Syntetisk biologi gjør prosjektering av proteiner med enestående egenskaper med co-translational innsetting av ikke-kanoniske aminosyrer. Her, presenterte vi hvordan en spectrally rød-skiftet variant av en GFP-type fluorophore med romanen fluorescens spektroskopiske egenskaper, kalt “gold” fluoriserende protein (GdFP), er produsert i E. coli via seleksjonspress inkorporering (SPI).
Fluorescerende proteiner er grunnleggende verktøy for biovitenskap, spesielt for fluorescens mikroskopi levende celler. Mens vill-type og utviklet varianter av grønne fluorescerende protein fra Aequorea victoria (avGFP) samt homologs fra andre arter allerede dekker store deler av optisk spekteret, fortsatt en spektral gap i nær-infrarøde regionen, for hvilke avGFP-baserte fluorophores er ikke tilgjengelige. Rød-skiftet fluorescerende protein (FP) varianter ville vesentlig utvide et verktøysett for spectral unmixing av flere molekylær arter, men naturlig forekommende rød-skiftet FPs avledet fra koraller eller sjøanemoner har lavere fluorescens quantum avkastning og dårlig bilde-stabilitet sammenlignet med varianter av avGFP. Ytterligere manipulasjon og mulige utvidelsen av chromophore’s konjugert systemet mot langt rødt spectral regionen er også begrenset av repertoaret av 20 kanoniske aminosyrer foreskrevet av den genetiske koden. For å overvinne disse begrensningene, kan syntetisk biologi oppnå ytterligere spectral rød-skiftende via innsetting av ikke-kanoniske aminosyrer chromophore triad. Vi beskriver bruken av SPI til ingeniør avGFP varianter med romanen spektrale egenskapene. Protein uttrykk utføres i en tryptofan-auxotrophic E. coli belastning og supplere vekst medier med egnet indol prekursorer. I cellene, er disse prekursorer konvertert til den tilsvarende tryptofan analogs og innlemmet i proteiner av ribosomal maskineriet svar UGG kodon. Utskifting av Trp-66 i den forbedrede “cyan” varianten av avGFP (ECFP) av et elektron-donere 4-aminotryptophan resulterer i GdFP med et 108 nm Stokes Skift og et sterkt rød-skiftet utslipp maksimal (574 nm), samtidig som thermodynamically mer stabilt enn forgjengeren ECFP. Rest-spesifikke innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyren analyseres av massespektrometri. Spektroskopiske egenskapene til GdFP er preget av tid-løst fluorescens spektroskopi som en av de verdifulle anvendelser av genetisk kodet FPs i biovitenskap.
Siden oppdagelsen av grønne fluorescerende proteinet i maneter Aequorea victoria (avGFP) i 19621 og første heterologous uttrykk i 19942 i andre eukaryotic celler, har fluorescerende proteiner av GFP familien blitt svært verdifulle verktøy og mål i biovitenskap. Omfattende genetiske og molekylære prosjektering inkludert justering av artsspesifikke codon bruk, akselerasjon av folding, forbedret modning, økt lysstyrke, forebygging av oligomerization og skreddersy spectral og fotokjemisk egenskaper inkluderer evnen å reversibel photoswitch3,4,5,6. GFP skylder sin fluorescens fra sin 4-(p– hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-en (HBDI) chromophore. Sistnevnte er autocatalytically dannet fra den såkalte chromophore triaden av aminosyrer (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 i avGFP) etter dannelsen av en ekstra kovalent binding i peptid ryggraden under påvirkning av molekylære oksygen7. Resonantly stabilisert konjugert systemet kommuniserer dynamisk med sin molekylære miljø, slik at absorpsjon i det synlige området og karakteristiske grønne fluorescens av disse proteinene.
Innen chromophore triaden er tilstedeværelsen av en aromatiske aminosyre obligatorisk. Men omfatter standard aminosyre repertoaret bare fire aromatiske rester (hans Phe, Trp og Tyr). Dette begrenser konvensjonelle mutagenese tilnærminger for å oppnå vesentlig mer rød-skiftet avGFP varianter i forhold til mest rød-skiftet naturlig FPs som DsRed8 fra Discosoma striata coralimorphs eller mKate/mNeptune9 fra sjøanemonen Entacmaea quadricolor. Derfor den langt rødt og nær-infrarøde delen av optisk spekteret over 600 nm er tynt dekket av GFP varianter. Dette er selvfølgelig en alvorlig begrensning for fluorescens mikroskopiske tilnærminger som krever spectral demultiplexing av flere fluorophore samtidig. For eksempel lang-bølgelengde markører er også nødvendig for å gjøre bruk av lav absorpsjon regimet av huden vevet mellom 700-1000 nm i innstillingene for dype vev imaging10.
Fluorescerende proteiner fra avGFP er delt i flere klasser basert på spektroskopiske egenskaper og kjemisk natur deres chromophores11. Med sin triaden Ser-65/Tyr-66/Gly-67, vill-type chromophore eksisterer som en equilibrated blanding mellom skjemaet nøytral, fenoliske (λMaks = 395 nm, ε = 21000 M-1cm-1) og anionic phenolate (λMaks = 475 nm, ε = 7,100 M -1cm-1), og utslipp spektrum utstillinger en enkelt peak på 508 nm. Gruppen hydroksyl Ser-65 er av avgjørende betydning, som det donerer et H-bånd til Glu-222 chromophore i nærheten (avstand: 3.7 Å), som fremmer ionisering av denne carboxylate. Klassen jeg er preget av en anionic phenolate chromophore, som EGFP (Phe-64-Leu/Ser-65-Thr; λMaks = 488 nm, ε = 35 600 M-1cm-1, λem = 509 nm). På grunn av Ser-65-Thr(Ala,Gly) substitusjonsbehandling, 395 nm eksitasjon toppen av skjemaet nøytral fenol er undertrykt og 470-475 nm toppen av den anionic phenolate er fem – til six ganger utvidet og flyttet til 490 nm. Klasse II består av proteiner med en nøytral fenoliske chromophore, som safir-GFP. Her Thr-203-Ile substitusjon nesten helt undertrykker 475 nm magnetisering, forlater bare toppen på 399 nm. Siden anionic chromophore ikke kan være riktig solvated, foretrukket sin nøytrale form. Klasse III består av “gul” fluoriserende variantene (EYFP; Ser-65-Gly/Val-68-leu/ser-72-ala/THR-203-Tyr; ΛMaks ε = 514 nm, ε = 84, 600 M-1cm-1, λem = 527 nm) med π-stabling interaksjon en aromatiske side kjede og phenolate, som forårsaket av Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr) erstatninger, som fører til opptil 20 nm rød-skiftet utslipp maxima (Thr-203-Tyr). Ytterligere substitusjonsbehandling (Gln-69-Lys) resultater i en annen 1-2 nm rød Skift til 529 nm, mest rød-skiftet avGFP varianten kjent11. Utveksling av fenol for en indol (Tyr-66-Trp) oppretter klasse IV i cyan-fluorescerende ECFP (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 nm, ε = 24,800 M-1cm-1; λmax2 = 452 nm, ε = 23,600 M-1cm-1 ; Λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm). Innkvarteringen av store indol er sannsynligvis aktivert av andre, kompenserende mutasjoner. ECFP eksitasjon og utslipp maxima faller innimellom de av proteiner med nøytral eller anionic chromophores. Klassen V proteiner havn en imidazole i stedet for fenol (Tyr-66-hans), f.eks., blå-fluorescerende proteiner som EBFP. Klassen VI er produsert av en fenol-til-fenyl utveksling favoriserer skjemaet nøytrale chromophore utelukkende, som dermed fører til de mest blå-forskjøvet eksitasjon og utslipp peak stillingene (360 nm og 442 nm, henholdsvis).
Klassisk område-rettet mutagenese er spesielt egnet for produksjon av romanen avGFP chromophore varianter, ved Permutasjon av 65-67 tripeptide og samspill rester i rammen av 20 kanoniske aminosyrer. Disse mulighetene kan utvides ytterligere når ikke-kanoniske varianter av aromatiske aminosyrer er introdusert under ribosomal protein syntese12. I prinsippet finnes det to måter å oppnå dette. Første strategi er avhengig av underlaget toleranse av protein oversettelse maskiner, spesielt av aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) mot relaterte aminosyre analogs. Å oppnå dette med høy effektivitet, auxotrophic E. coli uttrykket stammer er ansatt som ikke klarer å syntetisere den tilsvarende naturlige aminosyren. Dette tillater utskifting av sistnevnte legge til passende ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) eller forløpere derav til kultur medium. Denne strategien, også kjent som selektiv press inkorporering (SPI)13,14, kan rest-spesifikke erstatninger, som resulterer i globale innlemmelse av ncAA. Den andre bruker stopp codon suppressor tRNAs som belastes med ncAA av konstruert aaRS enzymer. Dette resulterer i readthrough av i-ramme stopp kodon og tillater områdespesifikke ncAA innlemmelse. Derfor fører denne metoden av stopp codon undertrykkelse (SCS) til utvidelse av genetiske koden15. Via mutagenese plasseres en stopp codon i målet genet på ønsket område. I prinsippet kan SPI også brukes til å opprette rekombinant peptider og proteiner bærer en unik ncAA installasjon, gitt at sjeldne kanoniske aminosyrer som Met eller Trp er valgt for ressurserstatting. Med Trp, SPI tilnærminger har vist seg å arbeide med en rekke analogs inkludert 4 – F-, 5 – F – og 6-F-Trp, 7-aza-Trp, 4-OH – og 5-OH-Trp, samt 4- og 5-NH2– Trp eller selv β (thienopyrrolyl) alanin derivater16 ,17,18,19,20. Dermed kan SPI være svært fordelaktig for å erstatte aromatiske aminosyrer av GFP chromophores av ikke-kanoniske varianter å utforske muligheten for å ytterligere tilpasse spectra og Stokes skifte av disse FPs. Som for alle protein sekvens modifikasjoner, må kompatibilitet med FP folding og chromophore modning testes eksperimentelt.
I dette arbeidet bruker vi klasse IV ECFP21, som bærer i stedet for vill-type avGFP Tyr, en Trp rester i sin chromophore triade. Bruker SPI, er denne Trp-66 (og Trp-57, bare andre Trp rester i ECFP) erstattet av 4-amino-Trp. Tilstedeværelsen av elektron-donere amino gruppen av 4-amino-Trp i chromophore favoriserer resonans stabilisering av langt rød-skiftet opphisset tilstand proton transport (ESPT) med et 108 nm Stokes skifte. Denne “gull” fluoriserende protein (GdFP) utgjør varianten med største røde skifte av fluorescens maksimal (574 nm) blant alle avGFP-avledet proteiner. Vi beskriver metoden GdFP protein produksjon av SPI og tilbyr protokollene for obligatorisk analyse av resulterende endret proteiner av masse spectroscopy. Videre, vi viser hvordan GdFP kan brukes og analyseres i tid-løst fluorescens spektroskopi tilnærminger.
For å oppnå høy ncAA innlemmelse effektivitet, avhengig auxotrophy-baserte SPI metoden av bruken av metabolically utviklet vertsceller som ikke kan syntetisere det tilsvarende naturlige motstykket i ncAA. E. colier slike stammer lett tilgjengelig. Selv samtidige inkorporering av flere ncAAs til samme protein er mulig med multiauxotrophic stammer. Rest-spesifikke modus erstatning og kjemiske repertoaret begrenses til lignende kjemisk analogs kan bli sett på som ulemper. Likevel kan et stort antall proteiner varianter produseres som naturlig bakteriell oversettelse apparatet tåler tallrike aminosyre analogs. For eksempel kan mer enn 50 ncAAs bli innlemmet i proteiner bruker i vitro oversettelse, utgjør ca 73% av alle kodon av genetiske koden skal være tilgjengelig for overføring40. Videre kan SPI også tillate effektiv multisite merking av målet protein41. I prinsippet SPI metodikken er ikke begrenset til E. coli, men kan arbeide i en annen vertsmaskin og for hver av de kanoniske 20 aminosyrene, forutsatt at auxotrophic stammer og definerte dyrking medier er tilgjengelige. For eksempel er to metionin analogs, azidohomoalanine (Aha) og homopropargylglycine (Hpg), kommersielt tilgjengelig og brukes for merking proteiner og proteomes i ulike organismer. Aha kan i tillegg produsert intracellulært og deretter innlemmet i protein42. Denne ncAA er spesielt egnet for bioorthogonal conjugations som Klikk kjemi som utviklet av Tirrel og kolleger: eksempelvis i plante vev av Arabidopsis thaliana, i Bombyx mori Larvene43, Drosophila celler44, larver sebrafisk45 samt pattedyrceller inkludert nerveceller46, proteiner kan være merket med Aha47,48. Tilsvarende ble Trp analogs vellykket innlemmet i antimikrobielle peptider i Trp-auxotrophic Lactococcus lactis stammer49. SPI er også nyttig for feltet i Xenobiology50,51, som utforsker alternativer til grunnleggende kjemiske make-up av livet. For eksempel ble basert på tidligere arbeider på E. coli52 og B. subtilis53, en E. coli belastning nylig utviklet av en evolusjonær strategi med seleksjonspress å bruke thienopyrrole i stedet for indol, noe som resulterer i proteom hele substitusjon av tryptofan av thienopyrrole-alanin i den genetiske koden54. Vanligvis presenterer den kanoniske aminosyren Trp, som er kodet av en enkelt triplett (UGG), et lovende mål protein engineering på grunn av de rike fasetter av Indolkjemi, som tilbyr mange kjemiske variasjoner. Nylig, og som et alternativ til SPI-baserte innlemmelse, rapportert en roman SCS plattform i stand til å innlemme Trp analogs site-specifically i både bakteriell og eukaryotic verter har vært55. Dette utvider ytterligere verktøykassen av i vivo ncAA-basert protein engineering, inkludert endring av spektrale egenskapene.
I tillegg til bruk av auxotrophic uttrykk verter krever SPI-protokollen strenge gjæring forhold, både når det gjelder målet uttrykk timing og sammensetningen av medium for å nå høy ncAA innlemmelse effektivitet og målet protein avkastning 56. dyrking er gjennomført med kjemisk definerte minimal media, som i hovedsak inneholder dessuten store salter informasjonskilder nitrogen (ammonium salt) og karbon (D-glukose), vitaminer og sporstoffer. Selv om ikke strengt nødvendig i fravær av ytterligere auxotrophies, de resterende aminosyrene (20 –n, hvis n aminosyrer er byttes) legges vanligvis til fremme bakterievekst57. I en innledende vekst fasen før induksjon av protein måluttrykk legges n kanoniske aminosyrer byttes i begrense konsentrasjoner. Mobilnettet vekst fortsetter til de målrettede essensielle aminosyrene er oppbrukt, som eksperimentelt angitt av en stasjonær OD600. Deretter erstattes kultur medium med frisk medium som mangler utarmet aminosyren og inneholder ncAA i rikelig konsentrasjoner. Ribosomal inkorporering av tryptofan analogs som vist i denne protokollen, matet en indol analoge, som intracellulært blir konvertert til den tilsvarende tryptofan deriverte av tryptofan syntase58. Neste er mål protein uttrykk indusert. På dette stadiet er cellene nær slutten av logaritmisk vekst, som en balanse mellom totalt celle nummer og fitness. Som tilstedeværelse og innlemmelse av de kanoniske amino ville føre til vill-type protein produksjon, er det avgjørende for å sikre at den essensielle aminosyren er helt oppbrukt før induksjon. Likeledes er det obligatorisk å undersøke effektiviteten av ncAA inkorporering målet protein, vanligvis ved massespektrometri. Ved betydelig tilstedeværelse av kanoniske aminosyren dyrking betingelser må justeres, f.eksved å endre konsentrasjonen av den viktige amino acid(s) for første vekstfase eller varigheten av sistnevnte. Ved lav aaRS aktivitet mot ncAA, kan overuttrykte av endogene enzym eller co uttrykk for en annen aaRS, som er mer aktiv mot ncAA, være gjennomført59.
Den kanoniske aminosyren Trp er utstyrt med tre bemerkelsesverdige egenskaper: (i) sin naturlige overflod i proteiner er lav; (ii) Biofysiske og kjemiske egenskaper er unike (f.eks., er det vanligvis dominerende opprinnelsen til den iboende fluorescensen proteiner og peptider), og (iii) det bidrar til en rekke biokjemiske interaksjoner og funksjoner inkludert Π-stabling, H-bånd og kasjon-π interaksjoner. Alle disse funksjonene er radikalt forandret på Trp → 4-amino-Trp substitusjon i GdFP. utover tvil, utformingen av en “gull” klasse av avGFPs er en bemerkelsesverdig eksempel på prosjektering skreddersydde autofluorescent proteiner. Med forskjellige spectral egenskaper stilles FPs mot visse spectral Vinduer via mutagenese og ncAA innlemmelse. Ved GdFP oppnås dette ved en enkel kjemiske utveksling H → NH2 i rammen av indol ringen i ECFP chromophore triad. Figur 5 viser effekten av ncAA innlemmelse i chromophore. Innføring av elektron-å gi gruppen fra 4-amino-indol (intracellulært konvertert til 4-amino-Trp) gjør det mulig for en rekke mesomeric strukturer som kan forklare en stabilisert glade tilstand. Tyske, sin forstørret Stokes Skift og rød-skiftet fluorescens utslipp skyldes disse forskjellige egenskaper av utvidet konjugert. Som rapportert tidligere, forbedret intramolekylære kostnad overføring innen GdFP chromophore er iboende følsom for pH (figur 4B) og ledsages av en større endring i dipol øyeblikk mellom S0 bakken og S1 glade tilstand forhold til ECFP33. Som alternativ elektron-donere grupper, kan tryptofan analogs bærer en indol ring erstattet med hydroxy grupper brukes som rapportert i en komparativ studie med modell protein barstar41.
Absorpsjon og fluorescens spektra av GdFP er utvidet forhold til ECFP og EGFP (Figur 3 c og D). Homogen utvide absorpsjon og fluorescens band er vanligvis forårsaket av vibrasjonsmedisin moduser i chromophore og i tillegg av koblingen av chromophore til ytterligere vibrasjonsmedisin moduser i protein60. Koblingen til lokale protein miljøet støttes av kostnader lokalisert på chromophore. Som den strukturelle inhomogeneity av proteinet fører til lokale varianter av vibronic spekteret, slik kopling mellom de vibronic spektra av chromophore og resten av protein støttes av gratis delocalization og mesomeric stater som indikert i Figur 5. Dette støtter også store Stokes Skift og reduserer nødvendigvis fluorescens quantum avkastningen. I forhold til andre rød-skiftet FPs har GdFP selv forbedret protein stabilitet og en lav tendens til aggregering33,61,62. Det ikke bare varierer i farge fra andre FP varianter, men også har en betydelig økt thermostability og forbedret samarbeidsvillig folding33. Fluorescens intensitet er minst 90% bevart ved oppvarming til 60 ° C, mens ECFP fluorescens er redusert til ca 30%. Proteiner bidra aromatiske aminosyrer ofte til nettverk av samspill siden kjeder, som vanligvis har en stabiliserende effekt på protein’s tertiær struktur. avGFP havner slikt side kjede nettverk, som består av chromophore selv, så vel som Phe-165, hans-148, og Tyr-145. Siden disse kjedene er ikke bare ganske stive GdFP struktur33, men viktigst, de danner hydrofobe kontakter med chromophore. Den mest fremtredende roman trekk i GdFP er at aminated chromophore er mer proksimale til Phe-165. Dette samspillet er en funksjon ikke observert i andre kjente avGFPs. Som to rester er 3,2-4.5 Å hverandre, kan amino-aromatiske interaksjoner finnes også. Sammen med amination-indusert resonans stabilisering av chromophore stabilisere disse sannsynligvis hydrofobe nettverket av aminosyrer i en samarbeidende mote. En mer effektiv intramolekylære kostnad overføring kan være støttet av disse interaksjoner i glade delstaten i forhold til bakken staten i chromophore og det minst delvis utgjør den 108 nm Stokes Skift33,62 .
Rasjonell design av fluorophore egenskaper, er en økning i størrelsen på delocalized π-systemet spådd for å resultere i en rød-skiftet eksitasjon bølgelengde. Denne tommelfingerregelen er følges av serien av aminosyrer i posisjon 66 fører til nøytrale chromophores: Phe (λMaks = 355 nm) < hans (λma x= 386 nm) < Tyr (λMaks = 395 nm) < Trp (λMaks = 436 nm)63. I naturen, har denne forlengelsen av den chromophore konjugert π-obligasjoner blitt oppnådd av ulike strategier. For DsRed fra Discosoma striataforlenget med integrasjonen av en ekstra aminosyre, dermed skiftende λmax til 573 nm64. Chromophore av asFP595 (λMaks = 595 nm) fra Anemonia sulcata ble forlenget med en imino gruppe, forstørre sin π-systemet65. Siden chromophore av GdFP og andre avFPs er av samme størrelse, må en annen prinsipp innebærer et utslipp bølgelengde i området utvidet DsRed og asFP595 chromophores. Dyp Stokes skifte av 108 nm tilskrives forskjellige strukturen til GdFP chromophore, som avslører et nytt photophysical prinsipp i utformingen av autofluorescent proteiner. Foreløpige beregninger (som rapportert i 62) har vist at dipol øyeblikk glade tilstand chromophore på GdFP er betydelig større enn i bakken staten, i motsetning til verdier i ECFP. Mens dipol øyeblikk av GdFP øker fra ~ 3 D (Debye) i den S0 tilstanden til ~ 15 D i S1, endringen for ECFP chromophore var heller moderate (fra ~ 4 D ~ 6 D). Dermed er den unike golden fluorescensen av GdFP forårsaket av betydelig intramolekylære kostnad overføring innen chromophore, som øker variasjonen av mulig mesomeric strukturer (se figur 5) som tillater resonans stabilisering. Dette reduserer energinivået som utslipp oppstår. Av dyptgripende endringen i dipol øyeblikket på eksitasjon er intramolekylære kostnad separasjon den viktigste grunnen for endringene i elektrostatisk potensial i chromophore miljøet. Omkringliggende protein matrise, justerer igjen endringer i distribusjonen etter chromophore eksitasjon. Den følgende strukturelle avslapningen senker energi nivået av det glade chromophore, som skifter fluorescens spekteret til røde på grunn av sin gratis overføring karakter. For samme grunn av den store Stokes Skift og forbedret radiationless prosesser, fluorescens quantum avkastningen av GdFP er redusert sammenlignet med ECFP33.
Høy quantum avkastning og liten Stokes endring av ECFP og EGFP vanligvis tilskrevet en rigid protein miljø av chromophore, noe som reduserer grader av frihet og dermed intern konvertering å favorisere strålingspådriv avslapning i glade delstaten 66. derfor molekylær utformingen av mer strengt innebygde chromophores med redusert kopling til gjenværende protein matrix kan fungere som en guide til å produsere lenger rød-skiftet GFP derivater med høy fluorescens quantum avkastning. Derfor for ytterligere tekniske tilnærminger til å produsere rød-skiftet autofluorescent proteiner, er utvidelse av π-elektron system og en rigid chromophore struktur med svak kobling til protein miljøet svært ettertraktet. Slike endringer kan også bli introdusert enten direkte inn i GFP-basert chromophores eller plasseringen av ønsket ncAAs chromophore i nærheten.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation (Cluster of Excellence “samlende konsepter i katalyse) T.F. og NB og av Federal Utdannings og vitenskap (BMBF Program”HSP 2020”, TU-WIMIplus prosjektet SynTUBio) til F.-js
Chemicals | |||
4-aminoindole | Sigma-Aldrich | 525022 | |
acetonitrile | VWR | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
agar-agar | Carl Roth | 5210 | |
ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) | Sigma-Aldrich | 277908 | |
ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth | K029 | |
biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
colloidal silica | Sigma-Aldrich | Ludox HS-40, 420816 | |
Coomassie Brillant Blue R 250 | Carl Roth | 3862 | |
copper sulfate (CuSO4) | Carl Roth | CP86.1 | |
D-glucose | Carl Roth | 6780 | |
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carl Roth | X987 | |
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Carl Roth | P749.1 | |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
formic acid | VWR | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
glycerol | Carl Roth | 3783 | |
imidazole | Carl Roth | X998 | |
indole | Sigma-Aldrich | I3408 | |
iron(II) chloride (FeCl2) | Sigma-Aldrich | 380024 | |
isopropanol | Carl Roth | AE73.1 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Carl Roth | KK36.1 | |
magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth | 8283.2 | |
manganese chloride (MnCl2) | Sigma-Aldrich | 63535 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.3 | |
potassium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.3 | |
potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
RNase A | Carl Roth | 7156 | |
sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | P029 | |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth | T879 | |
sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) | Carl Roth | 0183 | |
thiamine | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) | Carl Roth | 5429 | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich | 857645 | |
tryptone | Carl Roth | 8952 | |
yeast extract | Carl Roth | 2363 | |
zinc chloride (ZnCl2) | Sigma-Aldrich | 229997 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
amino acids | |||
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A8381 | |
L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | A0884 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2128 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
L-glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
L-histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab materials | |||
0.45 µm syringe filter with PVDF membrane | Carl Roth | CCY1.1 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Luer-Lock syringe 5 mL | Carl Roth | EP96.1 | |
dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 | Spectrum Medical Industries | Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198 | |
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA | Macherey Nagel | Protino series, 745410.5 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth | TA19 | |
pQE-80L plasmid vector | Qiagen | no longer available | replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915 |
protein extraction reagent BugBuster | EMB Millipore | 70921-4 | |
round-bottom polystyrene tubes, 14 mL | Fisher Scientific | Corning Falcon, 14-959-1B | |
Trp-auxotrophic E. coli strain | ATCC | ATCC 49980 | Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass Spectrometry equipment | |||
mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF | coupled with Infinity LC system |
mass spectrometry data analysis software | Agilent | MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00 | |
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS | Sigma-Aldrich | Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm | |
HPLC autosampler vials 1.5 mL | Sigma-Aldrich | Supelco 854165 | with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
General equipment | |||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 5427 R | |
cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | 5810 R | |
high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption | Microfluidics | LM series with “Z” type chamber | |
peristaltic pump for LC | GE Healthcare | P-1 | |
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system | GE Healthcare | ÄKTA pure 25 L | |
orbital shaker for bacterial cultivation | Infors HT | Minitron | |
UV/Vis spectrophotometer | Biochrom | ULTROSPEC 2100 | |
ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption | Omnilab | Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 | with MS72 sonifier tip |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescence spectroscopy equipment | |||
ps-pulsed laser 470 nm | Picoquant GmbH | PDL-470 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software | Picoquant GmbH | SymPhoTime 64 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector | Picoquant GmbH | PML-16C | 16 spectral channels, to be selected by grating settings |
single photon counting software | Picoquant GmbH | SPCM 9.75 | |
global fitting software | Picoquant GmbH | SPC2Glo(R) | |
fluorescence decay data analysis software | Picoquant GmbH | FluoFit program | |
data analysis software | OriginLab Inc. | Origin 9.2 | |
neutral density filter set | Schott | NG1 to NG11 | (400 – 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %) |
488 nm long-pass emission filter | AHF Analysentechnik | AHF-488 | |
quartz cuvette | Thorlabs GmbH | CV10Q1400 | 1 cm pathlength |