Syntetisk biologi giver mulighed for manipulation af proteiner med hidtil uset egenskaber ved hjælp af co-translational indsættelse af ikke-kanoniske aminosyrer. Vi præsenteres her, hvordan en spektralt rød-forskudt variant af en normal god landbrugspraksis-type fluorophore med romanen fluorescens spektroskopiske egenskaber, betegnes “guld” fluorescerende proteiner (GdFP), er produceret i E. coli via selektiv pres indarbejdelse (SPI).
Fluorescerende proteiner er grundlæggende instrumenter for biovidenskab, navnlig til fluorescens mikroskopi af levende celler. Mens vildtype og manipuleret varianter af den grønne fluorescerende proteiner fra Aequorea victoria (avGFP) samt homologs fra andre arter allerede dækker store dele af den optiske spektrum, forbliver et spektrale hul i regionen nær-infrarødt for der findes ikke som avGFP-baseret fluorophores. Rød-forskudt fluorescerende proteiner (FP) varianter ville væsentligt udvide toolkit for spektral urtåge af flere molekylære arter, men naturligt forekommende rød-forskudt FPs afledt af koraller eller søanemoner har lavere fluorescens kvanteudbytte og ringere foto-stabilitet i forhold til avGFP varianterne. Yderligere manipulation og eventuel udvidelse af farvelegemes konjugeret system mod far-red spektrale regionen er også begrænset af repertoire af 20 kanoniske aminosyrer ordineret af den genetiske kode. For at overvinde disse begrænsninger, kan syntetisk biologi opnå yderligere spektrale rød-shifting via indsættelse af ikke-kanoniske aminosyrer i den farvelegeme triade. Vi beskriver anvendelsen af SPI til ingeniør avGFP varianter med romanen spektrale egenskaber. Protein udtryk er udført i en tryptophan-auxotrophic E. coli stamme og ved at supplere vækst medier med passende indol prækursorer. Inde i cellerne, er disse prækursorer konverteres til den tilsvarende tryptophan analoger og indarbejdet i proteiner af de ribosomale maskiner som svar på UGG kodon. Udskiftning af Trp-66 i den forbedret “cyan” variant af avGFP (ECFP) af en elektron-donere 4-aminotryptophan resulterer i GdFP byder på en 108 nm Stokes Skift og en maksimal stærkt rød-forskudt emission (574 nm), mens er termodynamisk mere stabile end forgængeren ECFP. Rest-specifikke indarbejdelse af den ikke-kanoniske aminosyre er analyseret af massespektrometri. De spektroskopiske egenskaber af GdFP er karakteriseret ved tidsopløst fluorescens spektroskopi som en af de værdifulde anvendelser af genetisk kodet FPs i biovidenskab.
Siden opdagelsen af den grønne fluorescerende proteiner i vandmand Aequorea victoria (avGFP) i 19621 og den første Heterolog ekspression i 19942 i andre eukaryote celler, er fluorescerende proteiner af familien normal god landbrugspraksis blevet værdifulde værktøjer og mål inden for biovidenskab. Omfattende genetiske og molekylære engineering inkluderet justering af artsspecifikke codon skik, acceleration af folde, forbedret modning, øgede lysstyrke, forebyggelse af oligomerisering og skræddersy spektrale og fotokemiske egenskaber herunder evnen til at reversibelt photoswitch3,4,5,6. Normal god landbrugspraksis skylder sin fluorescens fra sin 4-(p– hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-en (HBDI) farvelegeme. Sidstnævnte er autocatalytically dannet fra den såkaldte farvelegeme triade af aminosyrer (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 i avGFP) efter dannelsen af en yderligere kovalente bånd inden for peptid rygraden under indflydelse af Molekylær ilt7. Den resonantly stabiliseret konjugeret system interagerer dynamisk med sin molekylære miljø, giver mulighed for absorption i det synlige spektrum og karakteristiske grønne fluorescens af disse proteiner.
Inden for den farvelegeme triade er tilstedeværelsen af en aromatisk aminosyre obligatorisk. Standard aminosyre repertoire omfatter dog kun fire aromatiske restkoncentrationer (hans, Phe, Trp og Tyr). Dette begrænser konventionelle mutagenese tilgange for at opnå betydeligt mere rød-forskudt avGFP varianter i forhold til de mest rød-forskudt naturlige FPs DsRed8 fra Discosoma striata coralimorphs eller mKate/mNeptune9 fra søanemone Entacmaea quadricolor. Derfor, den far-red og nær-infrarøde del af den optiske spektrum over 600 nm er sparsomt omfattet af normal god landbrugspraksis varianter. Dette er naturligvis en alvorlig begrænsning for fluorescens mikroskopiske tilgange, der kræver spektral demultiplexing af flere arter, fluorophore på samme tid. For eksempel, lang bølgelængde markører er også nødvendigt at gøre brug af den lave absorption regime af hudvæv mellem 700-1000 nm i indstillinger for dybe væv imaging10.
Fluorescerende proteiner fra avGFP er opdelt i flere klasser baseret på spektroskopiske egenskaber og kemisk karakter af deres lysopfangende11. Med sin treklang Ser-65/Tyr-66/Gly-67, wild-type farvelegeme eksisterer som et afbalancerede blanding mellem formen neutral, phenol (λmax = 395 nm, ε = 21.000 M-1cm-1) og formen anioniske phenolate (λmax = 475 nm, ε = 7,100 M -1cm-1), og emission spektrum udstiller en enkelt peak på 508 nm. Hydroxylgruppe Ser-65 er af afgørende betydning, som det donerer en H-obligation til Glu-222 i farvelegeme nærhed (afstand: 3.7 Å), som fremmer ionisering af denne carboxylat. Klasse jeg er karakteriseret ved en anioniske phenolate farvelegeme, som i EGFP (Phe-64-Leu/Ser-65-Thr; λmax = 488 nm, ε = 35,600 M-1cm-1, λem = 509 nm). På grund af Ser-65-Thr(Ala,Gly) substitution, 395 nm excitation toppen af formen neutral phenol er undertrykt og 470-475 nm toppen af de anioniske phenolate er fem til seks gange forbedret og flyttet til 490 nm. Klasse II består af proteiner med en neutral phenol farvelegeme, som i safir-normal god landbrugspraksis. Her, Thr-203-Ile substitution næsten helt undertrykker 475 nm excitation, forlader kun peak på 399 nm. Da de anioniske farvelegeme ikke kan være korrekt solvated, er sin neutrale form begunstiget. Klasse III omfatter de “gule” fluorescerende varianter (EYFP; Ser-65-Gly/Val-68-leu/ser-72-ALA/thr-203-tyr; Λmax ε = 514 nm, ε = 84, 600 M-1cm-1, λem = 527 nm) med π-stacking samspil af en aromatisk sidekæde og phenolate, som er fremkaldt af Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr) udskiftninger, som fører til op til 20 nm rød-forskudt emission maxima (Thr-203-Tyr). Yderligere substitution (Localisation-69-Lys) resulterer i en anden 1-2 nm rød Skift til 529 nm, den mest rød-forskudt avGFP variant kendt11. Udveksling af phenol for en indol (Tyr-66-Trp) skaber klasse IV, som i den cyan-fluorescerende ECFP (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 nm, ε = 24.800 M-1cm-1, λmax2 = 452 nm, ε = 23,600 M-1cm-1 ; Λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm). Overnatning omfangsrig indol er sandsynligvis aktiveret af andre, kompenserende mutationer. ECFP excitations- og maxima falder inbetween dem af proteiner med neutral eller anioniske lysopfangende. Klasse V proteiner havnen en imidazol i stedet for phenol (Tyr-66-hans), fx., blå-fluorescerende proteiner som EBFP. Klasse VI er produceret af en phenol-til-phenyl exchange favorisere formen neutral farvelegeme udelukkende, som dermed fører til de mest blå-skiftet excitations- og peak positioner (360 nm og 442 nm, henholdsvis).
Klassisk site-directed mutagenese er særligt velegnet til produktion af romanen avGFP farvelegeme varianter af permutation af 65-67 tripeptid og interagerende restkoncentrationer i rammen af de 20 kanoniske aminosyrer. Disse muligheder kan udvides yderligere, når ikke-kanoniske varianter af aromatiske aminosyrer er indført under ribosomale protein syntese12. I princippet er der to måder at opnå dette. Den første strategi er afhængig af underlaget tolerance af protein oversættelse maskiner, især af aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) mod relaterede aminosyre analoger. At opnå dette med høj effektivitet, auxotrophic E. coli udtryk stammer er ansat som er i stand til at syntetisere den tilsvarende naturlige aminosyre. Dette giver mulighed for udskiftning af sidstnævnte ved at tilføje passende ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) eller forstadier dertil næringssubstratet. Denne strategi, også kendt som selektiv pres indarbejdelse (SPI)13,14, gør det muligt for rest-specifikke udskiftninger, hvilket resultere i globale indarbejdelse af ncAA. Den anden strategi bruger stop codon suppressor tRNAer, som er anklaget for ncAA af manipuleret aaRS enzymer. Dette resulterer i readthrough af i-frame stop kodon og tillader lokationsspecifikke ncAA indarbejdelse. Derfor fører denne metode af stop-codon suppression (SCS) til en udvidelse af den genetiske kode15. Via mutagenese placeres en stop codon i target-gen på det ønskede sted. I princippet kan SPI også bruges til at oprette rekombinant peptider og proteiner forsynet med en unik ncAA installation, at sjældne kanoniske aminosyrer som markedsøkonomisk eller Trp er valgt til Ressourceerstatning. Med Trp, SPI tilgange har vist sig at arbejde med et stort udvalg af analoger herunder 4 – F-, 5 – F – og 6-F-Trp, 7-aza-Trp, 4-OH – og 5-OH-Trp, samt 4- og 5-NH2– Trp eller endda β (thienopyrrolyl) alanin derivater16 ,17,18,19,20. SPI kunne således meget fordelagtige for udskiftning af aromatiske aminosyrer af normal god landbrugspraksis lysopfangende af ikke-kanoniske varianter at undersøge muligheden for at yderligere skræddersy spectra og Stokes skift af disse FPs. Med hensyn til alle ændringer i protein sekvens, skal kompatibilitet med FP folde og farvelegeme modning afprøves eksperimentelt.
I dette arbejde udnytte vi klasse IV ECFP21, der bærer i stedet for vildtype avGFP Tyr, en Trp rest i sine farvelegeme triade. Ved hjælp af SPI, er denne Trp-66 (og Trp-57, kun andre Trp rester i ECFP) erstattet af 4-amino-Trp. Tilstedeværelsen af den elektron-donere amino gruppe af 4-amino-Trp inden for farvelegeme favoriserer resonans stabilisering af et langt rød-forskudt exciterede tilstand proton overførsel (ESPT) udstyret med en 108 nm Stokes Skift. Denne “guld” fluorescerende proteiner (GdFP) udgør varianten med de største rød skift af fluorescens maksimale (574 nm) blandt alle avGFP-afledte proteiner. Vi beskrive metoden for GdFP protein produktion af SPI og give protokollerne for den obligatoriske analyse af de resulterende modificerede proteiner af masse spektroskopi. Yderligere, viser vi hvordan GdFP kan udnyttes og analyseret i tidsopløst fluorescens spektroskopi tilgange.
For at opnå meget høje ncAA indarbejdelse effektivitetsgevinster, metoden auxotrophy-baseret SPI er baseret på brugen af metabolisk manipuleret værtsceller, som ikke er i stand til at syntetisere det tilsvarende naturlige modstykke til ncAA. For E. colier sådan stammer let tilgængelige. Selv samtidige inddragelse af flere ncAAs i den samme protein er muligt ved hjælp af multiauxotrophic stammer. Rest-specifikke tilstand af udskiftning og de kemiske repertoire at være begrænset til lignende kemiske analoger kan ses som ulemper. Ikke desto mindre kan et stort antal protein varianter produceres som naturlige bakterielle oversættelse apparater tolererer talrige aminosyre analoger. For eksempel, kunne mere end 50 ncAAs blive indarbejdet i proteiner ved hjælp af in vitro- oversættelse, tegner sig for omkring 73% af alle kodon af den genetiske kode til rådighed for omplacering40. Derudover kan SPI også giver mulighed for effektiv flere lokationer mærkning af target protein41. I princippet, SPI metode er ikke begrænset til E. coli, men kan arbejde i alle andre værter og for hver af de kanoniske 20 aminosyrer, forudsat at auxotrophic stammer og definerede dyrkning medier er tilgængelige. For eksempel, er to methionin analoger, azidohomoalanine (Aha) og homopropargylglycine (hypothalamus), kommercielt tilgængelige og anvendes til mærkning af proteiner og proteomes i forskellige organismer. Aha kan derudover produceres intracellulært og efterfølgende indarbejdet i protein42. Denne ncAA er specielt velegnet til bioorthogonal bøjninger såsom Klik kemi som udviklet af Tirrel og kolleger: For eksempel i plante væv fra Arabidopsis thaliana, Bombyx mori larver43, Drosophila celler44, larve zebrafisk45 samt pattedyrceller herunder neuroner46, proteiner kan mærkes med Aha47,48. På samme måde, Trp analoger blev med held indarbejdet i antimikrobielle peptider i Trp-auxotrophic Lactococcus lactis stammer49. SPI er også nyttigt for feltet af Xenobiology50,51, som udforsker alternativer til de grundlæggende kemiske make-up af liv. For eksempel, blev baseret på tidligere værker på E. coli52 og B. subtilis53, en E. coli -stamme udviklet for nylig af en evolutionær strategi med selektiv pres for at udnytte thienopyrrole i stedet for indol, hvilket resulterer i proteom-wide substitution af tryptophan af thienopyrrole-alanin i den genetiske kode54. Generelt, de kanoniske aminosyre Trp, der er kodet af en enkelt triplet (UGG), præsenterer et lovende mål for protein engineering på grund af de rige facetter af indol kemi, som tilbyder mange kemiske variationer. For nylig, og som et alternativ til SPI-baseret iblanding, rapporteret en roman SCS platform i stand til at indarbejde Trp analoger site-specifically i både bakterier og eukaryote værter har været55. Dette udvider yderligere værktøjskasse i vivo ncAA-baseret protein engineering, herunder ændring af spektrale egenskaber.
Foruden brug af auxotrophic udtryk værter kræver SPI-protokollen strenge gæring betingelser, både hvad angår målet udtryk timing og sammensætning af medium for at nå høje ncAA indarbejdelse effektivitet og målet protein udbytte 56. dyrkning er foretaget ved hjælp af kemisk definerede minimal medier, som hovedsagelig indeholder udover store salte kilder til kvælstof (ammoniumsalt) og kulstof (D-glucose), vitaminer og sporstoffer. Selvom det ikke strengt nødvendigt i mangel af yderligere auxotrophies, de resterende aminosyrer (20 –Nielsen, hvis n aminosyrer er at blive erstattet) er ofte føjet til fremme bakterievækst57. Under en indledende vækstfase før induktion af target protein udtryk føjes de n kanoniske aminosyrer erstattes begrænse koncentrationer. Cellulære vækst fortsætter indtil de målrettede essentielle aminosyrer er udtømte, som eksperimentelt angivet ved en stationær OD600. Efterfølgende erstattes næringssubstratet af frisk medium, der mangler forarmet aminosyren og indeholder ncAA i rigelige koncentrationer. For de ribosomale indlemmelse af tryptophan analoger som vist i denne protokol, er en analog indol fodret, som bliver intracellulært konverteres til den tilsvarende tryptophan derivat af tryptophan syntase58. Næste, target protein udtryk er induceret. På dette stadium er cellerne tæt på slutningen af logaritmisk vækst, som en balance mellem cellen total antal og fitness. Da tilstedeværelse og indarbejdelse af den kanoniske amino ville føre til wild-type protein produktion, er det afgørende at sikre, at den essentielle aminosyre er fuldt opbrugt før induktion. Ligeledes er det obligatorisk at undersøge effektiviteten af ncAA indarbejdelse i target proteinet, almindeligvis af massespektrometri. I tilfælde af betydelig tilstedeværelse af den kanoniske aminosyre, dyrkning betingelser skal justeres, fxved at ændre koncentrationen af den væsentlige amino acid(s) for den indledende vækstfase eller varigheden af sidstnævnte. I tilfælde af lav aaRS aktivitet mod ncAA, kan overekspression af endogene enzym eller co udtryk for en anden aaRS, som er mere aktive mod ncAA, være udført59.
Den kanoniske aminosyre Trp er udstyret med tre bemærkelsesværdige funktioner: (i) sin naturlige overflod i proteiner er lav; (ii) dens biofysiske og kemiske egenskaber er enestående (fx., det er normalt den dominerende oprindelsen af den iboende fluorescens af proteiner og peptider), og (iii) det bidrager til en lang række biokemiske samspil og funktioner, herunder Π-stabling, H-bonding og kation-π interaktioner. Alle disse funktioner er radikalt ændret ved Trp → 4-amino-Trp substitution GdFP. Beyond tvivlrådig, design af en “guld” klasse af avGFPs er et bemærkelsesværdigt eksempel for engineering skræddersyede autofluorescent proteiner. Med særskilte spektrale egenskaber, kan blive tunet FPs mod visse spektrale windows via mutagenese og ncAA indarbejdelse. I tilfælde af GdFP opnås dette ved en simpel kemiske udveksling H → NH2 i rammen af indol ring i ECFP farvelegeme treklang. Figur 5 viser virkningerne af ncAA indarbejdelse i farvelegeme. Indførelsen af elektron-donere gruppen med oprindelse fra 4-amino-indol (intracellulært konverteret til 4-amino-Trp) giver mulighed for en bred vifte af mesomeric strukturer, der kan forklare en stabiliseret exciterede tilstand. Hjælp, dens udvidede Stokes Skift og rød-forskudt fluorescens emission skyldes disse forskellige egenskaber af det udvidede konjugerede system. Som rapporteret tidligere, forbedret intramolekylære afgift overførsel inden for GdFP farvelegeme er i sagens natur følsomme pH (figur 4B) og ledsaget af en større ændring i dipolmoment mellem S0 jorden og S1 ophidset tilstand i forhold til ECFP33. Som alternativ elektron-donere grupper, kunne tryptophan analoger forsynet med en indol ring substitueret med hydroxy grupper bruges, som rapporteret i en sammenlignende undersøgelse med model protein barstar41.
Absorption og fluorescens-spektre af GdFP er udvidet i forhold til ECFP og EGFP (figur 3 c og D). Homogen udvidelse af absorption og fluorescens bands er normalt forårsaget af vibrationelle modes i farvelegeme og derudover af kobling af farvelegeme til yderligere vibrationelle tilstande i protein60. Kobling til den lokale protein miljø understøttes af afgifter er lokaliseret på farvelegeme. Som de strukturelle uensartethed af protein fører til lokale variationer af den vibronic spektrum, sådan kobling mellem de vibronic spektre af farvelegeme og resten af proteinet understøttes af afgift virksomhedsflytninger og mesomeric stater som anført i Figur 5. Denne kobling understøtter også den store Stokes Skift og reducerer nødvendigvis kvanteudbytte fluorescens. I forhold til andre rød-forskudt FPs udstiller GdFP endda forbedret protein stabilitet og en lav tendens til sammenlægning33,61,62. Det ikke kun adskiller sig i farve fra andre FP varianter men også udstiller et betydeligt øget thermostability og øget cooperative folde33. Fluorescens intensiteten er mindst 90% bevaret ved opvarmning til 60 ° C, mens ECFP Fluorescens er reduceret til ca. 30%. I proteiner bidrage ofte aromatiske aminosyrer til net af vekselvirkende sidekæder, der almindeligvis har en stabiliserende virkning på proteinets tertiære struktur. avGFP havne sådan en side kæde netværk, som består af farvelegeme selv, som godt som Phe-165, hans-148 og Tyr-145. Disse sidekæder er ikke kun helt stiv i GdFP struktur33, men vigtigst, de danner hydrofobe kontakter med farvelegeme. Det mest fremtrædende roman træk identificeret i GdFP er, at aminated farvelegeme er mere proksimalt for Phe-165. Denne interaktion er en funktion, der er ikke observeret i andre kendte avGFPs. Som de to restprodukter 3.2-4.5 Å apart, kan amino-aromatiske interaktioner findes også. Sammen med undersøgelsesområde-induceret resonans stabilisering af farvelegeme stabilisere disse sandsynligvis denne hydrofobe netværk af aminosyrer i en kooperativ måde. En mere effektiv intramolekylære afgift overførsel kan støttes af disse interaktioner i den eksiterede tilstand i forhold til grundtilstanden af farvelegeme, og det i det mindste delvis tegner sig for 108 nm Stokes Skift33,62 .
I rationelt design af fluorophore egenskaber forventes en stigning i størrelsen af delocalized π-systemet for at resultere i en rød-forskudt excitation bølgelængde. Denne tommelfingerregel er overholdt af rækken af aminosyrer i position 66 fører til neutral lysopfangende: Phe (λmax = 355 nm) < hans (λma x= 386 nm) < Tyr (λmax = 395 nm) < Trp (λmax = 436 nm)63. I naturen, er denne udvidelse af farvelegemes konjugeret system af π-bindinger opnået ved forskellige strategier. For DsRed fra Discosoma striata, er det udvidet med integration af en yderligere aminosyre, således at flytte λmax til 573 nm64. Farvelegeme af asFP595 (λmax = 595 nm) fra Anemonia sulcata blev udvidet med en imino gruppe, udvide sin π-systemet65. Da farvelegeme af GdFP og andre avFPs er af samme størrelse, skal et andet princip medføre en emission bølgelængde i rækken af udvidet DsRed og asFP595 lysopfangende. En dyb Stokes forskydning af 108 nm er tilskrevet forskellige strukturen af GdFP farvelegeme, der afslører en ny photophysical princippet i udformningen af autofluorescent proteiner. Foreløbige beregninger (som rapporteret i 62) har vist, at dipolmoment af ophidset tilstand farvelegeme af GdFP er væsentligt større end i grundtilstand, i modsætning til de respektive værdier af ECFP. Mens dipolmoment af GdFP øger fra ~ 3 D (Debye) i tilstanden S0 til ~ 15 D i S1, ændringen for ECFP farvelegeme var temmelig moderat (fra ~ 4 D til ~ 6 D). Således, den unikke gyldne fluorescens af GdFP er forårsaget af betydelige intramolekylære afgift overførsel inden for farvelegeme, hvilket øger vifte af mulige mesomeric strukturer (Se figur 5), der tillader for resonans stabilisering. Dette reducerer den energi niveau som emission opstår. Som følge af de dybtgående ændringer i dipolmoment ved excitation er intramolekylære afgift adskillelse den vigtigste årsag til ændringer i farvelegeme miljø elektrostatisk potentiale. Matrixen omkringliggende protein justerer til gengæld at ændringer i afgift fordelingen efter farvelegeme excitation. Den efterfølgende strukturelle afslapning sænker energi niveau af den glade farvelegeme, som skifter fluorescens spektret til rød på grund af sin afgift overførsel karakter. Af samme grund, som følge af den store Stokes Skift og forbedret satserne for radiationless processer, fluorescens quantum udbyttet af GdFP er reduceret i forhold til ECFP33.
Høj kvanteudbytte og små Stokes skift af ECFP og EGFP er normalt tilskrives en stiv protein miljø af farvelegeme, hvilket reducerer frihedsgrader og dermed interne konvertering til at favorisere den eksiterede tilstand radiative afslapning 66. derfor den molekylære design af mere stift indkapslet lysopfangende med reduceret kobling til de resterende protein matrix kan tjene som en guide til at producere længere rød-forskudt normal god landbrugspraksis derivater med høj fluorescens kvanteudbytte. Udvidelsen af ordningen med π-elektron og en stiv farvelegeme struktur med svag kobling til protein miljø er derfor for yderligere engineering metoder til at fremstille rød-forskudt autofluorescent proteiner, særdeles ønskeligt. Sådanne ændringer vil også kunne indføres, enten direkte i normal god landbrugspraksis-baserede lysopfangende eller af placering af ønskede ncAAs i farvelegeme nærhed.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfonds (Cluster of Excellence “Unifying begreber i katalyse) T.F. og NB og af Forbundsministeriet for uddannelse og videnskab (BMBF Program”HSP 2020”, TU-WIMIplus projekt SynTUBio) til F.-J.S.
Chemicals | |||
4-aminoindole | Sigma-Aldrich | 525022 | |
acetonitrile | VWR | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
agar-agar | Carl Roth | 5210 | |
ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) | Sigma-Aldrich | 277908 | |
ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth | K029 | |
biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
colloidal silica | Sigma-Aldrich | Ludox HS-40, 420816 | |
Coomassie Brillant Blue R 250 | Carl Roth | 3862 | |
copper sulfate (CuSO4) | Carl Roth | CP86.1 | |
D-glucose | Carl Roth | 6780 | |
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carl Roth | X987 | |
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Carl Roth | P749.1 | |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
formic acid | VWR | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
glycerol | Carl Roth | 3783 | |
imidazole | Carl Roth | X998 | |
indole | Sigma-Aldrich | I3408 | |
iron(II) chloride (FeCl2) | Sigma-Aldrich | 380024 | |
isopropanol | Carl Roth | AE73.1 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Carl Roth | KK36.1 | |
magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth | 8283.2 | |
manganese chloride (MnCl2) | Sigma-Aldrich | 63535 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.3 | |
potassium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.3 | |
potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
RNase A | Carl Roth | 7156 | |
sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | P029 | |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth | T879 | |
sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) | Carl Roth | 0183 | |
thiamine | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) | Carl Roth | 5429 | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich | 857645 | |
tryptone | Carl Roth | 8952 | |
yeast extract | Carl Roth | 2363 | |
zinc chloride (ZnCl2) | Sigma-Aldrich | 229997 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
amino acids | |||
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A8381 | |
L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | A0884 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2128 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
L-glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
L-histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab materials | |||
0.45 µm syringe filter with PVDF membrane | Carl Roth | CCY1.1 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Luer-Lock syringe 5 mL | Carl Roth | EP96.1 | |
dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 | Spectrum Medical Industries | Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198 | |
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA | Macherey Nagel | Protino series, 745410.5 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth | TA19 | |
pQE-80L plasmid vector | Qiagen | no longer available | replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915 |
protein extraction reagent BugBuster | EMB Millipore | 70921-4 | |
round-bottom polystyrene tubes, 14 mL | Fisher Scientific | Corning Falcon, 14-959-1B | |
Trp-auxotrophic E. coli strain | ATCC | ATCC 49980 | Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass Spectrometry equipment | |||
mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF | coupled with Infinity LC system |
mass spectrometry data analysis software | Agilent | MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00 | |
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS | Sigma-Aldrich | Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm | |
HPLC autosampler vials 1.5 mL | Sigma-Aldrich | Supelco 854165 | with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
General equipment | |||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 5427 R | |
cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | 5810 R | |
high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption | Microfluidics | LM series with “Z” type chamber | |
peristaltic pump for LC | GE Healthcare | P-1 | |
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system | GE Healthcare | ÄKTA pure 25 L | |
orbital shaker for bacterial cultivation | Infors HT | Minitron | |
UV/Vis spectrophotometer | Biochrom | ULTROSPEC 2100 | |
ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption | Omnilab | Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 | with MS72 sonifier tip |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescence spectroscopy equipment | |||
ps-pulsed laser 470 nm | Picoquant GmbH | PDL-470 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software | Picoquant GmbH | SymPhoTime 64 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector | Picoquant GmbH | PML-16C | 16 spectral channels, to be selected by grating settings |
single photon counting software | Picoquant GmbH | SPCM 9.75 | |
global fitting software | Picoquant GmbH | SPC2Glo(R) | |
fluorescence decay data analysis software | Picoquant GmbH | FluoFit program | |
data analysis software | OriginLab Inc. | Origin 9.2 | |
neutral density filter set | Schott | NG1 to NG11 | (400 – 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %) |
488 nm long-pass emission filter | AHF Analysentechnik | AHF-488 | |
quartz cuvette | Thorlabs GmbH | CV10Q1400 | 1 cm pathlength |