Summary
Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.
Abstract
Sirkadiyen kalp pili devre gündüz/gece döngüsü gibi çevre yardımlar ile koordine ritmik davranış ve fizyolojik çıkış orchestrates. Her kalp pili nöron içinde moleküler saat sirkadiyen ritim ritmik nöronal işlevleri devre çalışması için gerekli altında yatan gen ekspresyonu oluşturur. Kalp pili nöronların farklı alt sınıfları içinde bireysel moleküler osilatörler ve nöronal sinyal ile etkileşimlerini özelliklerinin incelenmesi sirkadiyen kalp pili devre daha iyi bir anlayış verir. Burada, saat nöronların beynin kültürlü Drosophila larva moleküler saat izlemek için geliştirilen bir hızlandırılmış floresan mikroskopi yaklaşım mevcut. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte genetik olarak kodlanmış floresan sirkadiyen gazetecilere ritimler çok günlük kaydı sağlar. Bu kurulum yakından moleküler saat gerçek zamanlı yanıt çeşitli bileşikler olarak analiz etmek için farmakolojik manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Sirkadiyen ritim, çok amaçlı bu yöntem güçlü Drosophila genetik teknikleri ile birlikte canlı beyin dokusunun farklı nöronal veya moleküler işlemde çalışma imkanı sunmaktadır.
Introduction
Sirkadiyen saatler organizmaların dünya 24 h döndürme tarafından oluşturulan Periyodik çevresel değişikliklere uyum yardımcı. Hatırlayan translasyonel transkripsiyon geribesleme döngüsü yaygın tür1arasında moleküler makineler sirkadiyen saatler altında yatan. Sirkadiyen kalp pili devre oluşur saat içeren nöronlar entegre açık/koyu (LD) ve günlük bir bolluk ritimlerin yönetmek için sıcaklık döngüsü gibi çevre yardımlar ifade zaman günün bilgi fizyolojik ve davranışsal işlemleri2,3. Moleküler ritimleri nöronal girişleri ve çıkışları ile koordinasyon kritik sirkadiyen devre ama sadece kısmen anladım kalır çalışması için önemlidir.
Drosophilaiçinde moleküler saat özünde saat/döngüsü (CLK/CYC) heterodimerdir dönemi (başı), transkripsiyonu etkinleştirir ve zamansız (tim). BAŞINA ve TIM bir kompleks oluştururlar ve çekirdeği, nerede onlar transkripsiyon etkinlik CLK/CYC ve sonuç olarak kendi transkripsiyonu inhibe girin. Çoğu ve translasyon düzenlemeler CLK/CYC-aracılı transkripsiyon ve baskı başına arasında gecikmelere neden / TIM yaklaşık 24-h moleküler titreşimler1,3,4 nesil sağlanması, . Yaklaşık 150 nöronlar bu moleküler saat formu içeren bir devre yetişkin denetimi sirkadiyen davranışı için5uçar. Saat nöronların - 5 ventral yanal nöronlar (LNvs; 4 PDF-pozitif LNvs ve aşağıya bakın bir PDF-negatif LNv), 2 Dorsal nöron 1s (DN1s) ve 2 Dorsal nöron 2s (DN2s) - 3 grupları oluşan bir çok basit henüz tam olarak işlevsel sirkadiyen devre larva mevcuttur beyin6,7.
Basit larva sirkadiyen devre arası nöronal iletişim ve moleküler saat arasındaki etkileşimler eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Hangi düzeyde protein ve hücre altı konumu başına taklit eder, yeni geliştirilen floresan muhabirimiz başına-TDT, kullanarak farklı saat nöron gruplarının larva sirkadiyen devre moleküler saat dinamikleri karakterize istedi 8. Ayrıca, peptit pigment Dispergatör faktörü (PDF) rolünün sirkadiyen ritim nöronal düzeyde9,10,11düzenlenmesinde 4 LNvs tarafından üretilen bilmek, biz doğrudan incelemek istedim Moleküler saatler PDF etkisi. Bu amaçla, biz sirkadiyen gen ekspresyonu ritimleri larva beyin olarak birden fazla gün içinde tarafından hızlandırılmış confocal mikroskopi explant izlemek için bir yöntem geliştirdi. Protokol ayrıca PDF ya da diğer bileşikler etkisi başına TDT düzeyinde test etmek farmakolojik deneyleri için uyarlanmıştır. Böylece, beyin explant kültür ilaç uygulama erişilebilir hale getirme, zamansal çözünürlük artırmak ve daha kısa bir süre için Imaging uyum oluşur.
Ex vivo kültür, Drosophila beyinlerinin farklı gelişim aşamalarında,-si olmak be daha önce kurulan12,13,14,15,16,17 ,18. Bu protokoller çeşitli biyolojik olayları görüntüleme için kullanılmış olan ise, bazıları tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ile uyumlu olmayan veya kültür daha--dan birkaç saat için desteklemiyor. Moleküler ritimleri19,20,21 bioluminescence görüntüleme ve floresan görüntüleme sirkadiyen nöronların uzun vadeli canlı görüntüleme Drosophila içinde gerçekleştirmek için alternatif yöntemler içerir Kalsiyum göstergesi ile hafif levha mikroskobu22,23. Bioluminescence görüntüleme yüksek zamansal çözünürlük elde edebilirsiniz ve hafif levha mikroskobu vivo içinde görüntüleme için uyarlanabilir olabilir rağmen Uzaysal çözünürlük sınırlı olduğunu ve özel mikroskop sistemleri gerektirir.
Burada açıklanan yöntemi birden fazla gün içinde tüm beyin kültür tek hücreli çözünürlükte floresan sinyallerini görselleştirmek için hazırlanmıştır. Bu facile ve çok yönlü yöntemi kültürlü görüntü yetişkin sinek beyin için ve pek çok farklı sorun Drosophila Nörobiyoloji yılında çalışmaya farmakolojik deneyler için adapte olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması kültür başlık altında hisse senedi çözümleri
- Ex vivo kültür larva beyin (başvuru24,25değiştirilmiş) için optimize edilmiş 1 x Schneider aktif orta (SAM) 400 mL hazırlamak (Tablo 1). Aliquot 5 mL ve flash için sıvı azot (LN2) Dondurma, 80 ° C'de - mağaza
- Sulandrarak 10 hisse senedi çözüm (başvuru26değiştirilmiş) x 1 x Dissecting tuzlu çözüm (DSS) hazırlayın (Tablo 2).
- 10 mg ve mağaza bir kişilik 4 ° C'de aliquot fibrinojen.
Dikkat: fibrinojen laminar akış, zararlı olduğu gibi eldivenler altında tartın. - Trombin SAM hisse senedi çözümde hazırlamak (1500 NIH birim/mg) ve 10 µL için aliquot, flash LN2 ' dondurma ve-80 ° C'de tutmak
Dikkat: zararlı olduğu gibi Trombin işlerken eldiven. - 100 aliquot hisse senedi çözüm penisilin-streptomisin x. -20 ° C'de tutmak
- Daireler politetrafloroetilin (PTFE) membran kesmek (malzeme tabloya bakın) cam alt çanak içine uygun boyutu. % 70'yıka alkol ve sonra autoclaved dH2O. Sterilize ve kuru UV laminar akış altında. Steril kabında tutun. Tek Kişilik Kullanım.
Not: PTFE gaz değişimi sağlar ve uzun süreli kayıt sırasında buharlaşan orta engeller gözenekli bir esnek zar olduğunu.
2. hızlandırılmış mikroskobu Kur
Not: Aşağıdaki Kurulum tandem ters tarayıcı confocal mikroskop için (malzeme tabloya bakın) bir rezonans tarayıcı (8000 Hz) ile donatılmıştır. Sistemde önleyen rezonans tarayıcı ile birlikte fototoksisite ve photobleaching son derece hassas fotoğraf-çarpanı dedektörü vardır. Sıcaklık ve nem kontrol edilir bir mikroskop çevre oda içinde ( Malzeme tabloyabakın) bu mikroskop çoğunu kapsar.
- Bir sahne-üst nem odası yerleştirin.
- 25 ° C ve % 80 nem mikroskop odasına equilibrate için sıcaklık ve nem denetleyicileri açın.
- Deneyler sürekli karanlık (DD) gerçekleştirmek için (mikroskop odası opak bir malzemeden yapılmış sürece) mikroskop çevre odası opak bir bezle Kapak.
- Eğer bir su-daldırma amacı istimal, su daldırma mikro dağıtıcısı amacı üstüne getirin ve bir iletişim kuralı ile hızlandırılmış görüntüleme sırasında sabit bir oranda su dağıtmak için Autoimmersion amaç denetleyicisi yazılım programı.
Not: başka türde bir daldırma orta kuru olarak su-daldırma hedefleri ile birlikte su dağıtıcısı veya kuru objektif lens uzun vadeli canlı görüntüleme için tavsiye edilir. - Bir Petri kabına tutucu içinde nem odası sahne yerleştirin.
- Denize indirmek mikroskop bilgisayar yazılımı ve rezonans tarayıcı kipi ilk diyalog kutusundan seçin. İstendiğinde sahne başlatmak için Tamam'ı seçin. Yapılandırma sekmesini ve donanım yapılandırma ilgili lazer satırlarında geçiş yapmak için gidin.
- Al sekmesini ve çift yönlü modu seçin ve görüntü alma parametrelerini ayarlamak için XY paneline gidin.
Not: Burada sunulan açıklanan görüntüleme Kur (Şekil 2, şekil 3 ve film 1) belirli floresan gazetecilere sirkadiyen ifade gözlemlemek için optimize edilmiştir. Aşağıdaki parametreleri bizim özellikleri en iyi sığacak şekilde seçilmiştir: 40 X su daldırma amaç, 8 X satır ortalama 512 × 512 görüntü çözünürlüğü ile. Çok renkli görüntüleme için sıralı resim alma ne zaman gereklidir emisyon dalga boyu bir fluorophore ve başka bir örtüşme (burada, dalga boylarında, sarı floresan Protein (YFP) emisyon ve domates uyarma örtüşme) uyarma dalga boyu. En hızlısı ve saat nöronların hareketi Z fiş satın alma sırasında ihmal edilebilir "yığın arasında" sıralı modu seçin. Mikroskopi ayarları her denemenin amacı uygun şekilde adapte olmalıdır.
3. Kurulum larva beyin Explant kültür
Not: tüm prosedürü diseksiyon üzerinden beyin explants gömmenin ~ 30 dakika sürer.
-
Reaktifler bir kültür başlık altında hazırlanması.
- Trombin bir aliquot çözülme ve gömme adım kadar (3.3 adım) oda sıcaklığında tutmak. Tek Kişilik Kullanım.
- Hızlı bir şekilde SAM bir aliquot 37 ° C'de erimek ve buz bir oda tutun.
- 10 mg aliquot fibrinojen 10 mg/ml, SAM eklemek, yavaşça fiske ve 37 ° c en az 30 dakika ve gömme adım (Adım 3.3) sırasında kuluçkaya. Tek Kişilik Kullanım.
Not: polimerize Başlarken fibrinojen çözüm daha çok 2 h kuluçkaya değil. - Bir aliquot 100 x stokunun penisilin-streptomisin çözülme. 2,5 mL içeren 1 Sam hazırlamak penisilin-streptomisin (SAM/antibiyotik) x. Oda sıcaklığında tutmak.
Not: Mağaza kalan 100 x stok penisilin-streptomisin 4 ° c ilâ 1 ay. - 500 µL bir aliquot kalan SAM'den hazırlayın. Buz üstünde tutun.
- Uzun vadeli görüntüleme için autoclaved vakum yağ cam alt çanak (şekil 1A) alt plastik bölümü için geçerli ve laminar akış UV altında sterilize.
-
Merkezi sinir sistemi ve ventral sinir kordonu diseksiyon.
- Temiz forseps ve 2 x 3-şey cam diseksiyon yemekleri ile % 70 alkol. DSS 400 µL 4 kuyu içine ve Sam bir iyi 400 µL dökün. Buz üstünde tutun.
- Larva içeren sinek orta kepçe ve Forseps ile sigara dolaşıp 3 INSTAR larva (L3) seçin. Art arda 2 wells DSS dolu yıka. Onları 3 DSS dolu iyi larvalar anesthetizes buz üzerinde tutun.
Not: L3 25 ° C'de yaklaşık 2 gün sürer. Beyin fizyolojik ilgili süre içinde gözlemlemek için sigara dolaşıp L3 larva kullanmayı seçtiniz. L3 sahne dolaşıp oluşturulmasına izin saat nöronların, l-LNvs ve DN3s, gibi diğer alt gruplar başlamak ama mutlaka Bisiklete binme henüz (veri gösterilmez) değildir. Görüntüye mümkün olsa da bu nedenle, saat nöronlar bu aşamada (veri) gösterilmez, Bisiklete binme bu dikkatle zaten fonksiyonel larva saat nöronlar olanlar veri analizi için gelişmekte olan ayırt etmek önemlidir. Sigara dolaşıp L3 görünür yaklaşık 4-4.5 gün sonra yumurta 25 ° C'de döşeme Sirkadiyen ritim eğitimi için bu iletişim kuralını kullanmak için eşitleme (trene binmek) gelişmekte olan larvalar içinde 12 h/12 h LD L3 larva toplama önce 3 gün boyunca 25 ° C'de döngüleri. - Hangi27Inside-out yöntemi kullanarak larva, durulama için kullanılmamış 4 DSS dolu iyi, iyi Forseps ile larva beynini incelemek.
- Kısaca, larva ikiye, yavaşça ağız kanca forseps bir çift ile pinch ve vücut böylece beyin açığa forseps, diğer çifti kullanarak duvar iç-out kadar rulo. Trakea ve vücudun geri kalanına ekleyin sinirler keserek beyin bedava.
- DSS yaklaşık 3 µL beyinde (DSS ile önceden durulanır) 20 µL pipet ile Aspire edin ve SAM dolu kuyuda dağıtmak. 7 beyin için yordamı yineleyin.
Not: Diseksiyon anestezi larva ve soğutulmuş beyin tutmak için soğuk bir yüzeye yapılmalıdır. Örneğin, bir pompa buz soğuk su dolaşmaya bağlı bir soğutma bloğu üzerindeki diseksiyon çanak yerleştirin. Diseksiyon yordamı alır ~ 30 s beyin başına. Beyin ve bozulmamış ventral sinir kablosu bağlı göz/antennal Imaginal diskleri tutmak önemlidir. Bu parçalar kapalı yırtılma beyin hasar ve kültür kalitesini azaltır. Ayrıca, beynini havaya maruz kaçının. Daha önce aspirating ilk beyin, pipet disseke larvalar bölümlerini içeren DSS yukarı ve aşağı olarak beyin ucunu duvara yapışmasını önler.
-
Beyin explants bir 3D matris ve montaj (~ 20 dk) gömme.
- Fibrinojen çalışma çözüm (fibrinojen son konsantrasyon ~3.3 mg/mL, beyin başına 10.5 µL) disseke beyinde aşağıdaki gibi batırılma:
- SAM/antibiyotik 3,5 µL (3.2.3 bölümünde kullanılan aynı tıp ile) Aspire edin. Diseksiyon de aynı pipet ucu içine bir disseke beyin ucu SAM/antibiyotik ortamda dağıtımı olmadan Aspire edin.
- Beyin ve steril Petri kabına kapağındaki orta dağıtmak. Başka bir 3,5 µL SAM/antibiyotik ve sıcak fibrinojen/SAM 10 mg/mL solüsyon 3,5 µL beyin içeren damla ekleyin. Beyin etrafında çözüm karışımı yavaşça 20 µL pipet ucu ile pipetting.
Not: Bu adımda bir pipet forseps yerine kullanarak beyin vurgulayarak önler. - Fibrinojen çalışma eriyik--dan belgili tanımlık damla 2 µL alacak ve cam alt tabak küçük bir daire olarak coverslip üzerinde uygulayabilirsiniz. Trombin 0.8 µL ve çok hızlı bir şekilde bir pipet ucu ile karıştırın. Fibrinojen fibrin için dönüştürülür ve polimerize başlar.
- Çözüm (Adım 3.3.1) forseps bir çift arasında çalışma fibrinojen oturuyor beyin almak ve fibrin beyaz bir matris görünür olduğunda matrisin üzerinde konumlandırın. Beyin ön tarafı aşağı (saat nöronlar için Imaging) gelecek şekilde yönlendirin. Mümkün olduğunca yakın kapak cama bastır. Fibrin pıhtısı fibrin katmanların oluşur. Bir katman seçin ve matrix ayırma olmadan küçük ve yumuşak hareketler ile beyin üzerine katlayın.
- 2-3 kat beyin dengelemeye pıhtı farklı bölgelerinden gelen yineleyin.
Not: beyin Forseps ile işlerken, Kuru ya da fiziksel bir stres empoze değil dikkatli olun.
- 2-3 kat beyin dengelemeye pıhtı farklı bölgelerinden gelen yineleyin.
- SAM/antibiyotik 20 µL Trombin eylemi durdurmak için katıştırılmış beyin üzerine ekleyin.
- Kalan beyin takmak için yordamı yineleyin. 5 cam alt çanak üzerinde 6 beyin için katıştırmak mümkündür.
- Uzun vadeli canlı görüntüleme için SAM/antibiyotik 600 µL iç kuyuda (cam bölümü) ekleyin. Önceden kesilmiş PTFE membran orta üzerine konumlandırın ve alt (3.1.5) (şekil 1A) plastik parçası üzerinde uygulanan vakum yağ için sopa.
- Farmakolojik deneyleri için çanak SAM/antibiyotik (şekil 1B) 2 mL ile doldurulması.
Not: Orta osmolalite nöronlar canlılık için kritik olduğu gibi orta buharlaşma önlemek çok önemli. Bu nedenle, uzun vadeli görüntüleme deneyler için PTFE membran ile Kültür çanak mühür gereklidir. Oysa yemek orta 2 mL ile dolu ve oksijen odasında izlenen sürece kısa süreli deneyler için membran mühürleme gerekli değildir.
4. hızlandırılmış resim alma
- Sahne-üst nem odası içindeki Petri kabına kutusunda cam alt çanak yerleştirin.
- Z-yığın paneli edinme sekmesinde gidin ve z-bölüm adımları--dan mikroskop bilgisayar yazılımı (2 µm × ~ 40 Şekil 2 ve şekil 3ve film 1gösterilen deneylerde) ayarla. Bir z-yığın başlangıcı en uzak coverslip ve beyin explant coverslip yakın yüzey vasıl belgili tanımlık son uçak ayarlamak. Yine de beyin hareketleri yok denecek kadar azdır, başlangıç ve z-yığın sonunda ekstra z-bölümleri ekleyin.
- Mark & paneli ve set-up çok pozisyonlu resim alma bulmak için gidin. 40 X amacı ile 1 beyin yarıküre görüş alanı içinde yakalanabilir
- Toplama modu paneli ve seçin xyzt (z-yığın hızlandırılmış) gidin. Zaman edinme Masası'na gidin ve uygun zaman aralığı ve sıklık parametrelerini ayarlamak.
Not: İstenen frekansı ile hızlandırılmış görüntüleri elde etmek. Nöronlar canlılığı azalttığı muhtemelen Not uzun vadeli canlı görüntüleme (24-72 saat) zaman atlamalı aralığı 2 h kısa ile daha az Bisiklete binme nöronlar, sonuçlarında eğilimindedir. Veri birimi görüntü edinme artar, daha zorlu veri analizi ve depolama kılan oranı genişletir.
5. farmakolojik tedavisi beyin Explants vadeli canlı görüntüleme ile
Not: Aşağıdaki yordam aslında uzun vadeli görüntüleme için aynıdır ancak PTFE membran gerektirmez. Kimyasal kültür için eklendiğinde ışık mavi beyin kullanılmasını önlemek için mikroskop kırmızı ışık ile karanlık odada yer almalıdır.
- Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve uyuşturucu uygulamadan önce temel verileri elde etmek için tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır.
- Sonra temel tarama tamamlandıktan, mikroskop sistem inceden inceye gözden geçirmek başkanı kaldır. Sahne-üst nem denetleyicisi kapağını kaldırmak ve çok dikkatli hareket ettirmeden cam alt çanak kapağı kaldırın.
- Kültür orta uygun miktarda kaldırın. Deneysel çözüm orta ve, dikkatli ve yavaşça, beyin explants dokunmadan bir steril Pasteur pipet ile karıştırın.
Not: PDF banyo uygulanması için 2 µM PDF hisse senedi çözüm (% 10 DMSO içinde) kullanın. - Cam alt çanak ve nemli odası ve tarama başın kapakları değiştirin. Kullanıyorsanız, siyah opak kumaş mikroskop odası yeniden konumlandırın.
- Beyni canlı tarama modu özgün konumlarında, olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse ayarlayın.
- Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır.
Not: Burada en fazla 10 saat için her saat alınan hızlandırılmış görüntüleri test ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İşte, ex vivo larva beyin kültür ve PDF banyo uygulaması muhabir ifade üzerinde canlı görüntüleme sonuçlarını sirkadiyen floresan muhabir uzun süreli kayıt temsilcisi sonuçlarını göstermektedir.
Sigara dolaşıp L3 larva moleküler saat muhabir başına TDT ve UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (şekil 1 c) ld beyinlerinde entrained bir saat nöron sürücü tarafından tahrik ifade disseke ve son sırasında uzun vadeli kültür için kurmak Sadece önceki LD döngüsünün aşamasında karanlık evre (şekil 1A ve 2B) ışık. Hızlandırılmış görüntüleme DD içinde gerçekleştirilmiş ve beyin explants 64 h için her 2 h görüntüsü. Toplam fiş nöron ilgi içeren oluşturulmuş ve nöron için karşılık gelen alan ortalama Floresans yoğunluğunu arka plan çıkarma8' den sonra ölçüldü. Rhythmicity muhabir ifade belirlemek için kullanılan8maksimum entropi spektral analizi (MESA) ve el ile muayene edildi. Sirkadiyen ritim ile bir süre görüntülemek iki DN2s ~ 26 h başına TDT düzeylerinde (şekil 2A, 2 C ve film 1) burada sunulmaktadır.
Aslında aynı kültür kurulumu (şekil 1B) kullanarak, peptit PDF başına TDT ifade üzerinde etkisi incelenmiştir. Sigara dolaşıp larva aynı genotip beyinlerinin yukarıda açıklandığı gibi disseke ya ZT1 (Zeitgeiber zaman 1, 1 h sonra ışıklar üzerinde LD) veya ZT13 (1 h ışıkları sonra). Larva içeren şişeleri hemen İnkübatör dışında ele sonra buzda soğutulmuş. ZT13 şişeleri de mavi ışık maruz önlemek için alüminyum folyo sarılı. Beyin diseksiyon buza gerçekleştirilmiş ve disseke beyin buza tutuldu. ZT13 çekilen beyin alüminyum folyo ile mümkün olduğunda kaplıydı. Böylece, her ne kadar bu yordamı ile doğal ışık yaktı laboratuvarda gerçekleştirildi, makromoleküllerin sentez ve metabolizma üzerinde pozlama ışık etkisi en az idi. Beyin temel verileri almak için iki kez 1 saat ara ile tarandı. PDF veya araç (DMSO) kültür ortamına eklendi ve hızlandırılmış görüntüleri izleyen 6 h. başına TDT için her 1s elde ifade profil floresan yoğunluğu, ZT13 LNvs ve DN1s ve daha PDF ek üzerine bir saat bir gün bağlı artış gösterdi bir DN2s üzerinde daha az ölçüde (şekil 3)8.
Bu sonuçlar görüntüleme tekniği ve burada anlatılan kültür yöntemi başına TDT ritimleri fark fototoksisite, photobleaching veya odak kayması olmadan tek hücreli çözünürlükte kayıt etkin gösterir.
Not: Görüntü analiz edildi ve Fiji28kullanarak işlenir. 10 X yinelemeli deconvolution AutoQuant ve Imaris ile gerçekleştirildi. Hızlandırılmış görüntüleri küçük sürüklenir ImageJ doğru 3D drift eklentisi ile düzeltildi.
Şekil 1: L3 larva beyin ve beyin explant kültür Kur saat nöronlarda anatomisi. (A ve B) Şemalar beyin kültür kurulumunun farmakolojik deneyleri ile kısa vadeli görüntüleme (B) ve (A) uzun vadeli görüntüleme için. (A), vakum yağ (sarı) PTFE membran takmak için cam alt çanak plastik parçası üzerinde uygulandı. (C) ZT2 adlı bir LD entrained L3 larva beynin temsilcisi bir görüntü. Moleküler saat muhabir başına TDT (macenta) Clk (856)-gal4tarafından tahrik UAS-mCD8::YFP(green) tarafından etiketlenir saat nöronlar içinde görünür ifadesidir. L3 nöronlarda farklı saat 3 gruplardır: 5 LNvs (PDF ifade değil 5 LNv dahil), 2 DN1s ve 2 DN2s, belirtilen tarafından beyaz ok başları. PER-TDT ifadede saat nöronlar çekirdekleri unutmayın. YFP-negatif başına TDT pozitif glia ve diğer altgrubun hala gelişmekte olan saat nöronların hücrelerdir. Ölçek çubuğu 25 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: uzun vadeli bir temsilcisi sonuçları canlı görüntüleme larva saat nöronların. (A) uzun süreli Hızlandırılmış görüntüleme kültürlü beyin DN2s görünümünden büyütülmüş. Beyin explants ZT11 disseke LD entrained L3 larvaları üzerinden hazırlanmıştır. Görüntüleri her 2 h CT17 alınmıştır (sirkadiyen saat 17, DD içinde öznel ışıkları sonra 5 h): gg birleştirilmiş içinde 64 h için başına-TDT (macenta) ve UAS-mCD8::YFP Clk (856) gal4 - tarafından (yeşil) tahrik görüntülerini her panelin sol tarafta ve PER-TDT düzeyleri gösterilir olarak Mavi gradyan ile heatmap sağ tarafta var. Ölçek çubuğu 10 µm =. Sadece temsil için görüntüleri 3D düzeltme drift ve 10 X yinelemeli deconvolution işlendi. (B) zamanlama deneme. (C) göreli floresan yoğunluğu temsil eden grafik normalleştirilmiş t = 0, iki DN2s (mavi ve kırmızı). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi farmakolojik deneyler için yaşamak-görüntüleme sonuçlarını. Larva beyin LD entrained disseke ve ZT1 veya ZT13 ve PDF monte (2 µM) veya ZT2 veya ZT14 DMSO uygulandığı. Beyin explants başına-TDT ifade her saat tarafından hızlandırılmış mikroskobu takip. (ZT1 veya ZT13 karşılık gelen) görüntüleme başlangıç değerine normalleştirilmiş ortalama Floresans yoğunluğu ± SEM gösterilir. Kırmızı oklar, PDF veya araç uygulama (ZT2 veya ZT14) zaman gösterir. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ve *** p < 0,0001 birden fazla karşılaştırmalar için Sidak'ın düzeltme ile iki yönlü ANOVA tarafından. En az 32 LNvs, 18 DN1s ve 16 DN2s her veri noktası için analiz. Bu rakam başvuru8değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: larva DN2 saat nöronların uzun vadeli canlı görüntüleme. Hızlandırılmış film kültürlü larva beyin ZT11 disseke ve: gg DN2s başına-TDT ve UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 tarafından tahrik ifade tek bir Yarımküre görünümlerini gösterilir Magnified görüntüsü. Her 2 h (macenta) 64 h. başına TDT için görüntüleri elde ve YFP (yeşil) sol tarafta ve PER-TDT düzeyleri bir heatmap (mavi gradyan) temsil sağ tarafta vardır. Ölçek çubuğu 10 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)
| Adımları | Reaktifler | Konsantrasyon |
| 1. mix reaktifler. | KH2PO4 | 4.18 mM |
| CaCl2 | 1,05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0.7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0.7 mg/ml | |
| Glikoz | 2 mg/ml | |
| Trehalose | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric asit | 0.35 mg/ml | |
| Fumarik asit | 60 μg/ml | |
| Malik asit | 0.6 mg/ml | |
| Süksinik asit | 60 μg/ml | |
| Maya ekstresi | 2 mg/ml | |
| FCS sigara ısı inaktive | % 20 | |
| dH2O, autoclaved | ||
| 2. 0,22 mikron filtre ile sterilize. | ||
| 3. hücre kültürü 72 h. kuluçka için karanlıkta 25 ° C'de bakteriyel veya mantar kirlenme yoksun olmak için bir kuluçka makinesine kuluçkaya. | ||
| 4. reaktifler ekleyin. | İnsülin | 2 μg/ml |
| BIS-Tris pH 6.8, sterilize 0,22 mikron filtre ile | 5 mM | |
| 5. pH 6.8-6,9 için ayarlayın. | NaOH (10 N) | ~ 8 damla |
| 6. 0,22 mikron filtre ile sterilize. | ||
| 7. aliquot 5 ml flaş dondurma LN2 deposunda-80 ° C'de Whithin 60 gün kullanın. | ||
| Not: Büyük birimler için vakum tarafından filtre en iyi şişe ile sterilize etmek, aksi halde bir şırınga filtre kullanın. Açık aliquots bir kültür Hood. Tek Kişilik Kullanım. | ||
Tablo 1: SAM orta (1 x) hazırlanması Drosophila beyin kültür. Orta kültür beyin explant için. Bir kültür başlıklı orta kuluçka hariç tüm adımları gerçekleştirilmesi gerekiyor.
| Adımları | Reaktifler | Konsantrasyon |
| 1. mix reaktifler. | HEPES-KOH, pH 7.4 | 99 mM |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1.7 mM | |
| KH2PO4 | 2.2 mM | |
| Glikoz | 33 mM | |
| Sükroz | 438 mM | |
| autoclaved dH2O | ||
| 2. ile 0,45 mikron filtre sterilize. | ||
| 3. 4 ° C'de 6 ay için depolama yapar. | ||
| Not: Deneysel kullanım için: 1 X autoclaved dH2O ile seyreltik ve vakum 0,45 mikron filtre en iyi şişe veya filtre şırınga ile sterilize. 4 ° C'de tutmak Açık bir kültür Hood, çoklu kullanım. | ||
Tablo 2: DSS hazırlanması (10 x). Tuzlu çözüm kopyalayabilmek Drosophila beyin için. Bir kültür mahallede hazırlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada biz kültürlü larva beyin uzun vadeli Floresans hızlandırılmış mikroskopi yöntemi nitelendirdi. Beyin explant, floresan yoğunluğu ve sinyal-gürültü oranı gazeteci, zamansal ve mekansal çözünürlüğü, immobilizasyon için yöntem Multipl faktörler, kültür, sağlık gibi bu tür deneyler başarısı bağlıdır ve erişilebilirlik için explant. Bu faktörler dışlayan olabilir. Örneğin, hızlandırılmış sıklığı artan kültür sağlık etkiler ve beyin explant immobilizasyon gaz değişimi engel. Bu nedenle, olayların altında eğitim için mutlu bir ortam (hayır cinas tasarlamak) bulma başarılı bir iletişim kuralı anahtarıdır. Burada açıklanan yöntemi gün saat ölçeğini floresan sirkadiyen gazetecilere ifade izlemek için optimize edilmiştir. Kritik süreçleri değiştirilmemiş ve özenle yürütülen sürece diğer konular Drosophila Nörobiyoloji yılında eğitimi için geçerlidir.
Bu protokol için beyin explants 3D matris oluşturur bir fibrin pıhtısı içinde immobilize. İmmobilizasyon için diğer yöntemleri, Poli-lizin veya kapak cam kaplama laminin gibi olsa da bu larva gelişimi yavaşlatmak29 beyin ve böylece onların fizyolojik sağlamlık tehlikeye atabilir. Doğası gereği, fibrin mükemmel bir matris gevşek yeterli besin beyin explant ulaşmak için izin vermek ve16yaşında cam kapak bu ezici olmadan yakın olmak beyin için yapışkan olduğunu sağlar. Bu avantajları sayesinde fibrin pıhtısı yöntemi çeşitli protokoller için hücre kültürü ve istihdam ve beyin explant kültür14,17,29,30,31,32 ,33,34. Fibrin 3D matris larva beyin kültürü için son birkaç saat bile nispeten kısa süreli deneyler için kullanmanızı öneririz. 3D matris olmadan larva beyin kültür düzensiz sonuçlar (veri) gösterilmez, muhtemelen beyin geliştirmek için gerekli fiziksel destek eksikliği nedeniyle verir.
Explant ve doku hücrelerinde morfolojisi öncesi ve sıkıntı bir iz bulmak için hızlandırılmış görüntüleme sırasında dikkatle gözlemlemek önemlidir. Burada sunulan deneylerde, nöronların sağlam Morfoloji membran bağlı mCD8::YFP ifadesi gösterdi ve PER-TDT sitoplazma ve çekirdeği, beyin explant uygun ve sağlıklı boyunca kaldı gösteren beklendiği gibi algılandı görüntüleme süresi. Sirkadiyen rhythmicity en fazla 72 saat için okudu ama biz nöronlar ve beyin (veri gösterilmez) bütünlüğü bozulan olmadan beyin explants 5 güne kadar kültürlü görülmektedir. Neurites sapık olmak veya patlama nöron hücre gövdesi, bunlar genellikle fototoksisite işaretler ve kolayca mikroskop ayarları adapte tarafından engelledi buna göre. Örneğin, lazer güç iğne deliği boyutu, akıllı kazanç ve algılama penceresi artırırken azaltmayı deneyin. Ancak, genellikle, muhabir floresan yoğunluğu iyi sinyal / gürültü oranı yüksek yoğunluktaki lazer aydınlatma olmadan görüntüleri elde etmek için sınırlayıcı faktördür. Bu nedenle, muhabir, fluorophore ve muhabir kopya sayısını seçimi tasarım canlılığı sorunlarını giderme dikkate ilk şey vardır. (Burada sunulan denemede 4 tdt başına muhabir kopyalarını kullanılmıştır.)
Güvenliği aşılan beyin kültür diğer mucizesi hızlandırılmış görüntüleme ve sıvı beyin explant dışarı hareket sırasında bir Yarımküre patlama vardır. Bu mikro-delikler beyin diseksiyon sırasında neden nedeniyle muhtemeldir. Larva beyne bağlı Imaginal diskleri kaldırma delikler ana kaynağıdır, böylece biz buna karşı tavsiye.
Floresans sirkadiyen canlı görüntüleme bioluminescence görüntüleme üzerinde onun yüksek Uzaysal çözünürlük avantajdır. Buna ek olarak, ritim muhabir ile birlikte hücresel işaretleri kullanma kolaylığı hücre tipi özgüllük analizi kolaylaştırır. Buna karşılık, bioluminescence üstün zamansal çözünürlük ve mükemmel sinyal-gürültü oranı19,20,21vardır. Yine de, genel olarak bioluminescence tarafından yansıma beyin başına Bisiklete binme nöronların sayısı ile yöntem8,19,21aldığınız numarasını göre üstün değil. Çoğu durumda, bizim yöntemi ile tespit floresan gazetecilere ritimlerin bioluminescence19ile gösterildiği gibi (bkz. şekil 2C) saat nöronlar, aynı küme içinde eşitlenir. Floresan ve bioluminescence sirkadiyen görüntüleme8,19,21saat nöron kümeleri arasındaki faz farklar tespit edildi. Bu nedenle, hem metodolojileri eşit sirkadiyen ritim kültürlü beynindeki gözlemleyerek geçerlidir ve Variety ve bioluminescence tercihi çalışmanın amacı göre yapılmalıdır.
Bu yöntemin ana teknik zorluk gömme adımdır. Çünkü protokol confocal görüntüleme hızlı tarama için ters bir mikroskopla çağırır ve beyin dokusu içinde ışık saçılma azaltır Floresans algılama ne zaman özellikle derin dokularında Imaging, beyin explants monte edilmelidir olduğunca yakın cam mümkün. Ayrıca, görüntüleme sonuçları tekrarlanabilirlik z-pozisyonlar nöronların çıkarlarının tutarlılığını bağlıdır. Bu nedenle, yönlendirmek ve beyin her zaman pratik gerektirir aynı şekilde monte önemlidir. Nöronal görüntüye içinde bulunduğu anatomik olarak farklı pozisyonlar kümeleri, farklı beyin explant yönlendirmeyle ayrı deneyler çalıştırmak için gerekli olabilir. Derin doku canlı görüntüleme için iki fotonlu mikroskobu ve hafif levha mikroskobu ile doku kültürü gerektirmeyen alternatif yöntem vardır. İkinci başarıyla görüntü sirkadiyen kalsiyum dynamics canlı Drosophila beyin22,23yılında kullanılmaya başlanmıştır. Ancak, hafif levha mikroskopi confocal mikroskobu daha düşük uzamsal çözünürlük ve böylece uygulama tek hücreli çözünürlükte görüntüleme için bir meydan okuma olarak kalır.
Özet olarak, bu iletişim kuralını larva beyin explants hızlandırılmış resim alma gün bitti flüoresan gazetecilere ve biyolojik ritimler, kantitatif analiz desteği koşullar altında basit kültür sistemi birleştirir. Yukarıda da açıklandığı gibi belirli sınırlamaları rağmen metodoloji görüntü farklı gazetecilere larva ve yetişkin Drosophila beynindeki uyarlanmış ve daha fazla duyarlılık ve Uzaysal çözünürlük artırmak için değiştirilebilir. Örneğin, derin beyinde aksonlar projeksiyonlar bulunan veya veziküler taşıma bizim beyin explant kültür tekniği ile iki fotonlu mikroskobu35birleştirerek tespit olabilir. Söyleniyor, bu canlı-görüntüleme organelleri mitokondri gibi yetişkin beyninde gerçekleştirmek hala mümkün olduğunu, bu iletişim kuralını (veri gösterilmez) kullanan explants. Ayrıca bu iletişim kuralı için banyo uygulama deneysel çözümün varyasyonu farmakolojik deneyleri sundu. Bir "darbe-chase" deneyler el ile ilaç yıkamak için kültür orta yerine veya perfüzyon odası18,36kullanarak gerçekleştirmek için bu iletişim kuralını genişletmek olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu yöntem geliştirme başlangıç aşamasında destek ve Michael Rosbash onun rehberlik için teşekkür ederiz. Bu eser JST PRESTO program tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_149893 ve 31003A_169548), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-311194), Novartis Vakfı tıp Biyomedikal Araştırma (13A39) ve Cenevre Üniversitesi finanse edildi .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
