à la demande de drogue, d’augmenter la résolution temporelle et d’imagerie pour une durée plus courte.
Ex vivo culture de Drosophila cerveau des différentes étapes du développement ont été établies auparavant12,13,14,15,16,17 ,,18. Considérant que ces protocoles ont été utilisés pour l’imagerie des différents phénomènes biologiques, certains d'entre eux ne sont pas compatibles avec la formation image à résolution unicellulaire ou ne supportent pas la culture pendant plus de quelques heures. Des méthodes alternatives pour effectuer une imagerie live à long terme des neurones circadiennes chez la drosophile incluent l’imagerie bioluminescence des rythmes moléculaires19,20,21 et imagerie de fluorescence de indicateur de calcium avec nappe de lumière microscopie22,23. Bien que l’imagerie de bioluminescence peut atteindre une résolution temporelle plus élevée et la microscopie de nappe de lumière peut être adaptable pour l’imagerie in vivo , ils sont limités à la résolution spatiale et exigent des systèmes spécialisés de microscope.
La méthode décrite ici est adaptée pour visualiser les signaux fluorescents dans la culture de cerveau entier à cellule unique résolution sur plusieurs jours. Cette méthode facile et polyvalente pourrait être adaptée à cervelle de mouche adulte image cultivée et d’expériences pharmacologiques d’étudier de nombreux problèmes différents en neurobiologie de la drosophile .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. préparation des Solutions mères sous une hotte de Culture
- Préparer 400 mL 1 x milieu actif Schneider (SAM) optimisé pour ex vivo culture des larves cerveaux (modifié d’après référence24,25) (tableau 1). Aliquote de 5 mL et flash congélation dans l’azote liquide (LN2), conserver à - 80 ° C.
- Préparer 1 x disséquant une Solution Saline (DSS) en diluant 10 x solution mère (adapté de référence26) (tableau 2).
- Fibrinogène aliquote à 10 mg et conserver à 4 ° C pour un usage unique.
ATTENTION : Peser fibrinogène sous flux laminaire, porter des gants, car il est nocif. - Préparer la solution mère de thrombine dans SAM (1500 NIH unité/mg) et de l’aliquote à 10 µL, flash geler dans LN2 et conserver à-80 ° C.
ATTENTION : Porter des gants lorsque vous manipulez la thrombine, car il est nocif. - Solution mère aliquote de 100 x la pénicilline-streptomycine. Conserver à-20 ° C.
- Couper des cercles de membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (voir la Table des matières) à la taille qui correspond à l’intérieur d’un plat de fond de verre. Rincez-les dans 70 % EtOH et puis autoclavables dH2O. stériliser et sec sous hotte à flux laminaire avec UV. Garder dans une boîte de Petri stérile. Usage unique.
NOTE : PTFE est une membrane souple poreuse qui permet les échanges gazeux et empêche l’évaporation pendant l’enregistrement à long terme moyen.
2. Time-lapse microscopie Setup
Remarque : La configuration suivante est pour un microscope confocal de tandem scanner inversé (voir Table des matières) équipée d’un scanner résonant (8 000 Hz). Le système comprend un détecteur photo-multiplicateur très sensible, qui, avec le scanner à résonant, empêche la phototoxicité et photoblanchiment. Température et l’humidité sont contrôlées dans une chambre environnementale de microscope (voir Table des matières) qui couvre la majeure partie du microscope.
- Placer une chambre étape haut humidité.
- Tourner sur les contrôleurs de température et d’humidité s’équilibrer la chambre microscope à 25 ° C et 80 % d’humidité.
- Pour réaliser des expériences dans l’obscurité totale (DD), couvrir la chambre environnementale microscope avec un tissu opaque (à moins que la chambre de microscope est faite d’un matériau opaque).
- Si vous utilisez un objectif à immersion dans l’eau, un distributeur de Micro d’Immersion eau sur le dessus de l’objectif du poste et programmer un protocole avec le logiciel de contrôleur d’objectif Autoimmersion pour puiser l’eau à un rythme constant pendant la formation image Time-lapse.
Remarque : Objectifs immersion dans l’eau ainsi qu’un distributeur d’eau ou sec lentille de l’objectif sont recommandés pour l’imagerie live à long terme, comme autre type de support d’immersion se dessécher. - Placez un boîte de Pétri titulaire sur la scène, à l’intérieur de la chambre de l’humidité.
- Lancez le logiciel de microscope, puis choisissez le mode de scanner résonnant dans la première boîte de dialogue. Sélectionnez OK pour initialiser la scène lorsque vous y êtes invité. Allez à l’onglet Configuration et à la configuration matérielle pour allumer les lignes laser pertinentes.
- Aller à l’onglet Acquire, à panneau de XY pour sélectionner le mode bidirectionnel et définir image paramètres d’acquisition.
Remarque : L’installation d’imagerie décrite présentée ici (Figure 2, Figure 3 et film 1) est optimisée afin d’observer l’expression circadienne de reporters fluorescents spécifiques. Les paramètres suivants ont été choisis pour mieux s’adapter à notre cahier des charges : 40 X 8 X ligne moyenne, avec résolution d’image de 512 × 512, objectif à immersion d’eau. Pour l’imagerie multicolore, acquisition d’images séquentielles est requis lorsque la longueur d’onde d’émission d’un fluorophore et la longueur d’onde d’excitation de chevauchement un autre (ici, longueurs d’onde d’émission de la protéine fluorescente jaune (YFP) et de la tomate excitation chevauchement). Choisissez le mode séquentiel « in between pile » comme c’est le plus rapide et le mouvement des neurones de l’horloge est négligeable lors de l’acquisition d’un Z-stack. Paramètres de microscopie devraient être adaptées en fonction de l’objectif de chaque expérience.
3. installation de Culture d’explants cerveau larvaire
Remarque : Toute la procédure de dissection à l’incorporation des explants de cerveau prend environ 30 min.
-
Préparation des réactifs sous une hotte de culture.
- Décongeler une partie aliquote de la thrombine et conserver à température ambiante jusqu'à l’incorporation étape (étape 3.3). Usage unique.
- Dégeler rapidement une partie aliquote de SAM à 37 ° C et continuer sur la glace pour un usage unique.
- Ajouter SAM à une portion de 10 mg de fibrinogène à 10 mg/mL, effleurez doucement et incuber à 37 ° C pendant au moins 30 minutes et au cours de l’étape d’encastrement (étape 3.3). Usage unique.
Remarque : Incuber pas la solution de fibrinogène de plus de 2 h car il commence à se polymériser. - Décongeler une partie aliquote de 100 actions x pénicilline-streptomycine. Préparation de 2,5 mL de SAM contenant 1 x pénicilline-streptomycine (SAM/antibiotiques). Conserver à température ambiante.
Remarque : Stock de magasin le reste x 100 pénicilline-streptomycine à 4 ° C jusqu'à 1 mois. - Préparer une partie aliquote de 500 µL de la SAM restante. Rester sur la glace.
- Pour l’imagerie à long terme, graissez vide stérilisés à l’autoclave à la partie plastique de la partie inférieure du verre plat bas (Figure 1 a) et stériliser sous hotte à flux laminaire avec UV.
-
Dissection du cordon nerveux du système nerveux central et ventrale.
- Nettoyer la pince et 2 x trois-puits verre plats de dissection avec 70 % EtOH. Verser 400 µL du Mas de 4 puits et 400 µL de SAM dans un puits. Rester sur la glace.
- Évider les mouche milieu contenant des larves et choisissez non-errance 3ème stade larvaire (L3) avec une pince. Les rincer successivement dans 2 puits remplis de DSS. Gardez-les dans le 3e puits remplis de DSS sur glace qui anesthetizes les larves.
NOTE : L3 dure environ 2 jours à 25 ° C. Pour observer le cerveau en temps physiologiquement pertinents, que nous avons choisi d’utiliser des larves L3 non-errance. Autres sous-groupes des neurones de l’horloge, comme l-LNvs et DN3s, commencent à se former à l’errance stade L3, mais ils ne sont pas nécessairement cyclisme pourtant (données non présentées). Par conséquent, bien qu’il soit possible d’image cyclisme horloge neurones à ce stade (données non présentées), il est important de soigneusement distinguer les neurones déjà fonctionnel horloge larvaire des pays en développement pour l’analyse des données. Non-errance L3 apparaissent environ 4 à 4,5 jours après la ponte à 25 ° C. Pour utiliser ce protocole pour l’étude des rythmes circadiens, synchroniser (monter) les larves en développement en 12 h/12 h LD cycles à 25 ° C pendant 3 jours avant la collecte des larves L3. - Disséquer les cerveaux larvaire avec une pince fine dans le 4e puits remplis de DSS, qui n’a pas été utilisé pour le rinçage des larves, à l’aide de la méthode inside-out27.
- En bref, couper la larve en deux, doucement pincer les crochets de la bouche avec une paire de pinces et enrouler à l’envers de la paroi du corps à l’aide de l’autre paire de pinces, exposant ainsi le cerveau. Libérer le cerveau en découpant de la trachée et les nerfs qui attachent au reste du corps.
- Aspirer le cerveau dans environ 3 µL du Mas avec une pipette de 20 µL (préalablement rincée avec DSS) et verser dans le puits remplis de SAM. Répétez la procédure pour cerveaux jusqu'à 7.
Remarque : La Dissection doit être effectuée sur une surface froide pour garder les larves anesthésiés et le cerveau réfrigérés. Par exemple, placer le plat de dissection sur un bloc réfrigérant raccordé à une pompe pour faire circuler l’eau réfrigérée à glace. La dissection procédure prend environ 30 s par le cerveau. Il est important de garder l’oeil/antennaire disques imaginaux attachés pour le cerveau et le cordon nerveux ventral intact. Arrachant ces pièces risque d’endommager le cerveau et réduisent la qualité de la culture. Aussi, évitez d’exposer le cerveau à l’air. Avant d’aspirer le premier cerveau, pipette de haut en bas de la DSS contenant des parties des larves disséquées, telle qu’elle empêche le cerveau de coller à la paroi de la pointe.
-
L’incorporation des explants de cerveau dans une matrice 3D et montage (~ 20 min).
- Plonger un cerveau disséqué dans la solution de travail du fibrinogène (concentration finale de fibrinogène ~3.3 mg/mL, 10,5 µL par cerveau) comme suit :
- Aspirer 3,5 µL de SAM/antibiotiques (avec le même embout utilisé au point 3.2.3). Aspirer un cerveau disséqué de la dissection dans l’embout de la pipette même sans le support SAM/antibiotiques dans la pointe de la distribution.
- Diluer le cerveau avec le support sur le couvercle d’une boîte de Petri stérile. Ajouter un autre 3,5 µL de SAM/antibiotiques et 3,5 µL de solution de 10 mg/mL de fibrinogène/SAM tiède sur la goutte contenant le cerveau. Mélanger doucement la solution autour du cerveau en pipettant également, avec une pointe de pipette de 20 µL.
Remarque : À l’aide d’une pipette au lieu des pinces dans cette étape évite mettant l’accent sur le cerveau. - Prenez 2 µL de la solution de travail de fibrinogène dans le menu déroulant et appliquez-le sur la lamelle du verre plat bas comme un petit cercle. Ajouter 0,8 µL de thrombine et mélanger très rapidement avec un embout de la pipette. Le fibrinogène est transformé en fibrine et commence à se polymériser.
- Prendre le cerveau qui se trouve dans le fibrinogène solution (étape 3.3.1) entre une paire de pinces de travail, puis positionnez-le sur la matrice, une fois qu’une matrice de fibrine de blanche est visible. Orientez le côté antérieur du cerveau vers le bas (pour l’imagerie des neurones de l’horloge). Poussez-le vers le bas aussi près que possible de la lamelle couvre-objet. Caillot de fibrine est constitué de couches de fibrine. Choisir une seule couche et le plier sur le dessus du cerveau avec des mouvements douces et petits sans détacher la matrice.
- Répéter 2 à 3 fois de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau.
Remarque : Lors de la manipulation du cerveau avec une pince, veillez à ne pas à sécher ou imposer un stress physique.
- Répéter 2 à 3 fois de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau.
- Ajouter 20 µL de SAM/antibiotiques sur le dessus du cerveau intégré pour arrêter l’action de la thrombine.
- Répétez la procédure pour monter le cerveau restant. Il est possible d’incorporer jusqu'à 5 à 6 cerveaux sur un plat de fond de verre.
- Pour l’imagerie live à long terme, ajoute 600 µL de SAM/antibiotiques dans le puits intérieur (la partie en verre). Placer une membrane PTFE prédécoupée sur le dessus de la moyenne et collez-la à la graisse sous vide appliquée sur la partie en plastique du fond (3.1.5) (Figure 1 a).
- Pour les tests pharmacologiques, remplir le plat avec 2 mL de SAM/antibiotiques (Figure 1 b).
Remarque : Il est très important éviter l’évaporation du milieu, comme l’osmolarité du milieu est essentielle à la viabilité des neurones. Par conséquent, pour des expériences d’imagerie à long terme, il est nécessaire sceller la boîte de Petri avec membrane PTFE. Considérant que, pour des expériences de courte durée, membrane d’étanchéité n’est pas nécessaire tant que le plat est rempli de 2 mL de milieu et contrôlé dans une chambre humidifiée.
4. Acquisition d’images Time-lapse
- Placer le plat de fond de verre sur le titulaire de la boîte de Pétri à l’intérieur de la chambre étape-haut humidité.
- Aller au panneau de z-pile dans l’onglet Acquire et définir les étapes du profilé en z du logiciel microscope (µm 2 × 40 ~ dans les expériences illustré à la Figure 2 et Figure 3et film 1). Définir le début d’un z-stack au plan plus éloigné de la lamelle couvre-objet et la fin à la surface de l’explant de cerveau, à proximité de la lamelle. Bien que les mouvements du cerveau sont négligeables, ajouter des profils en z supplémentaires au début et la fin de la z-pile.
- Allez à marquer & trouver d’acquisition d’images de multi-position de panneau et mise en place. Avec un objectif X 40, 1 hémisphère du cerveau peut être capturé dans un champ de vision
- Accédez au panneau du mode d’Acquisition et sélectionnez xyzt (z-pile en Time-lapse). Aller au panneau de temps Acquisition et définissez les paramètres de fréquence et l’intervalle de temps préféré.
NOTE : Acquisition d’images de Time-lapse avec la fréquence souhaitée. Notez que l’imagerie live à long terme (24-72 h) avec intervalle de laps de temps inférieur à 2 h tend à résultats en moins de neurones cyclisme, probablement parce qu’elles réduisent la viabilité des neurones. Le volume de données se développe comme le taux d’augmentation d’acquisition d’image, qui rend le stockage et l’analyse des données plus difficile.
5. traitement des Explants de cerveau avec Short-term Live Imaging
Remarque : La procédure suivante est essentiellement la même que celle pour l’imagerie à long terme, mais ne nécessite pas une membrane en PTFE. Pour éviter d’exposer le cerveau pour la lumière bleue lorsque le produit chimique est ajouté à la culture, le microscope devrait figurer dans la chambre noire avec lumière rouge.
- Aller au panneau de temps Acquisition et définissez l’intervalle de temps souhaité et le nombre de scan pour obtenir les données de base avant la demande de drogue. Démarrer le Scan.
- Après la ligne de base l’analyse est terminée, soulevez la tête de balayage du système microscope. Retirez le couvercle du contrôleur humidité étape-haut et très soigneusement retirer le couvercle du plat verre bas sans le déplacer.
- Retirer le montant de milieu de culture approprié si nécessaire. Ajoutez la solution expérimentale dans le milieu et, avec soin et très doucement, mélanger avec une pipette Pasteur stérile sans toucher les explants de cerveau.
Remarque : Pour une application bain de PDF, utiliser 2 solution-mère PDF µM (dans 10 % DMSO). - Remplacer les couvercles du verre fond plat et la chambre humide et la tête de balayage. Si vous utilisez, repositionner le tissu opaque noir autour de la chambre de microscope.
- Vérifiez que les cerveaux sont à leur position d’origine en mode direct. Ajuster si nécessaire.
- Aller au panneau de temps Acquisition et définissez l’intervalle de temps souhaité et le nombre de scan. Démarrer le Scan.
NOTE : Ici nous avons testé le Time-lapse images acquises chaque heure pendant 10 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous démontrons ici les résultats représentatifs de l’enregistrement à long terme d’un reporter fluorescent circadiens dans ex vivo la culture larvaire de cerveau et les résultats d’imagerie en live d’application bain PDF sur l’expression du Rapporteur.
Les larves L3 non-errance exprimant la journaliste horloge moléculaire p.-TDT et SAMU-mCD8::YFP conduite par un chauffeur de neurone horloge Clk 856-gal4 (Figure 1) ont été entraînés dans les LD. Brains ont été disséqués et mis en place pour la culture à long terme au cours des dernières allumer la phase du cycle LD juste avant la phase obscure (Figure 1 a et 2 b). Time-lapse imagerie a été jouée en DD et des explants de cerveau ont été photographiés toutes les 2 h pendant 64 h. Une somme-pile contenant le neurone d’intérêt a été créée et l’intensité de fluorescence moyenne de la zone correspondant à la neurone a été mesurée après soustraction de fond8. Pour déterminer la rythmicité de l’expression du journaliste, analyse spectrale d’entropie maximale (MESA) et étaient tous deux inspection manuelle utilisée8. Deux DN2s qui affichent des rythmes circadiens avec une période de ~ h 26 niveaux p.-TDT sont présentés ici (Figure 2 a, 2C et Movie 1).
En utilisant essentiellement la même configuration de culture (Figure 1 b), a examiné l’effet de la neuropeptide PDF sur l’expression de p.-TDT. Le cerveau des larves non-errance du même génotype tel que décrit ci-dessus ont été disséqué au ZT1 (Zeitgeiber Time 1, 1 h après s’allume en LD) ou ZT13 (1 h après les lumières). Les flacons contenant les larves ont été réfrigérés immédiatement sur la glace après retirés de l’incubateur. À ZT13, les flacons étaient aussi enveloppés dans du papier aluminium pour éviter l’exposition de la lumière bleue. La dissection du cerveau a été réalisée sur la glace et des cerveaux disséqués se trouvaient sur la glace. Le cerveau pris ZT13 ont été recouverts d’aluminium lorsque c’est possible. Ainsi, bien que cette procédure a été effectuée dans le laboratoire, éclairé par la lumière naturelle, l’effet de l’exposition à la lumière sur la synthèse macromoléculaire et métabolisme était minimale. Les cerveaux ont été balayées en deux fois à intervalle de 1 h pour obtenir les données de référence. PDF ou un véhicule (DMSO) a été ajouté au milieu de culture et de Time-lapse images ont été acquises chaque 1 h pour les 6 h. P.-TDT profil d’expression ont montré une augmentation de-dépendante du temps de la journée dans l’intensité de la fluorescence lors de l’addition de PDF à ZT13 dans le LNvs et DN1s et à une moindre mesure sur le DN2s (Figure 3)8.
Ces résultats indiquent que la technique d’imagerie et de la méthode de culture décrites ici activé l’enregistrement des rythmes p.-TDT à cellule unique résolution sans dérive de phototoxicité, photoblanchiment ou focus perceptible.
Remarque : Les Images ont été analysées et traitement à l’aide de Fidji28. Déconvolution itérative de 10 X a été réalisée avec AutoQuant et Imaris. Les dérives mineures dans les images de Time-lapse ont été corrigées avec bonne dérive 3D plugin d’ImageJ.
Figure 1 : anatomie des neurones d’horloge dans le cerveau de larves L3 et le programme d’installation de la culture explant de cerveau. (A et B) Schémas de l’installation de culture de cerveau pour l’imagerie à long terme (A) et pour les essais pharmacologiques avec à court terme d’imagerie (B). (A), aspiration graisse (jaune) a été appliqué sur la partie en plastique du verre plat bas pour fixer la membrane PTFE. (C) une image représentative d’un cerveau de larves L3 occlus LD à ZT2. L’expression de la journaliste d’horloge moléculaire p.-TDT (magenta) est visible dans les neurones d’horloge, qui sont étiquetés par UAS-mCD8::YFP(green) pilotée par Clk 856-gal4. Il y a 3 groupes de neurones horloge différenciées en L3 : 5 LNvs (y compris la LNv 5e, qui n’exprime pas de PDF), 2 DN1s et 2 DN2s, indiqué par les flèches blanches. Notez l’expression de p.-TDT dans le noyau des neurones de l’horloge. YFP négatif p.-TDT positive cellules sont glia et autre sous-groupe de neurones d’horloge qui sont encore en développement. Echelle = 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : résultats représentatifs de longue durée en direct imagerie des neurones horloge larvaire. (A) magnifiée vue du DN2s de l’imagerie de Time-lapse à long terme du cerveau cultivé. Des explants de cerveau ont été préparés à partir les larves L3 occlus LD disséqués à ZT11. Des images ont été prises toutes les 2 h de CT17 (rythme circadien temps 17, 5 h après les lumières subjectives en DD) pendant 64 h dans : fusion JJ. images de p.-TDT (magenta) et SAMU-mCD8::YFP conduit par Clk 856-gal4 (vert) sont sur la gauche de chaque panneau et p.-TDT niveaux représentés comme Heatmap avec dégradé bleu sont sur la droite. Echelle = 10 µm. Pour la représentation seulement, les images ont été traitées avec la correction 3D dérive et une déconvolution itérative de 10 X. (B) calendrier de l’expérience. (C) graphique représentant l’intensité de la fluorescence relative normalisé à t = 0 de deux DN2s (bleu et rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : résultats représentatifs de l’imagerie-vivre pour des expériences pharmacologiques. LD occlus larvaire cerveaux ont été disséqués et monté à ZT1 ou ZT13 et PDF (2 µM) ou DMSO a été appliqué au ZT2 ou ZT14. P.-TDT expression des explants de cerveau a été surveillée toutes les heures par microscopie Time-lapse. Fluorescence de moyenne intensité ± SEM normalisée à la valeur au début de l’imagerie (correspondant à ZT1 ou ZT13) s’affiche. Flèches rouges indiquent le temps d’application PDF ou d’un véhicule (ZT2 ou ZT14). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 et *** p < 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle avec correction de Sidak pour les comparaisons multiples. Un minimum de 32 LNvs, 18 DN1s et 16 DN2s ont été analysés pour chaque point de données. Ce chiffre a été modifié par référence8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Film 1 : l’imagerie live à long terme des larves neurones d’horloge DN2. Time-lapse film d’élevage larvaire cerveau disséqué à ZT11 et photographiée sur Magnified JJ. vues de le DN2s dans un seul hémisphère exprimant p.-TDT et SAMU-mCD8::YFP conduit par Clk 856-gal4 sont indiqués. Les images ont été acquises toutes les 2 h pour h. 64 p.-TDT (magenta) et YFP (vert) sont sur la gauche et niveaux p.-TDT représentées comme un heatmap (dégradé bleu) sont sur la droite. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
| Mesures | Réactifs | Concentration de |
| 1. mélanger les réactifs. | KH2PO4 | 4,18 mM |
| CaCl2 | 1,05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0,7 mg/ml | |
| Glucose | 2 mg/ml | |
| Tréhalose | 2 mg/ml | |
| Acide α-cétoglutarique | 0,35 mg/ml | |
| Acide fumarique | 60 μg/ml | |
| Acide malique | 0,6 mg/ml | |
| Acide succinique | 60 μg/ml | |
| Extrait de levure | 2 mg/ml | |
| Inactivés par la chaleur NON FCS | 20 % | |
| dH2O, stérilisés à l’autoclave | ||
| 2. stériliser avec 0,22 μm filtre. | ||
| 3. Incuber dans un incubateur pour la culture cellulaire à 25 ° C dans l’obscurité pendant 72 h. incubateur doit être dépourvue de contamination bactérienne ou fongique. | ||
| 4. ajouter les réactifs. | Insuline | 2 µg/ml |
| Bis-Tris pH 6,8, stériliser avec 0,22 μm filtre | 5 mM | |
| 5. Ajustez le pH de 6,8 à 6,9. | NaOH (10 N) | ~ 8 gouttes |
| 6. stériliser avec 0,22 μm filtre. | ||
| 7. aliquote à 5 ml Flash freeze dans magasin de LN2 à-80 ° C. Utilisez quelques 60 jours. | ||
| Remarque : Pour les grands volumes, stériliser avec filtre haut de bouteille par le vide, sinon utilisez un filtre de seringue. Aliquotes ouverts sous une hotte à la culture. Usage unique. | ||
Tableau 1 : préparation du support de SAM (1 x) pour la culture de cerveau de Drosophila . Moyen d’explants de cerveau de la culture. Toutes les mesures doivent être effectuées sous une hotte à la culture à l’exception de l’incubation du milieu.
| Mesures | Réactifs | Concentration de |
| 1. mélanger les réactifs. | HEPES-KOH, pH 7,4 | 99 mM |
| NaCl | 1,37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1,7 mM | |
| KH2PO4 | 2,2 mM | |
| Glucose | 33 mM | |
| Saccharose | 438 mM | |
| autoclavé dH2O | ||
| 2. stériliser avec filtre de 0,45 μm. | ||
| 3. stocker à 4 ° C jusqu'à 6 mois. | ||
| Remarque : Pour une utilisation expérimentale : diluer jusqu'à 1 X avec autoclave dH2O et stériliser avec 0,45 μm filtre haut de bouteille par le vide ou avec seringue de filtre. Conserver à 4° C. Ouvert sous une hotte de la culture, à usage multiple. | ||
Tableau 2 : préparation du MAS (x 10). Solution saline à disséquer les cerveaux de la drosophile . Préparer dans une hotte de culture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous avons décrit la méthode pour à long terme fluorecence Time-lapse d’élevage larvaire cerveaux. Le succès de ce type d’expériences dépend de plusieurs facteurs, tels que la santé de la culture, procédé d’immobilisation de l’explant de cerveau, l’intensité de la fluorescence et la ratio signal-bruit de la journaliste, temporelle et la résolution spatiale, et accessibilité de l’explant. Ces facteurs peuvent s’exclure mutuellement. Par exemple, augmentation de fréquence de Time-lapse affecte la santé de la culture et l’immobilisation de l’explant cerveau pourrait entraver les échanges gazeux. Ainsi, trouver un juste milieu (aucun calembour prévu) pour le phénomène à l’étude est la clé pour un protocole réussi. La méthode décrite ici est optimisée afin de contrôler l’expression de fluorescents reporters circadiennes dans l’échelle des heures ou jours. Elle est également applicable pour étudier les autres sujets en neurobiologie de la drosophile aussi longtemps que les processus critiques sont inchangés et exécutés avec soin.
Dans ce protocole, cerveau des explants sont immobilisées dans un caillot de fibrine, ce qui crée une matrice 3D. Bien qu’il existent d’autres méthodes d’immobilisation, comme poly-lysine ou laminine revêtement de la face vitrée, ces ralentir le développement des larves brains29 et peut compromettre ainsi leur robustesse physiologique. Par sa nature, fibrine fournit une excellente matrice qui est assez lâche pour permettre aux nutriments d’atteindre l’explant de cerveau et assez collante pour le cerveau être proche de la lamelle couvre-objet sans les écraser il16. En raison de ces avantages, méthode de caillot de fibrine a été employé dans divers protocoles de culture cellulaire et cerveau explantation culture14,17,29,30,31,32 ,33,,34. Nous recommandons d’utiliser une matrice 3D de fibrine pour culture larvaire cerveau même pour des expériences de relativement courte durée qui durent plus de quelques heures. Culture de cerveau larvaire sans matrice 3D donne des résultats erratiques (données non présentées), probablement en raison de l’absence de support physique requis pour le développement de cerveau.
Il est important de respecter scrupuleusement la morphologie de l’explant et les cellules dans les tissus avant et Pendant le Time-lapse d’imagerie pour détecter tout signe de détresse. Dans les expériences présentées ici, l’expression de le mCD8::YFP liée à la membrane a montré la morphologie des neurones intacte et p.-TDT a été détectée dans le cytoplasme et le noyau, comme prévu, ce qui indique que l’explant cerveau reste viable et saine tout au long de la durée de l’imagerie. La rythmicité circadienne a été étudiée pendant 72 h, mais nous avons observé que les explants de cerveau peuvent être cultivées pendant 5 jours sans altérer l’intégrité des neurones et du cerveau (données non présentées). Si les neurites deviennent dotty ou le corps cellulaire des neurones éclater, ceux-ci sont généralement des signes de phototoxicité et facilement évitées en adaptant les paramètres de microscope en conséquence. Par exemple, essayez de réduire la puissance du laser tout en augmentant la taille du trou d’épingle, gain intelligent et la fenêtre de détection. Toutefois, en règle générale, intensité de la fluorescence du reporter est le facteur limitant pour l’obtention d’images de bon rapport signal-bruit / sans illumination laser de haute intensité. Par conséquent, la conception du reporter, choix de fluorophore et le nombre de copies du reporter sont les premières choses à considérer lors du dépannage des problèmes de viabilité. (Dans l’expérience présentée ici, 4 exemplaires du reporter par-tdt ont été utilisés).
Autres signes d’une culture de compromis cerveau sont l’éclatement d’un hémisphère pendant le Time-lapse d’imagerie et de la circulation du fluide de l’explant de cerveau. Cela est probablement dû à des micro-perforations causées au cours de la dissection du cerveau. Enlever les disques imaginaux rattachés au cerveau larvaire est la principale source de crevaisons, donc nous le déconseille.
L’avantage d’imagerie live circadienne de fluorescence au cours de l’imagerie de la bioluminescence est sa haute résolution spatiale. En outre, la facilité d’utilisation des marqueurs cellulaires ainsi que le journaliste de rythme facilite l’analyse de la spécificité de type cellulaire. En revanche, la bioluminescence a résolution temporelle supérieure et son excellent rapport signal-bruit19,20,21. Néanmoins, dans l’ensemble nombre de neurones cyclisme par cerveau imagé par bioluminescence n’est pas supérieur comparé à celui obtenu avec notre méthode8,19,21. Dans la plupart des cas, les rythmes des journalistes fluorescentes détectées avec notre méthode sont synchronisés au sein du même groupe de neurones d’horloge (voir Figure 2), comme illustré à la bioluminescence19. On observe des différences de phase entre les clusters de neurone horloge en fluorescence et bioluminescence circadienne d’imagerie du19,8,21. Par conséquent, deux méthodologies sont également valables dans l’observation des rythmes circadiens dans les cerveaux et le choix entre la floraison et de la bioluminescence doit être effectué conformément à l’objectif de l’étude.
La principale difficulté technique de cette méthode est à l’étape d’encastrement. Parce que le protocole préconise l’imagerie confocale à balayage rapide avec un microscope inversé, et diffusion de la lumière dans le tissu cérébral réduit la détection de la fluorescence, surtout quand l’imagerie profondément dans les tissus, les explants de cerveau doivent être montés aussi près que possible de la lamelle couvre-objet. En outre, la reproductibilité des résultats d’imagerie dépend de la cohérence des z-positions des neurones des intérêts. Par conséquent, il est important d’orienter et de monter des cerveaux toujours de la même manière, ce qui exige la pratique. Afin d’imager neuronale clusters situés dans des positions anatomiquement distinctes, il peut être requis pour exécuter les expériences distinctes avec orientation explant cerveau différents. Il existe des méthodes alternatives pour l’imagerie live deep-tissue ne nécessitant pas de mise en culture du tissu, comme en microscopie de nappe de lumière et de la microscopie biphotonique. Ce dernier a été utilisé avec succès à la dynamique circadienne calcium image en direct Drosophila cerveaux22,23. Toutefois, la microscopie de nappe de lumière a une résolution spatiale inférieure à la microscopie confocale et son application à l’imagerie à cellule unique résolution reste donc un défi.
En résumé, ce protocole combine un système simple de culture d’explants de larves de cerveau dans des conditions qui prennent en charge l’acquisition d’images Time-lapse de reporters fluorescents au cours des jours et l’analyse quantitative des rythmes biologiques. Bien qu’il existe certaines limitations, comme indiqué plus haut, la méthodologie peut être adaptée à des journalistes différents image dans les cerveaux de Drosophila larvaire et adulte et encore modifiée pour augmenter la sensibilité et la résolution spatiale. Par exemple, projections axonales situé profondément dans le cerveau, ou le transport vésiculaire peut-être être détectable en combinant notre technique de culture des explants cerveau avec la microscopie biphotonique35. Qu’étant dit, il est toujours possible d’effectuer en direct-imagerie des organites comme les mitochondries dans le cerveau adulte des explants utilisant ce protocole (données non présentées). Nous avons également présenté la variation de ce protocole d’application de bain de solution expérimentale dans les essais pharmacologiques. On pourrait étendre ce protocole pour effectuer des expériences de « pulse-chase » en remplaçant manuellement le milieu de culture de laver la drogue ou à l’aide d’une perfusion de18,chambre36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Michael Rosbash son mentorat et soutien durant la phase initiale du développement de cette méthode. Ce travail a été financé par le programme JST PRESTO, de la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 et 31003A_169548), l’European Research Council (ERC-StG-311194), la Fondation Novartis pour la recherche médicale-biomédicale (13A39) et l’Université de Genève .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
