Summary
このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス イメージングの概日リズムの分子リズムを監視するために最適化を確立することです。このメソッドの薬理学的アッセイへの応用を論じた。
Abstract
概日時計の回路は、昼/夜サイクルなどの環境手がかりと連動したリズミカルな行動および生理学的な出力を調整します。各細胞内で分子時計は、回路の動作に必要なリズミカルな神経機能の根底にある遺伝子発現の概日リズムを生成します。ペース メーカー細胞のさまざまなサブクラスにおける個々 の分子振動子と神経信号との相互作用の性質の調査概日時計回路の理解が得られます。培養ショウジョウバエ幼虫脳の時計ニューロンの分子時計仕掛けを監視する開発タイムラプス蛍光顕微鏡のアプローチを紹介します。このメソッドは、単一セルの解像度で、遺伝子にエンコードされた蛍光概記者のリズムの複数日記録をできます。このセットアップは、さまざまな化合物を分子時計のリアルタイム応答の詳細に解析する薬理学的操作と組み合わせることができます。概日リズムを超えて強力なショウジョウバエの遺伝学的手法との組み合わせでこの多目的メソッドは生きている脳組織の多様な神経細胞や分子プロセスを勉強する可能性を提供しています。
Introduction
体内時計は、地球の 24 時間の自転によって生成された定期的な環境変化に適応する生物を助けます。インタロックされた転写翻訳フィード バック ループ一般種1にわたって概日時計の分子機械を根底します。概日時計回路構成の時計を含むニューロンの統合環境手がかり、明/暗 (LD) や毎日の茄多のリズムを調整するための温度サイクルなどによって伝えられる時刻の情報生理と行動プロセス2,3。分子リズム神経の入力と出力の調整は概日リズム回路ですが部分的にしか理解されて残るの操作にきわめて重要です。
ショウジョウバエの分子時計のコアでクロック (CLK/サイク) ヘテロダイマーをアクティブに期間(あたり) の転写と時代を超越した(ティム)。あたりとティムは、複合体を形成し、彼らは CLK/サイクとその結果自分の転写の転写活性を阻害する核を入力します。CLK/サイクを介した転写とあたりで抑圧の間の遅延が発生する転写と翻訳後の規制/ティムは、24 h の分子振動1,3,4年頃の世代を確保します。.これらの分子時計のフォームを含む約 150 のニューロン大人の行動の日周性制御回路は飛ぶ5です。くらい簡単で完全に機能的な概日リズム回路時計ニューロン - 5 腹側外側ニューロン (LNvs; 4 PDF 陽性 LNvs および以下を参照してください 1 つの PDF 負 LNv)、2 背側ニューロン 1 s (DN1s) と 2 の背側ニューロン 2 s (DN2s) - の 3 つのグループから成るが、幼虫の存在脳6,7。
シンプルな幼虫体内回路間神経回路と分子時計の相互作用を研究するための優れたモデルを提供しています。我々 は分子時計仕掛け幼虫体内回路で異なるクロック ニューロン群のダイナミクスを特徴付けるしようと新しく開発された蛍光レポーターあたり TDT、蛋白質および細胞内ロケーションごとのレベルを模倣を使用して8ですさらに、我々 神経レベル9,,1011で概日リズムの調節に 4 LNvs によって生成されるペプチド顔料分散係数 (PDF) の重要な役割を知ることには、直接を調べたい。分子時計の PDF の効果。このため、幼虫の脳のリズムは、複数日にわたるタイムラプス共焦点顕微鏡による外植体概日遺伝子の発現を監視する方法を開発しました。プロトコルは、TDT のあたりのレベルに及ぼす PDF または他の化合物をテストする薬理学的アッセイにも適応されました。したがって、適応は、脳培養を薬物のアプリケーションにアクセスできるように、時間的解像度は高く、短い期間のためのイメージングで構成されます。
発達段階別のショウジョウバエ脳の前のヴィヴォ文化はずっと以前に確立された12,13,14,15,16,17 ,18。これらのプロトコルは、さまざまな生物学的現象のイメージングのために使用されているに対し、それらのいくつかは単一セルの解像度で画像と互換性がないまたは数時間以上の文化をサポートしていません。ショウジョウバエの概日リズム神経細胞の長期のライブ イメージングを実行する代替方法など分子リズム19,20,21の生物発光イメージングの蛍光イメージング光シート顕微鏡22,23カルシウム インジケーター。生物発光イメージングは、高い時間分解能を達成できる、光シート顕微鏡は生体内イメージングのため適応することができますが、彼らは空間分解能に限られている、特殊な顕微鏡システムが必要があります。
ここで説明する方法は、複数日にわたる単一セルの解像度で全脳文化の蛍光信号を視覚化するために合わせて調整されます。この安易な汎用性の高い方法は、ショウジョウバエの神経生物学のさまざまな問題を研究する薬理学的実験、培養画像アダルト飛ぶ脳に合わせることができます。
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Protocol
1. 文化フードの下にストック溶液の調製
- 400 ml (参照24,25から変更) 幼虫の脳の前のヴィヴォ文化のために最適化されたシュナイダー活動的な媒体 (SAM) x 1 の (表 1)。5 mL フラッシュして因数 (LN2) 液体窒素で凍結、- 80 ° C で保存
- 希釈 10 倍の原液 (参照26から変更) 解剖生理食塩 (DSS) × 1 を準備 (表 2)。
- 10 mg と単一の使用のための 4 ° C で保存場所に割り切れるフィブリノゲンは。
注意: 層流、手袋、有害です下のフィブリノゲンの重量を量る。 - サムのトロンビン原液を準備 (1500 NIH ユニット/mg)、10 μ L を分注、フラッシュ LN2でフリーズ、-80 ° C で維持
注意: は、有害であるトロンビンを処理するとき、手袋を着用します。 - 分注・原液 100 のペニシリン-ストレプトマイシン x。-20 ° C で維持します。
- ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 膜の円を削減 (材料表参照) ガラス底皿の内側に収まるサイズにします。70% にそれらを洗い流してエタノールそしてオートクレーブの dH2O. 定置滅菌と UV を伴う層流の下でドライ。滅菌シャーレにしてください。シングルユース。
注: PTFE ガス交換ができ、媒体の長期記録中に蒸発を防止する多孔質柔軟な膜であります。
2. タイムラプス顕微鏡のセットアップ
メモ: 次のセットアップ タンデム逆スキャナー共焦点顕微鏡 (材料表参照) が装備されて共振型スキャナー (8,000 Hz)。システムには、共振型スキャナーと一緒に光毒性や退色を防止する高感度写真乗算器が含まれています。温度と湿度を制御顕微鏡環境チャンバ内顕微鏡のほとんどをカバーする (表を参照)。
- ステージ上の湿度チャンバーを配置します。
- 顕微鏡室 25 ° C と 80% の湿度に平衡に温度・湿度コント ローラーをオンにします。
- 暗黒 (DD) で実験を実行するには、(ただし、顕微鏡室は不透明な材料の作られて) 不透明な布で顕微鏡環境商工会議所をカバーします。
- 水浸漬の目的を使用して、目的の上に水浸マイクロ ディスペンサーを置き、タイムラプス イメージング中に一定の割合で水を分配するための Autoimmersion 目的のコント ローラー ソフトウェアとプロトコルをプログラムします。
注: 浸漬媒体の他のタイプが乾くと、長期のライブ イメージング、水浸漬水ディスペンサーまたは乾燥対物レンズと共に目標お勧めします。 - 湿度チャンバー内のステージにシャーレ ホルダーを配置します。
- 顕微鏡のソフトウェアを起動し、最初のダイアログ ボックスから共振型スキャナー モードを選択します。初期化の段階が表示されたら [ok] を選択します。関連するレーザー ラインに切り替えるにハードウェア構成を [設定] タブに移動します。
- 双方向モードを選択し、設定の画像集録パラメーター XY パネルに取得] タブに移動します。
注: 記載されているイメージング セットアップ紹介 (図 2図 3および映画 1) は概日性特定の蛍光レポーターの発現を観察に最適です。次のパラメーターは、当社の仕様に合わせて選ばれた: 40 X 水浸対物レンズ、512 × 512 イメージ解像度の 8 X 線平均。マルチカラー イメージングを連続画像の取得が必要な場合 1 つの蛍光体と別の重複 (ここでは、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) 放射とトマト励起重なる波長) の励起波長の発光波長。最速だし、Z スタックの取得中に時計ニューロンの移動はごくわずか、"スタック"の間にシーケンシャル モードを選択します。顕微鏡設定は各実験の目的に合わせて適応する必要があります。
3. 幼虫脳培養のセットアップ
注: 脳外植体の埋め込みに郭清から全体の手順は、30 分程度かかります。
-
文化フードの下で試薬の準備。
- トロンビンの因数を解凍し、(ステップ 3.3) 埋め込み手順まで室温で維持します。シングルユース。
- 37 ° C でサムの因数をすばやく解凍し、単一の使用のための氷をします。
- 10 mg/mL にフィブリノゲンの 10 mg の因数にサムを追加, 軽くフリックし、37 ° C 少なくとも 30 分と埋め込み手順 (ステップ 3.3) 中で孵化させなさい。シングルユース。
注: フィブリノゲン ソリューションよりも 2 h が孵化しないでそれは重合を開始。 - 100 x の在庫ペニシリン-ストレプトマイシンの因数分解しなさい。2.5 ml 1 を含むサムのペニシリン-ストレプトマイシン (サム/抗生物質) x。室温で維持します。
注: ストア残り 100 x 在庫ペニシリン-ストレプトマイシン 4 ° C で 1 ヶ月。 - 残りのサムから 500 μ L の因数を準備します。氷の上を保ちます。
- 長期的なイメージングのためガラス底皿 (図 1 a) の下のプラスチックの部分にオートクレーブ真空グリースを塗布し、UV を伴う層流の下で滅菌します。
-
中枢神経系と腹側神経索の郭清。
- 鉗子、2 倍の 70 %3 よくガラス解剖料理きれい江藤。4 井戸に DSS の 400 μ L と 1 つの井戸のサムの 400 μ L を注ぐ。氷の上を保ちます。
- 幼虫を含むフライの中をえぐり、鉗子で非徘徊 3 齢幼虫 (L3) を選択します。引き続いて 2 DSS いっぱい井戸にそれらを洗い流してください。第三の DSS いっぱいよく幼虫に麻酔がかかる氷の上にしてください。
注: L3 続く 25 ° C で約 2 日間生理学的に関連する期間で脳を観察するには、非徘徊 L3 幼虫を使用にしました。時計ニューロン、l LNvs、DN3s などの他のサブグループが L3 ステージを徘徊で形成する開始、彼らは必ずしもサイクリングまだ (データは示されていない) ではないです。したがって、イメージすることが可能です (データは示されていない)、この段階で時計ニューロンをサイクリングがデータ分析用のものを開発してからすでに機能的幼虫時計ニューロンを慎重に区別することが重要。非徘徊 L3 は 25 ° C で産卵後約 4 から 4.5 日を表示概日リズムを勉強するため、このプロトコルを使用する同期 (同調) 開発の幼虫で 12/12 h LD サイクルの L3 幼虫を収集する前に 3 日間の 25 ° c。 - インサイド アウト手法27を利用した幼虫を洗浄に使用されていない 4 の DSS いっぱいのよく、微細鉗子で幼虫の脳を解剖します。
- 簡単に、2 つの幼虫をカット、優しく鉗子のペアで口フックをピンチし、ロールアップ インサイド アウト脳を公開するので、鉗子の他のペアを使用して体の壁。すべての気管と体の残りの部分に接続する神経を切断して脳を解放します。
- (DSS では洗浄済み) 20 μ L ピペットと DSS の約 3 μ L で脳を吸引し、サムいっぱいよく分配します。最大 7 脳の手順を繰り返します。
注: 郭清は冷たい表面麻酔幼虫と冷やして脳を維持するは実行必要があります。たとえば、氷冷水を循環させるポンプに接続されている冷却ブロックに解剖皿を配置します。脳あたり解剖手順が 〜 30 秒。脳とそのまま腹側神経索に添付の目/触角成虫ディスクを保つことが重要です。これらの部分をちぎり、脳を損傷し、文化の質を減らします。また、空気に脳を露出を避けます。最初の脳を吸引する前に上下に切り裂かれた幼虫の部分を含む DSS ピペット先端の壁に付着してから脳を防ぐため。
-
3 D マトリックスの脳外植体を埋め込むと取り付け (~ 20 分)。
- フィブリノゲン使用液 (フィブリノゲン最終濃度 ~3.3 mg/mL、脳あたり 10.5 μ L) で切り裂かれた脳をとおり水没します。
- (セクション 3.2.3 で使用される同じチップ) とサム/抗生物質の 3.5 μ L を吸い出しなさい。先端中 SAM/抗生物質を塗布せず同じピペット チップにも郭清から切り裂かれた脳を吸引します。
- 脳と滅菌シャーレの蓋の中を調剤します。脳を含むドロップにサム/抗生物質の別の 3.5 μ L と暖かいフィブリノゲン/サム 10 mg/mL の溶液の 3.5 μ L を追加します。20 μ L ピペット チップでピペッティングで優しく脳周りのソリューションをミックスします。
注: この手順ではピペットではなく、鉗子を使用して脳を強調を回避できます。 - ドロップからフィブリノゲン作業ソリューションの 2 μ L、小さな円としてガラス底皿の上適用されます。トロンビンの 0.8 μ L を加え、ピペット チップを非常に迅速に混ぜます。フィブリノゲンはフィブリンに変換され、重合を開始します。
- フィブリノゲン作業ソリューション (ステップ 3.3.1) 鉗子のペアの間に座っている脳を取るし、フィブリンの白いマトリックス表示されるマトリックス上に配置します。ダウン (時計ニューロンをイメージング) の脳の前方側に合わせます。それをプッシュできるだけ近くにカバーのガラスに。フィブリン血栓は、フィブリンの層で構成されます。1 つのレイヤーを選択、マトリックスを外さず小さなと穏やかな動きで脳の上にそれを折る。
- 脳を安定させるために血栓のさまざまな部分から 2 〜 3 倍を繰り返します。
注: 鉗子で脳を処理するときそれを乾燥もしくはそれに物理的なストレスを課すしないように注意します。
- 脳を安定させるために血栓のさまざまな部分から 2 〜 3 倍を繰り返します。
- トロンビンのアクションを停止する埋め込み脳の上にサム/抗生物質の 20 μ L を追加します。
- 残りの脳をマウントする手順を繰り返します。ガラス底皿の上 6 の脳に 5 までを埋め込むことが可能です。
- 長期のライブ イメージング (ガラス部分) の内部の井戸にサム/抗生物質の 600 μ L を追加します。培地の上にカット済み PTFE 膜を置き、(3.1.5) (図 1 a) の下のプラスチックの部分に適用される真空グリースに固執します。
- 薬理学的試金のためのサム/抗生物質 (図 1 b) 2 mL で皿を満たし。
培地の浸透圧は細胞の生存に重要なメモ: それは、培地の蒸発を避けるために非常に重要。したがって、長期的なイメージング実験のため PTFE 膜を培養皿を封印する必要は。短期的な実験のため膜のシールはありません限り、皿の中の 2 ml し、加湿チャンバで監視が必要。
4 コマ画像の取得
- ステージ上の湿度チャンバー内シャーレ ホルダーにガラスの下皿を配置します。
- Z スタック パネル [取得] タブに移動し、顕微鏡ソフトウェア (2 μ m × ~ 40図 2 図 3、およびムービー 1に示す実験) から z セクション手順を設定します。Coverslip と脳外植の体、coverslip の近くに、表面の終わりから最も遠い面 z スタックの先頭を設定します。脳の動きがごくわずか、先頭と z スタックの末尾に余分な z セクションを追加します。
- マーク ・ パネルとセットアップのマルチ ポジション イメージ取得を見つけるに移動します。40 × 対物をビューのフィールド内で 1 の脳半球に取り込むことができます。
- 取得モード] パネルと [xyzt (z スタック時間経過) に移動します。時間獲得パネルに移動し、希望の時間間隔と周波数パラメーターを設定します。
注: は、所望の周波数でコマ撮り画像を取得します。注意してください結果を少ないサイクリング ニューロン長期ライブ イメージング (24 72 h) 経過時間 2 h より短い傾向があることおそらく神経細胞の生存率を少なくため。データ ボリュームは、もっと挑戦的なデータ分析とストレージは、画像取得増加率として展開します。
5 短期ライブ イメージングと脳外植体薬理学的治療
注: 次の手順は、本質的と同じ長期的なイメージングが PTFE 膜を必要としません。青色光文化に化学物質を追加するときに脳を公開しないようにするには、顕微鏡を赤い光で暗い部屋で配置する必要があります。
- 時間獲得パネルに移動し、適切な時間間隔と新薬承認申請前にベースライン データを取得するためにスキャンの数を設定します。スキャンを開始します。
- スキャンの完了後、ベースライン、顕微鏡システムのスキャン ヘッドを持ち上げます。ステージ上の湿度コント ローラーの蓋を取り外し、非常に慎重にそれを移動することがなくガラス底皿のふたを外します。
- 必要に応じて、適切な培地量を削除します。培地で実験的なソリューションを追加し、脳外植体に触れることがなく滅菌パスツール ピペットで非常にゆっくりと慎重にミックスします。
注: バス PDF のアプリケーション (10 %dmso) で 2 μ M PDF 原液を使用します。 - ガラス底皿および湿気のある室内には、スキャン ヘッドの蓋を取り付けます。使用している場合、顕微鏡室の周り黒い不透明な布を再配置します。
- かどうか、脳は、ライブ スキャン ・ モードの元の位置を確認します。必要に応じて調整します。
- 時間獲得パネルに移動し、適切な時間間隔とスキャンの数を設定します。スキャンを開始します。
注: ここでコマ撮り画像で 10 h までのすべての時間をテストしました。
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Representative Results
ここでは、幼虫の脳文化前のヴィヴォの記者式の PDF バス アプリケーションのライブ イメージング結果概蛍光レポーターの長期記録の代表的な結果を示す.
分子時計記者あたり TDT と UA mCD8::YFP Clk 856 gal4 (図 1) されたレーザ脳の同調時計ニューロン ドライバーによって駆動を表現する非徘徊 L3 幼虫が解剖し、最後の間に長期培養のセットアップ光直前の LD サイクルの位相暗期 (図 1 aおよび2 b)。DD のタイムラプス イメージングを行い脳植は、64 時間すべての 2 h をイメージしました。ニューロンに対応する領域の平均蛍光強度を測定したバック グラウンド減算8と関心のニューロンを含む合計スタックが作成されました。記者の表現のリズムを調べるには、最大エントロピー スペクトル解析 (メサ) および手動検査は使用される8をあった。概日リズムの期間を表示する 2 つの DN2s 〜 26 h あたり TDT レベルではここに表示されます (図 2 a、 2 C、および映画 1)。
本質的に同じ文化セットアップ (図 1 b) を使用して、ニューロペプチド PDF あたり TDT の表現上の効果を調べた。同じ遺伝子型の非徘徊幼虫の脳は前述解剖され ZT1 のいずれか (Zeitgeiber 時間 1、LD で点灯後 1 h) または ZT13 (消灯後 1 h)。幼虫を含むバイアルは氷上インキュベーター外を撮影後すぐに温めました。ZT13、バイアルも青色光の露出を避けるためにアルミ箔包まれました。氷の上の脳解剖を行い解剖脳は氷で冷やしていた。ZT13 で撮影した脳は、可能な限りアルミ箔で覆われていた。したがって、この手順は、自然光で点灯しているラボで行った、高分子の合成と代謝に及ぼす光照射は最小だった。脳は、ベースライン データを取得する 1 時間間隔で 2 回スキャンされました。PDF または車両 (DMSO) 培養培地に加え、タイムラプス画像はその後 6 h あたり TDT のすべての 1 h が買収された表現のプロフィールが PDF 追加で LNvs、DN1s、および ZT13 に蛍光強度の時間の日依存増加を示した、DN2s の程度 (図 3)8。
これらの結果は、イメージング技術、ここで説明した培養法に顕著な毒性、退色やフォーカス ドリフトなしの単一セルの解像度であたり TDT リズムの記録が有効になっているを示します。
注: 画像は、分析し、フィジー28を使用して処理されます。AutoQuant と Imaris 10 X 反復デコンボリューションを行った。コマ撮り画像でマイナーなドリフトは、ImageJ の正しい 3 D ドリフト プラグインで修正されました。
図 1: L3 幼虫脳および脳植文化セットアップの時計ニューロンの解剖します。(AとB)脳文化のセットアップ (A) と短期的なイメージング (B) 薬理学的試金のため長期的なイメージングのための概略図。(A) 真空グリース (黄色) は、PTFE 膜を付けるガラス底皿のプラスチック部分に適用されました。(C) ZT2 で LD 同調 L3 幼虫脳の代表的なイメージ。分子時計記者あたり TDT (マゼンタ) の式は、 Clk 856 gal4によって駆動される UAS-mCD8::YFP(green) によりラベル付けされた時計ニューロンに表示されます。L3 で差別化された時計ニューロンの 3 グループがある: (PDF を表現していない 5 の LNv 含む) 5 LNvs、2 DN1s、2 DN2s、白の矢印で示されます。時計ニューロンの核にあたり TDT の表現に注意してください。YFP 負あたり TDT 陽性細胞はグリア細胞とまだ発展途上時計ニューロンの他のサブグループです。スケール バー = 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 長期の代表の結果ライブ幼虫時計ニューロンのイメージングします。(A)は拡大培養脳の長期的なタイムラプス イメージングから DN2s の表示です。脳外植片は、ZT11 で解剖 LD 同調 L3 幼虫から調製しました。CT17 からすべての 2 h が撮影された画像 (概時間 17、主観的な DD で消灯後 5 h) dd. 合併で 64 時間あたり TDT (マゼンタ) とClk 856 gal4 (緑) によって駆動される UA mCD8::YFP の画像は、各パネルの左側には、あたり TDT レベルとして表現青のグラデーションでヒートマップは右側に。スケール バー = 10 μ m。表現のみの画像は 3 D 補正ドリフトと 10 X 反復デコンボリューション処理しました。(B)実験のタイミング。(C)グラフの相対的な蛍光強度を表す正規化で t = 0 の 2 つの DN2s (青と赤)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 薬理学的実験のためのライブ イメージングの代表の結果。幼虫脳の LD 同調された解剖し、PDF や ZT13、ZT1 マウント (2 μ M) DMSO が ZT2 または ZT14 に適用されます。脳外植片のあたり TDT 式タイムラプス顕微鏡によるすべての時間をモニターしました。平均蛍光輝度 ± SEM イメージング (ZT1 または ZT13 に対応) の開始時の値に正規化されます。赤い矢印は、PDF または車両アプリケーション (ZT2 または ZT14) の時間を示します。* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001 と * * * p < Sidak の多重比較補正機能を備えた双方向分散分析により 0.0001。32 LNvs、18 DN1s、16 DN2s の最小値は、各データ ポイントの分析しました。この図は、参照8から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: 幼虫 DN2 時計ニューロンの長期のライブ イメージングします。培養の幼虫の脳の時間経過映画 ZT11 で解剖し、視覚化 dd. 拡大鏡あたり TDT と UA mCD8::YFP Clk 856 gal4によって駆動を表現する 1 つの半球の DN2s のビューが表示されます。画像はすべて 2 h (マゼンタ) 64 h. あたり TDT の買収された YFP (グリーン) は、左とヒートマップ (青いグラデーション) として表されるあたり TDT レベルには右側に。スケール バー = 10 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
| 手順 | 試薬 | 濃度 |
| 1. 試薬を混ぜます。 | KH2PO4 | 4.18 mM |
| CaCl2 | 1.05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0.7 mM | |
| 塩化ナトリウム | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0.7 mg/ml | |
| グルコース | 2 mg/ml | |
| トレハロース | 2 mg/ml | |
| Α-ケトグル タール酸 | 0.35 mg/ml | |
| フマル酸 | 60 μ g/ml | |
| リンゴ酸 | 0.6 mg/ml | |
| コハク酸 | 60 μ g/ml | |
| 酵母エキス | 2 mg/ml | |
| FCS の非熱不活化 | 20% | |
| dH2O、オートクレーブ | ||
| 2. 0.22 μ m のフィルターで滅菌します。 | ||
| 3. 72 h インキュベーターの暗闇の中での 25 ° C で培養の細菌や真菌の汚染は欠けているため、インキュベーターで孵化させなさい。 | ||
| 4. 試薬を追加します。 | インスリン | 2 μ g/ml |
| Bis トリス pH 6.8、0.22 μ m フィルターで滅菌します。 | 5 mM | |
| 5. 6.8 6.9 に pH を調整します。 | 水酸化ナトリウム (10 N) | 〜 8 滴 |
| 6. 0.22 μ m のフィルターで滅菌します。 | ||
| 7. 5 ml フラッシュする因数は-80 ° C で LN2 ストアでフリーズします。60 日以内を使用します。 | ||
| 注:大量、真空フィルター トップ ボトルの殺菌は、シリンジ フィルターを使用して、それ以外の場合。文化フード オープン因数。シングルユース。 | ||
表 1:ショウジョウバエ脳文化のサム媒体 (1 x) の準備。メディア文化脳植。すべてのステップは、培地の培養を除いて文化フードで行わなければなりません。
| 手順 | 試薬 | 濃度 |
| 1. 試薬を混ぜます。 | HEPES 島、pH 7.4 | 99 mM |
| 塩化ナトリウム | 1.37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1.7 mM | |
| KH2PO4 | 2.2 mM | |
| グルコース | 33 mM | |
| ショ糖 | 438 mM | |
| オートクレーブ dH2O | ||
| 2. 0.45 μ m のフィルターで滅菌します。 | ||
| 3 6 ヶ月に 4 ° C で保存します。 | ||
| 注:実験用: オートクレーブ dH2O と X 1 に希釈し、0.45 μ m フィルター トップ ボトル真空でまたはフィルター注射器を消毒します。4 ° C で維持します。文化フード、複数使用で開かれています。 | ||
表 2: DSS の準備 (10 x).ショウジョウバエの脳を解剖する食塩。文化フードを準備します。
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Discussion
ここで長期培養の幼虫の脳の蛍光タイムラプス顕微鏡法について述べる。このタイプの実験の成功によって異なります文化、健康などの複数の要因脳植、蛍光強度、記者、時間と空間分解能の信号対雑音比の固定方法と外植体へのアクセシビリティ。これらの要因は相互に排他的にすることができます。たとえば、文化の健康に影響するタイムラプス周波数の増加、脳外植体の固定化は、ガス交換を妨げる可能性が。したがって、調査の下で現象の幸せな媒体 (しゃれは意図) を見つけることは成功したプロトコルにキーです。ここで説明する方法は、数時間数日からのスケールで蛍光概記者の式を監視に最適です。また、重要なプロセスが変更されず、注意を払って実行限りショウジョウバエ神経生物学の他の科目を研究に適用されます。
このプロトコルでは 3 D マトリックスを作成し、フィブリン血栓脳外植片が固定化します。ポリ リジンやラミニン カバー ガラスのコーティングなどの固定化のための他の方法が存在するがこれらの幼虫の開発を遅く29の頭脳し、彼らの生理学的な堅牢性、妥協の可能性があります。その性質は、フィブリンは緩い十分な栄養素脳外植体に到達して16それを退治することがなくカバー ガラスに近いことを脳に十分な粘着性である優秀なマトリックスを提供します。これらの利点によりフィブリン血栓メソッドは、細胞培養のための様々 なプロトコルで採用されている、脳移植文化14,17,29,30,31,32 ,33,34。我々 は最後の数時間よりも比較的短期の実験のためにも幼虫の脳文化のフィブリン 3 D マトリックスを使用してお勧めします。3 D マトリックスなし幼虫脳文化は、脳を開発するために必要な物理的なサポートの不足のためおそらく不安定な結果 (データは示されていない) を与えます。
前に、と苦痛の兆候を検出する時間経過イメージ投射の間に慎重に外植体と組織中の細胞の形態を観察することが重要です。ここで示した実験、膜結合型 mCD8::YFP の発現ニューロンのままの形態を示し、どおり、脳外植体全体で健康に残ったことを示すあたり TDT が細胞質と核に検出されましたイメージングの期間です。72 h までの概日リズム性を調べたが、最大 5 日間脳外植体をニューロンと脳 (データは示されていない) の整合性を損なうことがなく培養できることを見ました。神経突起になる義母やバースト ニューロンの細胞体、これら光毒性の兆候は、一般的に顕微鏡の設定を適応することにより簡単に防ぐ場合それに応じて。たとえば、ピンホールの大きさ、スマート ゲインおよび検出のウィンドウを増加させながらのレーザー出力を下げてみてください。しかし、一般的に、記者の蛍光強度は高強度レーザー照明なしの良い信号対雑音比の画像を取得するための制限要因であります。したがって、記者、蛍光体と記者のコピー数の選択の設計、実行可能性の問題のトラブルシューティングを検討する最初のものです。(ここで示した実験でtdt あたり記者の 4 つのコピーされた使用)。
侵害された脳文化の他の徴候には、タイムラプス イメージングと脳外植体からの流体の動きの間に半球のバーストが含まれます。これはマイクロ穿刺、脳の解剖中に発生した可能性があります。パンクの主な情報源は、幼虫の脳に接続されている成虫ディスクを削除する、従って私達はそれに対して助言します。
蛍光発光イメージングに概ライブ イメージングの利点はあるという高分解能です。さらに、リズム記者と共に細胞のマーカーを使用しての使いやすさは細胞型特異性の解析を容易します。対照的に、生物発光が優れた時間分解能と優れた信号対雑音比19,20,21。それにもかかわらず、全体的な生物発光を用いた脳あたりサイクリング ニューロンの数に比べてはない優れた私たち法8,19,21得られる数値。発光19に示すように、ほとんどの場合、当社の方法で検出された蛍光レポーターのリズム時計ニューロン (図 2を参照)、同じクラスター内で同期されます。時計ニューロンのクラスター間の位相差は、蛍光と発光概イメージング8,19、21の両方で観察されました。したがって、両方の方法論、培養脳の概日リズムを観察することで同様に有効、蛍光と発光の選択は、研究の目的によるとすべきであります。
このメソッドの主な技術的な難しさは、埋め込みのステップにあります。脳外植片の取付けは倒立顕微鏡と高速走査型共焦点レーザー顕微鏡の議定書、脳組織における光散乱蛍光検出を削減は、組織の深さイメージングする場合は特にために近くにカバーガラスが可能です。さらに、画像処理の結果の再現性は興味のニューロンの z 位置の整合性に依存します。したがって、方向を設定し、練習が必要です、同様に脳を常にマウントすることが重要です。神経画像をクラスターに位置する明確な解剖学的位置、異なる脳植向きで個別の実験を実行する必要がある場合があります。2 光子顕微鏡や光シート顕微鏡による組織培養を必要としない深部組織ライブ イメージングのための別の方法があります。後者が正常に使用されて画像ライブショウジョウバエ脳22,23概カルシウム動態に。しかし、光シート顕微鏡、共焦点顕微鏡よりも空間解像度低い、従って単一セルの解像度でイメージングへの応用課題のまま。
要約すると、このプロトコルは日間蛍光レポーターのコマ撮り画像集録と生体リズムの定量的解析をサポートする条件の下で幼虫の脳外植体の単純な培養システムを組み合わせたものです。前述の通り、一定の制限がある、方法論を幼生及び成体のショウジョウバエ脳で記者団を異なるイメージに適応し、さらに感度と空間分解能を向上するように変更できます。たとえば、脳の深部にある軸索投射または 2 光子顕微鏡35と私たちの脳の植の培養技術を組み合わせることで検出不可能かもしれない小胞輸送。言われていること、それは大人の脳でのミトコンドリアなどの細胞小器官のライブ イメージングを実行することも可能 (データは示されていない) プロトコルを使用して外植片します。また、薬理学的アッセイにお風呂用実験用ソリューションのこのプロトコルの変化を発表しました。1 つは薬を洗い流す培を手動で置き換えるか、灌流チャンバー18,36を使用して「パルス ・ チェイス」実験を実行するこのプロトコルを拡張できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は彼の指導のマイケル Rosbash に感謝し、このメソッドの開発の初期段階をサポートします。科学技術振興機構さきがけプログラムによって、スイスの全米科学財団 (31003A_149893 と 31003A_169548)、欧州研究評議会 (ERC-ポンド-311194)、ノバルティス財団法人医療医学研究 (13A39)、ジュネーブの大学資金が供給されたこの作品.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
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